動物細胞培養(yǎng)的生物學知識課件

細胞工程云南大學生命科學學院林潔主講linjie@組成人及哺乳類動物機體的細胞具有極其復雜的結構和功能，細胞在機體內(nèi)生長時相互依賴、相互制約，在神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)下形成了一種天然的內(nèi)環(huán)境，體外生長時脫離了這些內(nèi)平衡系統(tǒng)，與機體內(nèi)細胞相比不完全相同。細胞體外生長時，有其特有的生長類型、特點、過程和所需的生長條件。第三章

動物細胞培養(yǎng)的生物學知識第一節(jié)體外培養(yǎng)細胞的生長方式及類型第二節(jié)體外培養(yǎng)細胞的生長特點第三節(jié)體外培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程第四節(jié)體外培養(yǎng)細胞的生長條件第五節(jié)體外培養(yǎng)細胞生長的監(jiān)測方法第一節(jié)

體外培養(yǎng)細胞的生長方式和類型體外培養(yǎng)的動物細胞，按照其生長方式可以分為：1.貼壁生長型細胞（貼壁型細胞）2.懸浮生長型細胞（懸浮型細胞）1.貼壁生長型細胞貼壁生長是大多數(shù)由機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式。貼壁有兩種含義：一是細胞之間相互接觸；二是細胞與細胞外基質結合。動物細胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動物細胞必須附著在固體表面生長，當細胞布滿表面后即停止生長，這時若取走一片細胞，存留在表面上的細胞就會沿著表面生長而重新布滿表面。而從生長表面脫落進入液體的細胞通常不再生長而逐漸退化，這種細胞培養(yǎng)稱為單層附壁培養(yǎng)。貼壁生長型細胞的生長一般都經(jīng)歷游離期、吸附期、繁殖期和退化期。貼壁培養(yǎng)的細胞可用以蛋白酶、酸、堿等試劑或機械方法處理，使之從生長表面上脫落下來。1.貼壁生長型細胞在體外，細胞的貼壁方式與體內(nèi)也不相同，體外培養(yǎng)細胞需要附著于某些帶適量正電荷的固體或半固體表面，大多是只附著一個平面，因而體外培養(yǎng)的細胞的外形一般與在體內(nèi)時明顯不同。按照貼壁型細胞的體外培養(yǎng)時的形態(tài)，主要分為四大類：成纖維細胞型細胞上皮型細胞游走型細胞多形型細胞此型細胞具有類似巨噬細胞樣的特征：在支持物上分散生長，一般不連接成片、形成群落；細胞胞質常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運動，速度快且方向不規(guī)則；細胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。表現(xiàn)此類細胞形態(tài)的主要是具有吞噬作用的單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞和腫瘤細胞。游走型細胞此型細胞形態(tài)上不規(guī)則，一般分為胞體和胞突兩部分，其中胞突為細長形，類似絲狀偽足；胞體雖然也略呈多角形，但沒有成纖維細胞那樣不規(guī)則。此類細胞不常見，只有某些神經(jīng)組織細胞等那以確定其穩(wěn)定形態(tài)的才歸入多形細胞。多形型細胞上述四種細胞形態(tài)學形式是細胞體外培養(yǎng)最常見的、也是形態(tài)最明顯的幾種形式，體外培養(yǎng)時所謂的某型細胞，僅是因為其形態(tài)與體內(nèi)的某種細胞類似，而不能將體外培養(yǎng)的這些細胞與體內(nèi)同名的細胞完全等同，同時也不能說明培養(yǎng)細胞的起源。在實際培養(yǎng)中，所培養(yǎng)的細胞并不一定呈現(xiàn)某一種典型的形態(tài)形式，而多呈現(xiàn)的是一些過渡性形態(tài)。體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)學特征受到多種培養(yǎng)條件的影響，因此，細胞形態(tài)學特征僅是對培養(yǎng)物判斷或識別的一種參考性指標，不能用于確定某一培養(yǎng)物的確切細胞類型。重要提示2.懸浮生長型細胞此類細胞在體外生長時可在培養(yǎng)基中懸浮生長，不必貼壁，因此也叫非貼壁型細胞。懸浮培養(yǎng)類似微生物的深層培養(yǎng)。由于是懸浮生長，細胞密度一般都較高，培養(yǎng)的效率也高、操作也容易，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過程的控制；大規(guī)模培養(yǎng)可采用培養(yǎng)微生物細胞用的發(fā)酵罐，但須將其稍加改進，如將攪拌速度減慢，攪拌葉改用螺旋槳式、通氣裝置通過硅橡膠管擴散的方式等。一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細胞，當接種于體外環(huán)境中，也可以以懸浮狀態(tài)生長，這類細胞的胞體始終為球形。還有一些細胞，在體外培養(yǎng)時，即可貼壁生長，也可懸浮生長。第二節(jié)

