昆蟲線粒體基因組研究方法課件

昆蟲線粒體基因組研究方法一.昆蟲線粒體基因組的研究意義（一）適合做進化生物學研究。被廣泛用于研究基因組結(jié)構(gòu)和功能、群體遺傳結(jié)構(gòu)，譜系地理學和各種分類學水平上的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。（二）功能基因的研究二.研究方法（一）獲取待研究昆蟲的線粒體基因組（二）對線粒體基因組結(jié)構(gòu)進行分析（三）與其他昆蟲線粒體基因組進行比對（四）進行系統(tǒng)發(fā)育分析具體步驟1.采集標本并冷凍2.提取DNA3.擴增線粒體基因組上的經(jīng)典片段4.設計引物，擴增其他片段5.將所有片段拼接成完整的線粒體組（環(huán)形）6.校對數(shù)據(jù)，利用軟件、比對等方法，標出tRNA、16S、12S及13個蛋白質(zhì)基因的位置，上傳線粒體基因組數(shù)據(jù)至Genbank。7.對tRNA進行結(jié)構(gòu)預測8.對12S及16S進行結(jié)構(gòu)預測9.對該昆蟲線粒體基因組上特殊位置進行討論10.系統(tǒng)發(fā)育分析1.采集標本及冷凍利用高壓汞燈及黑光燈誘集，然后將標本低溫冷凍致死，取一側(cè)后足泡入無水乙醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。標本展翅并保存，以待進一步形態(tài)鑒定。2.DNA提取

總DNA提取試劑盒為德國默克公司QIAGENDNeasyTissuekit。PCR試劑使用TIANGEN天根生化科技有限公司生產(chǎn)的PCRMasterMix。

將浸泡于無水乙醇中的足取出，晾干，分成2-3段，放在1.5ul的離心管中。按照QIAGENDNeasyTissuekit使用手冊的說明進行總DNA提取。抽提的DNA溶于200-300ul的AE緩沖液，并置于在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.將所有片段拼接成完整的線粒體組（環(huán)形）利用軟件DNAstar對擴增好的各個片段進行拼接。用Bioedit軟件查看測序原始峰圖，校對各個堿基。將校對好的數(shù)據(jù)上傳至Genbank。獲取Genbank的accessionnumber。6.尋找tRNA及預測tRNA結(jié)構(gòu)用tRNAscan-SESearchServer在線軟件，尋找tRNA，一次可找出17-19個。其余與其他昆蟲線粒體進行比對找出。用DNAsis預測tRNA結(jié)構(gòu)，對于較為特殊的tRNASer(AGN)，需手工畫出。7.預測12S及16S結(jié)構(gòu)用軟件XRNA進行預測。預測不到的，用手工畫出。8.對特殊結(jié)構(gòu)進行分析討論例：控制區(qū)的結(jié)構(gòu)分析在線軟件MfoldWebServer(Zuker,2003;/?q=m