巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)研究進展課件

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)研究進展生科院楊軍宿主系統(tǒng)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)表達系統(tǒng)蛋白修飾與分泌系統(tǒng)Content一、前言二、畢赤酵母簡介三、畢赤酵母表達系統(tǒng)四、畢赤酵母表達系統(tǒng)優(yōu)化啟動子選擇外源基因的特性基因劑量mRNA的非翻譯區(qū)翻譯后修飾產(chǎn)物的穩(wěn)定性發(fā)酵條件五、前景展望在過去的數(shù)十年中，遺傳學(xué)家致力于DNA的鑒定和基因重組的研究，而重組有機體主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。由于一些蛋白具有巨大的商業(yè)價值，因此大多數(shù)研究致力于尋找能夠高效生產(chǎn)有功能蛋白的途徑。隨著蛋白質(zhì)工程和DNA重組技術(shù)的發(fā)展，諸多有應(yīng)用潛力的蛋白分子有待開發(fā)，不同在蛋白在不同系統(tǒng)中表達水平有顯著差異，目前應(yīng)用的表達系統(tǒng)包括細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等表達體系。其中酵母表達系統(tǒng)相對于其他表達系統(tǒng)有以下優(yōu)點：不存在原核表達系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以除去的問題，也不存在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的病毒和支原體污染等問題；并能夠?qū)δ康牡鞍走M行類似高等真核生物的信號肽剪切、二硫鍵形成、糖基化等過程的翻譯后蛋白加工。在酵母表達系統(tǒng)中，巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris,Pp)表達外源基因最理想。下面就巴斯德畢赤酵母表達的特點和研究進展作一簡要綜述。前言

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能夠在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長，甲醇能高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達，因此生長迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子、表達的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達序列一般整合入受體的染色體DNA上，因此能夠穩(wěn)定遺傳。目前已有500多種外源蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達。二、巴斯德畢赤酵母簡介Pichiapastoris甲醇代謝途徑目前廣泛應(yīng)用于外源基因表達和研究的畢赤酵母宿主菌有兩種主要類型：營養(yǎng)缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌三、畢赤酵母表達系統(tǒng)宿主系統(tǒng)營養(yǎng)缺陷型：胞內(nèi)表達型載體分泌表達型載體轉(zhuǎn)化程序重組子在酵母細胞中的命運用于轉(zhuǎn)化子篩選的基因標記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)主要有三種方法：原生質(zhì)體法：早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細胞可達原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%；離子溶液法:酵母的完整細胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA。103~104個轉(zhuǎn)化子/μg

DNA；電穿孔法(electroporation)：酵母菌原生質(zhì)體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA。105個轉(zhuǎn)化子/μg

DNA。轉(zhuǎn)化程序?qū)氘叧嘟湍傅闹亟M質(zhì)粒能通過同源重組整合到染色體上，不同的整合方式可產(chǎn)生不同表型的轉(zhuǎn)化子：（1）同源雙交換：表達載體線性化后，兩端分別為5’AOX1和3’AOX1序列，與基因組的同源序列發(fā)生雙交換后，導(dǎo)致畢赤酵母基因組內(nèi)AOX1編碼區(qū)被表達單元所替換，胞內(nèi)醇氧化酶只能來自AOX2基因，酶活性大大降低。因此轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)為甲醇利用緩慢，表型為Muts。重組子在酵母細胞中的命運

（2）特異性的單交換：表達載體在5’AOX1或3’AOX1處線性化后，與染色體基因組中的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組，整合入AOX1基因的上游或下游。由于AOX1基因未被破壞，仍具有活性，所以轉(zhuǎn)化子能正常利用甲醇，表型為Mut+，在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中正常生長。通常有5%-10%轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)多拷貝整合，可用重組子上標記基因（如G418）來篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，斑點雜交來測定外源基因拷貝數(shù)。一般情況下，整合的外源基因表達單元的拷貝數(shù)越多，表達效率越高，可直接通過SDS電泳來測定外源蛋白表達量。此外也可利用同尾酶體外構(gòu)建多拷貝重組子。

若整合發(fā)生在his4位點處，可能出現(xiàn)表達單元丟失現(xiàn)象，這可能是由于基因組中突變的his4與表達單元中的his4基因之間發(fā)生了基因轉(zhuǎn)換（geneconversion）所致，所以一般選擇AOX1位點整合。his4用于轉(zhuǎn)化子篩選的基因標記用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化子篩選的基因標記主要有營養(yǎng)缺陷型互補基因和顯性基因：