體外培養(yǎng)細胞的生長特點體外培養(yǎng)細胞重要的生長特點包括：1.貼附與伸展2.運動的接觸抑制和生長的密度抑制1.貼附與伸展貼附并伸展是大多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點，大多數(shù)的哺乳動物細胞在體外均附著于一定的底物而生長。當培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等在體外，細胞貼附的底物可以是其它細胞、膠原、玻璃或塑料等。一些促細胞附著因子（例如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、血清擴展因子、III型膠原等）可以促進細胞與底物的附著。一般來說，從底物脫離下來的貼附生長型細胞，不能長時期在懸浮中生長，除非是一些轉化了的細胞或惡性腫瘤細胞。細胞的貼附與伸展受到離子的作用、機械和物理因素以及生物因素的影響。細胞貼附與伸展的步驟2.運動的接觸抑制與生長的密度抑制接觸抑制是體外培養(yǎng)中多數(shù)貼壁型細胞的生長特性之一。一般情況下，正常細胞在不斷分裂而增殖的過程中存在不停頓的活動或移動，其外周的細胞膜呈現(xiàn)一些特征性皺褶樣活動，但是，當兩個細胞移動而互相靠近時，其中之一或兩個將停止移動并向另一方向離開，這保證了細胞將不會重疊。當貼壁細胞長滿底物時，一個細胞被其他細胞圍繞致無處可去而發(fā)生接觸時，細胞不再移動，在接觸區(qū)域的細胞膜皺褶樣活動將停止，此即接觸抑制。2.運動的接觸抑制與生長的密度抑制一般來說，當細胞生長、匯合形成單層時，細胞變得比較擁擠，扁平形成的程度減小，與培養(yǎng)液接觸的表面積減少；同時培養(yǎng)液中的一些營養(yǎng)物將逐漸消耗掉，尤其是細胞周圍的部位，因此，這種形成的單層細胞，其分裂將停止，單層細胞的密度常與培養(yǎng)液中的血清濃度有關，這種貼壁細胞的體外生長特性被稱為細胞生長的密度抑制（或密度依賴性調(diào)節(jié)）形成密度抑制的單層細胞可在靜止狀態(tài)維持存活一段時間，但不發(fā)生分裂增殖。轉化細胞和惡性腫瘤細胞與正常細胞不同，它們的密度依賴性調(diào)節(jié)常常降低，因而可以生長成較高的終末細胞密度第三節(jié)

體外培養(yǎng)細胞的生長過程體外培養(yǎng)細胞的生長過程包括三個層次的概念：1.細胞生長的全生命過程2.每代細胞的生長過程3.單個細胞的生長過程（細胞周期）1.細胞生長的全生命過程培養(yǎng)的細胞是生長在培養(yǎng)器皿之中的，當細胞持續(xù)生長繁殖一段時間后，到達一定的細胞密度之后，就應當將細胞分離成兩部分或更多部分至新的培養(yǎng)器皿并補充更新培養(yǎng)液，這一過程稱為傳代或再培養(yǎng)。從動物體取出的原代培養(yǎng)的原代細胞，經(jīng)過傳代以后，便成為了細胞系，一般正常細胞的這種細胞系的壽命只能維持一定的時間期限（被稱為有限細胞系），然后將自行停止生長，即使提供足夠的營養(yǎng)，最終仍致死亡，這個完整的過程，被稱為細胞生長的全生命過程，也叫細胞系的生長過程。細胞系在培養(yǎng)中能夠存活時間的長短，主要取決于細胞來自何種動物種族。在一些情況下，培養(yǎng)的條件也會在一定程度上影響細胞系的壽命。1.細胞生長的全生命過程在進行正常細胞培養(yǎng)時，無論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞的全生長過程中大致都要經(jīng)過三個主要階段：原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)期

自體內(nèi)取出在體外培養(yǎng)和第一次傳代的時期，一般約1~4周。與體內(nèi)相應的細胞性狀相似。傳代期

傳代大約數(shù)天至1周左右重復一次，持續(xù)數(shù)月，此期間細胞增殖旺盛。衰退（老）期

反復傳代一定時間后（大概30至50代后），細胞增殖變慢，端粒進行性縮短，直至停止分裂。有的細胞的極少部分后來細胞能夠轉化，獲得永生，成為無限細胞系。細胞系原代細胞經(jīng)第一次傳代后形成的能夠繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)的細胞群體稱為細胞系，一般為有限細胞系。原代培養(yǎng)后得到細胞系，再經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，一部分細胞死亡，一部分細胞繼續(xù)生長并轉化為連續(xù)細胞系或無限細胞系。細胞株從一個經(jīng)生物學鑒定的細胞系經(jīng)過克隆化或其他篩選方法獲得的單一類型的細胞群體被稱為細胞株。重要概念：細胞系與細胞株2.每代細胞的生長過程在體外培養(yǎng)的細胞的生長過程中，當細胞繁殖到一定密度后，將之分開并轉移至新的培養(yǎng)皿中的（稱之為接種），使之繼續(xù)繁殖生長，即為傳代。細胞自接種至新的培養(yǎng)皿中至其下一次再傳代接種的時間稱為細胞的一代，每代細胞的生長過程可分為四個階段：I.滯留期（24~96h）II.指數(shù)生長期（3~5天）III.平臺期（傳代時機）IV.衰亡期第四節(jié)

