癌癥的分子診斷課件

第三章癌癥的分子診斷幾乎癌組織都是單株性增殖(clonalproliferation)患者的所有癌細(xì)胞都起源於單一的癌細(xì)胞大多數(shù)癌癥不能用單基因遺傳方式解釋某些類型的癌癥，親屬發(fā)生同類腫瘤的風(fēng)險會增加，但不表現(xiàn)孟德爾式遺傳許多癌癥與環(huán)境的物理化學(xué)因子或生物因子有關(guān)細(xì)胞週期的調(diào)控受細(xì)胞週期素(cycIin)及相對應(yīng)的細(xì)胞週期素依賴激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)嚴(yán)格調(diào)控細(xì)胞週期的每階段都有一組CDKs與cyclins交互作用來調(diào)控CDK的磷酸化及cyc-lin-CDK抑制劑(CKIs)的活化都會影響細(xì)胞週期癌癥相關(guān)基因致癌基因(oncogene)1911年Rous發(fā)現(xiàn)的雞的腫瘤傳染因子是一種病毒，為反轉(zhuǎn)錄病毒癌化作用是因為病毒基因組內(nèi)特殊致癌基因(v-onc)哺乳類的基因組上，也存在有同源的序列(e-onc)調(diào)控胚胎的發(fā)展、細(xì)胞的增殖、分化和凋亡調(diào)控失常，會使細(xì)胞發(fā)展為惡性表型，正常細(xì)胞中具有這樣潛能的基因稱為原(致)癌基因(proto-oncogene)原(致)癌基因調(diào)控生長分化、信號傳遞、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞週期生長因子病毒來源的sis基因與細(xì)胞來源的原癌基因-血小板衍生性生長因子次單位細(xì)胞表面生長因子受體表皮生長因子受體基因(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)集落刺激因子1受體(CSF1R)基因相當(dāng)，CSF1R是一種促進(jìn)骨髓中多種細(xì)胞分裂的生長因子病毒性癌基因只有少數(shù)人類反轉(zhuǎn)錄病毒引起人類癌癥HIV可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和增加體細(xì)胞突變的機(jī)會，或插入基因組促使鄰近基因活化引起免疫缺陷而間接促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生病毒癌基因插入宿主癌化的原因有些的癌基因產(chǎn)物作用如同細(xì)胞癌基因產(chǎn)物有時插入的病毒癌基因是斷裂的，這些斷裂的序列可能是基因內(nèi)的調(diào)控序列有些病毒癌基因的產(chǎn)物與細(xì)胞癌基因產(chǎn)物共存，可能調(diào)節(jié)癌蛋白活化腫瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)在遺傳學(xué)上，癌基因?qū)?xì)胞的作用是顯性作用(dominanteffect)可抑制oncogene作用的基因，稱tumorsuppressorgene抑癌基因的蛋白產(chǎn)物能抑制細(xì)胞不正常生長及抑制細(xì)胞癌化遺傳學(xué)上一般屬於隱性的(recessive)RB基因視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)，一種侵犯幼兒視網(wǎng)膜的腫瘤散發(fā)性非遺傳的類型最常見，會造成單側(cè)眼睛病變約1/3的RB病人產(chǎn)生多發(fā)性腫瘤，且常造成雙眼的病變，及在同胞兄弟姊妹中可發(fā)生同樣病變，家族傾向遺傳性

RB基因的功能蛋白質(zhì)產(chǎn)物pRb是細(xì)胞週期的煞車器pRb蛋白發(fā)生週期性的磷酸化反應(yīng)pRb蛋白在GI期是細(xì)胞週期抑制信號的集合點，這個以pRb蛋白為中心的抑制傳導(dǎo)途徑，稱為RB傳導(dǎo)途徑靜止的細(xì)胞(G0IG

I)，pRb沒有磷酸化Gl期之末，在有絲分裂時它是磷酸化的非磷酸化的pRb在進(jìn)入S期之前可與幾種蛋白質(zhì)結(jié)合調(diào)控細(xì)胞週期p53基因抑制腫瘤生長的作用，基因定位在17p，p53是其分子量(53kD)在人類的大腸癌中有70%因失去p53功能50%的肺癌、40%的乳癌也因p53去活化而誘發(fā)人類癌癥約有一半起因於p53突變?nèi)毕莼蚴プ饔冒l(fā)生突變的蛋白質(zhì)可能原因兩個alleles都發(fā)生缺失一個allele上發(fā)生錯義點突變，會抑制另一個正常野生型基因的功能正常細(xì)胞中，p53的量都很低DNA損傷時，p53就大量增加，造成生長的停止或細(xì)胞凋亡(apoptosis)p53就激活p21蛋白質(zhì)關(guān)閉細(xì)胞週期p21蛋白質(zhì)是一個CDK的抑制因子可結(jié)合CDK2、CDK4、CDK6，並抑制它們的活性細(xì)胞進(jìn)入S期以前，得以修護(hù)受損傷的DNA若細(xì)胞已將進(jìn)入S期，已不