第11章酶的定向催化課件

Directedenzymeevolution一、自然進(jìn)化與定向進(jìn)化達(dá)爾文在《物種起源》中提出以自然選擇為基礎(chǔ)的進(jìn)化學(xué)說，成為生物學(xué)史上的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。1、自然進(jìn)化

（1）環(huán)境壓力下物種朝著適應(yīng)生存環(huán)境的方向發(fā)展；（2）漫長(zhǎng)時(shí)間里通過DNA復(fù)制發(fā)生突變或通過重組，產(chǎn)生了遺傳多樣性；（3）自發(fā)、非常緩慢、自然選擇；2、定向進(jìn)化在實(shí)驗(yàn)室中模仿自然進(jìn)化的關(guān)鍵步驟（突變、重組和篩選），在較短時(shí)間內(nèi)完成漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化過程，有效改造蛋白質(zhì)，使之適于人類的需要。

人為引發(fā)、較短時(shí)間、人為選擇。3、定向進(jìn)化的一般過程細(xì)菌誘變50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長(zhǎng)溫度為370C4、酶定向進(jìn)化的意義酶作為生物催化劑其專一性和高效性是一般催化劑所不能比擬的，但是天然酶的許多性質(zhì)不適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的條件。選擇特殊環(huán)境，利用酶定向進(jìn)化技術(shù)重新設(shè)計(jì)及改進(jìn)酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以逐步接近和滿足將酶催化用于工業(yè)生產(chǎn)的需要。二、酶分子定向進(jìn)化的歷史在20世紀(jì)60年代利用RNA噬菌體Q進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是第一次在分子水平上定向改造單一分子。SolSpiegelman1、定向進(jìn)化的過程（1）通過隨機(jī)突變和(或)基因體外重組創(chuàng)造基因多樣性；（2）導(dǎo)入適當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫；（3）通過靈敏的篩選方法，選擇陽性突變子。這個(gè)過程可重復(fù)循環(huán)，直至得到預(yù)期性狀的酶。2、多樣性的產(chǎn)生（1）易錯(cuò)PCR(error-pronePCR)通過改變PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增的基因出現(xiàn)少量堿基錯(cuò)配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機(jī)突變?？刂艱NA的突變頻率。不足之處：靶序列長(zhǎng)度一般在0.5-1.0kb，應(yīng)用范圍有限；中性突變較多；且較為耗時(shí)、費(fèi)力獲得的DNA序列中堿基的轉(zhuǎn)換高于顛換。此法突變具有一定的密碼偏向性。四、定向進(jìn)化的策略（2）連續(xù)易錯(cuò)PCR(Sequentialerror-pronePCR)將一次PCR擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。（3）DNA改組技術(shù)(DNAshuffling)又稱有性PCR，指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組。通過改變單個(gè)基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。分子育種。（a)單個(gè)基因的DNA改組從突變體基因庫中分離出來的DNA片段用脫氧核糖核酸酶I隨機(jī)切割得到的隨機(jī)片段經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)。在PCR循環(huán)過程中，隨機(jī)片段之間互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，直到獲得全長(zhǎng)的基因，這導(dǎo)致來自不同基因片段之間的重組。DNA改組與常規(guī)定向進(jìn)化的比較（b)基因家族改組技術(shù)(familyshuffling)(c)DNA改組原理DNaseI

產(chǎn)生隨機(jī)片段；隨機(jī)片段變性；隨機(jī)片段復(fù)性；4.延伸反復(fù)重復(fù)步后，可獲得全長(zhǎng)DNA片段2-4。（d）隨機(jī)引物體外重組法(RPR)單鏈DNA為模板，隨機(jī)序列引物PCR，DNA小片段互為模板擴(kuò)增獲得重新排布的突變基因（e）交錯(cuò)延伸原理采用基因家族的改組效果明顯高于單個(gè)基因的改組效果。特點(diǎn)：改組基因的效率高；提高基因突變機(jī)率。五、基因文庫的構(gòu)建1、構(gòu)建理想的基因文庫要考慮的因素（1）基因文庫的質(zhì)量(a)文庫的代表性（包容性）(b)突變基因片段的序列完整性（2）文庫篩選可選擇的方法控制突變庫的大小與特定的篩選容量相適應(yīng)2、突變體基因的構(gòu)建策略DNA隨機(jī)酶切片段拼接單鏈DNA隨機(jī)拼接（提高不同親代基因的同源片段重組形成嵌合體基因的效率）限制性酶切片段隨機(jī)拼接（防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)生相同的親代基因）3、構(gòu)建突變基因文庫的載體系統(tǒng)（1）噬菌體載體系統(tǒng)；插入片段的裝載容量大，適合于大片段的克?。粯?gòu)建出的基因文庫質(zhì)量高、代表性好；適合長(zhǎng)期保存；主要缺點(diǎn)是構(gòu)建成基因文庫后，可采用的文庫篩選方法有限。（2）質(zhì)粒載體系統(tǒng)載體選擇基因重組組裝突變基因文庫。體外操作簡(jiǎn)便，載體本身的設(shè)計(jì)上有很大可塑性；最大優(yōu)點(diǎn)是能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因文庫的功能性篩選；缺點(diǎn)是插入片段的載體容量較小，含有長(zhǎng)片段的重組克隆在文庫的群體擴(kuò)增過程中容易丟失；轉(zhuǎn)化效率普遍較低；不適合文庫的長(zhǎng)期保存。4、文庫的篩選建立有效的搜索文庫的方法是影響定向進(jìn)化成功與否的關(guān)鍵；采用的定向篩選方法必須靈敏，且應(yīng)與目的性質(zhì)相關(guān)；借助檢測(cè)儀器易實(shí)現(xiàn)高通量篩選。5、定向進(jìn)化的篩選活體篩選法-基于表形觀察的篩選；基于基因編碼蛋白質(zhì)的檢測(cè)篩選表達(dá)文庫；噬菌體顯示法；細(xì)胞表面顯示法（細(xì)菌、纖毛蟲細(xì)胞表面）；篩選方法根據(jù)各個(gè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)而設(shè)計(jì)的，不具有通用性；突變體基因篩選能否成功的關(guān)鍵是將基因的表型和能通過定量表征的篩選手段緊密聯(lián)系；為加快分離目的基因的過程，已建立起多種在基因發(fā)現(xiàn)上具有“高通量”性能的篩選方法。6、高通量篩選技術(shù)（1）突變微生物分離瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過宿主菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合：將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法：細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動(dòng)系統(tǒng)，排成單行，逐個(gè)通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定。（2）酶活力檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物顯色pH指示劑顯色對(duì)硝基苯酚和傘形酮衍生物等顯色底物分光光度計(jì)和熒光酶標(biāo)儀通過檢測(cè)底物消耗或產(chǎn)物生成進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)GC/HPLC，使用較短的柱子以縮短分析時(shí)間同位素標(biāo)記底物質(zhì)譜熱力學(xué)紅外檢測(cè)（3）噬菌體顯示篩選模式噬菌體表面展示技術(shù)是Smith等建立的一種利用大腸桿菌絲狀單DNA噬菌體為載體，在重組噬菌體顆粒表面展示外源多肽分子的展示技術(shù)鏈。

（4）pH指示劑顯色高通量篩選（5）產(chǎn)物顯色篩選巨大芽孢桿菌P450BM-3，最適底物為C12-C18的脂肪酸，對(duì)短鏈烷烴羥化活力較低兩輪易錯(cuò)PCR，最佳突變酶的比活提高了5倍Adv.Synth.Catal.,2001,343:601-606

（6）熒光產(chǎn)物篩選