營養(yǎng)缺陷型互補基因主要氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：HIS4,ARG4（精氨酸琥珀酸裂合酶）,URA3(尿嘧啶合成酶基因）

顯性標記基因，如Zeocin，Blasticidin（滅瘟素）,G418表達系統(tǒng)信號肽對分泌表達效率的影響畢赤酵母啟動子的可控性常用的啟動子有誘導(dǎo)型和組成型。誘導(dǎo)型啟動子包括：PAOX1、PFLD1、PICL1組成型啟動子：PGAP（1）PAOX1：是由甲醇誘導(dǎo)的強啟動子，也是畢赤酵母表達中使用最廣泛的啟動子，AOX1基因是利用的甲醇的第一個酶基因，它的表達是在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控的。具有以下優(yōu)勢：以甲醇作為唯一碳源時，才能誘導(dǎo)AOX1的表達，因此可嚴密調(diào)控外源蛋白的表達?？梢愿咝П磉_外源蛋白。畢赤酵母啟動子的可控性缺點：甲醇添加時間和添加量不好掌握；甲醇易燃，大量儲存危險性大；甲醇為石油化工原料，因此不適宜生產(chǎn)食用蛋白。

（2）PFLD1：FLD（Formaldehydedehydrogenase）是甲醛脫氫酶基因，是甲醇代謝途徑中的另一關(guān)鍵酶，同時參與甲胺代謝。FLD1基因既可受甲醇誘導(dǎo)，又可以受甲胺誘導(dǎo)。因此它利用甲醇或甲胺誘導(dǎo)PFLD1表達外源蛋白，當(dāng)用甲胺誘導(dǎo)時，葡萄糖或甘油可代替甲醇做為碳源。其嚴格調(diào)控和轉(zhuǎn)錄效率與PAOX1相當(dāng)。Resina等發(fā)現(xiàn)用甲醇和甲胺共誘導(dǎo)PFLD1與單純用甲醇誘導(dǎo)相比，外源蛋白Rhizopusoryzaelipase（稻根霉菌脂肪酶）的表達量有所提高。（3）PICL1：檸檬酸裂合酶啟動子是一種能以甲醇為唯一碳源誘導(dǎo)型啟動子，它能夠在畢赤酵母中高效表達葡聚糖酶。但是，關(guān)于它能否在畢赤酵母中啟動外源蛋白表達及其誘導(dǎo)表達條件，還需要進一步的研究。

（4）PGAP：是一種組成型表達啟動子，不需甲醇，操作簡單，誘導(dǎo)外源蛋白的表達量與PAOX1相當(dāng)。但不適宜表達對畢赤酵母有毒性作用的蛋白。因畢赤酵母只能識別很少的外源蛋白信號序列,所以更多的是利用酵母的同源信號序列,如來自畢赤酵母的酸性磷酸酶信號序列（PHO1)和釀酒酵母的α交配因子前導(dǎo)肽（α-Factorprepropeptide），其中α交配因子前導(dǎo)肽應(yīng)用最廣泛。信號肽對分泌表達效率的影響

α-Factorprepropeptide:來自釀酒酵母，由19個氨基酸殘基的前體序列和66個氨基酸的殘基的前導(dǎo)肽序列組成，其中前導(dǎo)肽序列中含有三個N-糖基化位點和一個Kex2蛋白內(nèi)切酶位點，是目前應(yīng)用最成功的信號肽。信號肽結(jié)構(gòu)的改變可能會提高分泌效率Antonio等發(fā)現(xiàn)，改造了的信號肽大大提高了外源蛋白表達量。用經(jīng)過修飾的人血清白蛋白天然信號肽可使HSA在畢赤酵母中的分泌提高幾倍。Thomas等將編碼10個氨基酸連接肽的序列插入到α-Factor與胰島素前體基因之間，使胰島素前體在畢赤酵母中的表達提高了3倍。作為真核生物，畢赤酵母可以進行類似哺乳動物細胞的蛋白翻譯后修飾，如信號肽加工，蛋白折疊，二硫鍵形成和糖基化修飾等蛋白修飾與分泌系統(tǒng)畢赤酵母中外源糖蛋白的糖基化：酵母菌中的蛋白糖基化修飾有兩個主要步驟，即在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)腔中的寡聚多糖核裝配以及在高爾基體中的糖外鏈延伸。