能修護(hù)受損傷的DNA，則p53起動細(xì)胞凋亡這二種功能保持基因組的穩(wěn)定性，p53稱為基因組保護(hù)者(guardianofgenome)細(xì)胞凋亡(apoptosis，programmedcelldeath)基因與癌癥細(xì)胞凋亡是一種有計畫的控制細(xì)胞死亡的方式，Apoptosis此字源自於希臘文，意思是指樹葉從樹上凋落之意正常生理情況下細(xì)胞凋亡是生命過程所必須的，平衡著細(xì)胞的數(shù)量生物發(fā)育的階段高等動物在胚胎發(fā)育過程中的特定階段，特定區(qū)域的多餘細(xì)胞都會發(fā)生凋亡，以利於組織器官形態(tài)的形成病理情況下的凋亡人為的方式改變荷爾蒙分泌後，內(nèi)分泌依賴組織的萎縮組織損傷後血液造成大量自由基所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡細(xì)胞DNA受到物理化學(xué)的因子傷害，也會促使細(xì)胞凋亡在一些病毒感染的情況下，在病毒還未完全被複製時也會使細(xì)胞凋亡，以抑制病毒持續(xù)感染細(xì)胞凋亡機(jī)制在生物中具有高度保留性線蟲已發(fā)現(xiàn)至少15個基因與凋亡有關(guān)ced-3和ced-4促進(jìn)凋亡ced-9則通過阻止ced-3和ced-4的活化而保護(hù)細(xì)胞免於凋亡哺乳動物同源物ced-3vs半胱胺酸蛋白水解酶(cysteineproteases)-caspasesced-9vsBcl-2蛋白家族ced-4vsApaf-l(HeLa細(xì)胞)

caspase蛋白水解酶，能專一性的在天門冬胺酸位置裂解蛋白質(zhì)caspase在正常細(xì)胞中以未活化的酶原存在細(xì)胞接受凋亡訊號後，caspase自身催化或者被其它caspase裂解而活化活化的caspases再繼續(xù)裂解許多細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)維持細(xì)胞骨架的蛋白actin、Gas2、Lamins負(fù)責(zé)DNA修復(fù)的PARP、DNA-PK訊息傳遞蛋白PKC-δ、PITSLREkinase至今約有14種哺乳類動物的caspases被鑑定出來依據(jù)caspases與細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡時所扮演之角色，可分為Initiator(upstream)caspasesEffector(downstream)caspases當(dāng)受到凋亡刺激時，首先initiatorcaspases(主要為8、9、10)被活化進(jìn)行effectorcaspases的活化主要為caspases-3、6與7，其負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡時受質(zhì)蛋白的水解藉由cytochromec、Apaf-l及caspase-9形成的apoptosome複合體活化caspase-9驅(qū)動caspase放大效應(yīng)細(xì)胞凋亡的異常使不正常細(xì)胞累積，造成了癌癥、發(fā)炎癥及自體免疫性疾病過度的細(xì)胞凋亡在神經(jīng)退化性疾病、AIDS、骨質(zhì)疏鬆癥、心臟病原癌基因(proto-oncogene)和腫瘤抑制基因都參與了apoptosis的調(diào)控MYC原癌基因?qū)?xì)胞增殖及凋亡有雙向調(diào)控MYC與MAX形成複合物會啟動細(xì)胞的增殖或凋亡過程，主要是決定於細(xì)胞的微環(huán)境一些腫瘤抑制基因，如:p53、APC及PTEN藉由誘導(dǎo)凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生，如果這些抑制功能喪失就可能造成腫瘤的生長癌癥有關(guān)的現(xiàn)象染色體不穩(wěn)定性癌化的細(xì)胞中常見到三倍體和單倍體染色體的缺失，還有染色體大片段的重排(插入、重複、缺失、倒轉(zhuǎn)、易位)染色體之間或染色體本身的交互作用，可能也參與了細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控利用FISH相關(guān)技術(shù)偵測染色體不穩(wěn)定性多色螢光FISH(multifluor-FISH)DNA結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定微衛(wèi)星不穩(wěn)定異質(zhì)性丟失腫瘤的發(fā)展過程是多基因多突變多因素累加的效果，突變中獲得不必依賴外在的生長訊號對外在的抗生長訊號不反應(yīng)不會凋亡有能力無限複製有能力產(chǎn)生支持性的血管(血管新生，angiogenesis)具有侵入組織及轉(zhuǎn)移的能力微衛(wèi)星不穩(wěn)定MSI正常組織STR相比較，出現(xiàn)STR重複次數(shù)的增加或減少，得到不一樣的patternMicrosatelliteDNAmarkers廣泛使用在偵測腫瘤初期基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象Maoetal.(1996)，使用microsatelliteanalysis偵測膀胱癌的尿沉澱物，有95%的檢出率DNA片斷異質(zhì)性丟失(lossofheterozygosity、LOH)來自父系或母系的同-區(qū)域的DNA，有多形性的變化(如SNP、STR、VNTR)，但並不改變該區(qū)域基因的功能，稱異質(zhì)性的變化癌化過程喪失此多形性的變化稱之，此位置常是抑癌基因的所在DNA甲基化與癌癥人體大約有一半的基因含有CpGislands尤其是持家基因和組織特異性表現(xiàn)的基因與正常細(xì)胞比較，DNA的甲基化在癌細(xì)胞上顯示出甲基化型式的異常腫瘤抑制基因與癌相關(guān)基因CpG島高度甲基化，癌基因及重複序列低度甲基化癌癥的診斷雷射捕獲微切割技術(shù)(Lasercapturemicrodissection，LCM)在腫瘤組織中通常還混有正常的大量的非腫瘤組織(基質(zhì)細(xì)胞、血管組織、免疫反應(yīng)細(xì)胞)這些正常的基因可能模糊了腫瘤異常基因的表現(xiàn)對於癌前組織或早期及無惡性變化的腫瘤相關(guān)組織基因改變情形所知有限LCM技術(shù)對於癌前組織的變化及腫瘤發(fā)生、發(fā)展、演變的過程中提供了樣本的來源1996年由美國NIHLiotta實驗室所發(fā)展將切片表面貼一層ethylene-vinylacetate(EVA)膜切片放在倒置顯微鏡載物臺打開雷射光對準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)，溶掉局部膜，固化可分離到單一類型的細(xì)胞群偵測LOH(Lossofheterozygosity)染色體基因不正常代表著整個片段基因的缺失或獲得這片段可能在腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因區(qū)域p53、APC基因位置的LOH利用毛細(xì)管電泳CE偵測偵測MSI(microstatelliteinstability)也可以說是複製差錯(replicationerror)，導(dǎo)致寡核苷酸重複序列長度的改變使腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定而降低整體細(xì)胞忠實複製DNA的能力MSI與DNA錯配修復(fù)基因息息相關(guān)DNA修補(bǔ)基因雙套突變，LOH或promoter的甲基化，會使基因失去活性而沒有修復(fù)功能)蛋白質(zhì)截短檢測(proteintruncationtest，PTT)檢測蛋白質(zhì)層次上的突變造成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯後縮短蛋白的原因單個鹼基的插入缺失產(chǎn)生一個stopcodon的無意義突變或移框突變(frameshiftmutation)剪接位點的插入缺失造成剪接位點的改變應(yīng)用在沒有突變熱點且錯義突變(單鹼基突變造成胺基酸改變)發(fā)生很低的基因上淋巴瘤的診斷每一個淋巴細(xì)胞在發(fā)育過程中都會經(jīng)歷免疫球蛋白基因Ig或T細(xì)胞受體基因的重排造成成熟的淋巴細(xì)胞各帶有不同的免使球蛋白抗體基因重排多樣化之機(jī)制由利根川進(jìn)解開(1987年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎)V基因的特異5‘端引子及一個J基因片段的特異性3’端引子在非腫瘤中每一個淋巴細(xì)胞都在V-D和D-J插入了任意數(shù)目的鹼基，所以PCR產(chǎn)物在電泳膠上電泳帶是一片模糊(smeared)B細(xì)胞淋巴瘤來自同一株化的淋巴細(xì)胞，有相同的VDJ基因重排，所以有獨立分開的電泳帶基因晶片在癌癥的應(yīng)用人類p53基因位於第17號染色體短臂13區(qū)1帶(17p13.1)上全長為20kb由11個exon和10個intron組成，編碼393胺基酸90%以上的點突變位點發(fā)生在相對保留的第5~8exon上突變熱點集中在密碼子273、175、248、245、249、282等位點上因p53突變位點複雜，Affymetrix公司將p53基因exon5~8可能的突變位點全部點在晶片上，構(gòu)建一個p53GeneChip將腫瘤基因的擴(kuò)增產(chǎn)物利用標(biāo)誌(綠色)與晶片雜交從雜交圖看雜交探針?biāo)霈F(xiàn)螢光信號，最亮點表示所測出的鹼基參照正常野生型這個位點的鹼基，就可知有沒有點的突變微小殘癌的檢測(minimalresidualdisease，MRD)當(dāng)惡性腫瘤經(jīng)過治療後，有時會有殘留的癌細(xì)胞做細(xì)胞FISH的分析，或者使用流式細(xì)胞術(shù)來分析利用外周血液及定量PCR的方法來檢測有明確特異性位點的基因突變或染色體重排偵測血中轉(zhuǎn)移的腺