糖基分為兩種類型：O-糖基和N-糖基。O-寡聚多糖只有甘露糖，但許多高等真核生物的蛋白在相同的糖基化位點上都含有唾液酸基團，而且糖基化位點也存在差異。N-寡聚多糖核與高等真核生物完全相同，但外側(cè)鏈卻有明顯差異。而這種差異往往會導(dǎo)致蛋白生物活性下降、免疫原性增加等不良影響。

線性化重組載體感受態(tài)菌株平板篩選PCR鑒定與篩選MD和MM平板篩選篩選多拷貝外源基因轉(zhuǎn)化子G418表達鑒定與篩選mRNA水平蛋白表達水平高效表達種子工程菌發(fā)酵罐工藝建立Muts和Mut+技術(shù)路線：

根據(jù)啟動子的特性選擇

甲醇誘導(dǎo)型啟動子如PAOX1

，但甲醇易燃，也不適用于食品生產(chǎn)，這時可選擇PGAP,但不宜用于表達對宿主有毒的蛋白。強啟動子可能產(chǎn)生無功能的蛋白

由于超過宿主自身翻譯后修飾加工的能力，引起蛋白的錯折疊、不加工或錯定位。這是可選用較溫和的啟動子如PPEX8(一種過氧化物酶體基質(zhì)蛋白啟動子)。四、畢赤酵母表達系統(tǒng)優(yōu)化啟動子的選擇

目的基因的堿基組成

基因富含A+T，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止

種屬特異性影響

稀有密碼子制約翻譯速率此時需要進行全基因的合成，使編碼序列符合畢赤酵母密碼子的偏愛性和具有更高的G+C含量。目的基因特性

相對劑量效應(yīng)

一般情況下，隨著整合拷貝數(shù)的增加，表達量也會增加，例如，1-8整合拷貝數(shù)范圍內(nèi)，HBsAg表達量成比例升高。但也有例外，如小牛溶菌酶的表達隨著拷貝數(shù)從1-3的上升反而減少，這可能與mRNA翻譯、蛋白折疊效率有關(guān)。

過高表達對分泌途徑抑制

對于分泌蛋白，過高表達會對分泌途徑產(chǎn)生負反饋抑制

基因劑量UTR對蛋白表達的影響主要表面在mRNA的翻譯水平上，目的蛋白mRNA5’UTR應(yīng)盡可能與AOX1mRNA相同。Sreekrishna等通過調(diào)整人血清白蛋白mRNA與AOX1mRNA的5’UTR相同后表達水平提高50倍以上。mRNA5’非翻譯區(qū)畢赤酵母糖蛋白因與哺乳動物糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的差異而具有潛在的抗原性，使其在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用受到一定的制約。它們在哺乳動物體內(nèi)可被免疫系統(tǒng)清除而失去效能，而且有引起超敏反應(yīng)的危險性。解決糖基化策略：嘗試胞內(nèi)表達，避免目的蛋白的糖基化；對非活性中心的糖基化位點進行突變改造，清除糖基化；共表達糖鏈加工酶，使糖鏈結(jié)構(gòu)接近哺乳動物，從而降低抗原性。

翻譯后修飾表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

解決外源蛋白降解的三條基本途徑：在培養(yǎng)基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，增加蛋白酶的底物以減少對目的蛋白的降解；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值抑制蛋白酶活性；使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168、SMD1165等溫度：必須選擇合適的溫度。溫度升高，反應(yīng)速率加大，生長代謝加快，但溫度過高，又會使酶易因熱而失去活性。pH值：畢赤酵母生長的pH值范圍比較寬，因此應(yīng)當(dāng)選擇適宜外源蛋白表達的pH值。溶氧量：甲醇代謝過程中需要消耗大量氧，因此在發(fā)酵過程及時補充畢赤酵母代謝所需要的氧氣對于外源蛋白表達量是至關(guān)重要的。甲醇的濃度和監(jiān)測：在發(fā)酵過程中，需要定期補加一定量的甲醇以補償甲醇的消耗和揮發(fā)。一般液體培養(yǎng)時，補加甲醇的終深度達到0.5%即可。但具體情況需要根據(jù)試驗而定，同時可以根據(jù)溶氧和氣象色譜控制甲醇流加。發(fā)酵條件

近年來，畢赤酵母表達系統(tǒng)應(yīng)用的范圍