體外培養(yǎng)細胞的生長條件體外培養(yǎng)的細胞需要合適的生長環(huán)境和必需的條件才能生存、繁殖。1.無污染環(huán)境2.溫度3.pH4.氣體環(huán)境5.滲透壓6.營養(yǎng)7.生長附著物8.抑制物1.無污染環(huán)境在細胞培養(yǎng)過程中，離體細胞對任何毒性物質都非常敏感。因此，培養(yǎng)環(huán)境的無污染是保證細胞生存的首要條件，培養(yǎng)環(huán)境的無污染主要包括：無毒性物質污染、無微生物污染和無其他細胞污染。保證無污染的措施有：所有培養(yǎng)材料、器具要嚴格按照一定程序嚴格清洗，絕對保證無毒和潔凈，使用前必須進行消毒處理；細胞培養(yǎng)過程中所需的氣體、液體，均應去除細菌、病毒和支原體等各類污染物；所有操作過程都必須在潔凈條件下進行。2.溫度維持細胞增殖生長，必須有適宜的溫度。人和哺乳動物培養(yǎng)細胞的標準溫度為36.5℃±0.5℃，若偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡?？偟恼f來，培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力比對高溫強。高溫會使細胞內(nèi)酶失活并破壞細胞膜上的脂類結構，誘導細胞凋亡。溫度不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；超過41℃時，細胞受損；超過43℃時，細胞死亡。低溫會降低細胞內(nèi)酶的活性，對細胞傷害不大；溫度降至冰點以下時，細胞可因胞質結冰受損而死亡。但如果向培養(yǎng)液中加一定量的保護劑（如DMSO、甘油），改變冰晶的性質，裝入凍存管保存于液氮（溫度可達-196℃）中，能長期貯存，細胞解凍復蘇后，仍能繼續(xù)增殖生長，細胞的生物學性狀不受任何影響，這是保存細胞的最主要手段。3.pH合適的pH也是細胞生存的必要條件之一，不同細胞對pH的要求不同，哺乳動物細胞一般為7.2~7.4之間。一般來說，原代細胞對pH變動的耐受差，而傳代細胞或腫瘤細胞對pH變動的耐受較強。當pH超出合適的范圍，如低于6或高于7.6都會對細胞產(chǎn)生不利的影響，嚴重時可導致細胞蛻變或死亡。一般來說，細胞對堿性不如對酸性的變化耐受。為保持培養(yǎng)環(huán)境的適宜的pH條件，可采用的措施：在培養(yǎng)液中加入緩沖劑以穩(wěn)定培養(yǎng)液的pH；在開放式培養(yǎng)環(huán)境中，通入約5%的CO2，平衡培養(yǎng)過程中的CO2流失。4.氣體環(huán)境氣體是細胞生存的必須條件之一，其主要包括O2和CO2。O2參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。不同的細胞和同一細胞的不同生長時期，對氧的需求各不相同。細胞培養(yǎng)環(huán)境中的溶氧要適度，溶氧過低會影響細胞的能力代謝，從而影響細胞的生長；反之，溶氧過高是也會對細胞產(chǎn)生毒性，影響細胞的能量代謝。在動物細胞培養(yǎng)過程中溶解氧一般控制在5%~80%。CO2可以參與調(diào)節(jié)維持培養(yǎng)環(huán)境的pH。5.滲透壓滲透壓對動物細胞也有影響。多數(shù)傳代細胞，對滲透壓有較強的耐受性，而原代細胞和正常二倍體細胞對滲透壓波動則比較敏感。人血漿滲透壓約290mOsm/kg，為體外培養(yǎng)動物細胞的理想滲透壓。不同細胞要求的滲透壓略有不同，對大多數(shù)動物細胞來說，滲透壓在260~320mOsm/kg的范圍內(nèi)是較為適宜的。常用的滲透壓保護劑有：三甲基甘氨酸、脯氨酸和甘氨酸-甜菜堿等。6.營養(yǎng)動物細胞的體外培養(yǎng)對營養(yǎng)的要求較高，往往需要多種營養(yǎng)成分的優(yōu)化組合：氨基酸

所有動物細胞都需要12種基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸）和谷氨酰胺。碳水化合物（糖類）

糖是細胞物質構成碳架的來源，并且能夠為細胞生長代謝提供所需的能量。葡萄糖利用率最高。維生素

是維持細胞生長的生物活性物質，其中煙酰胺、葉酸、核黃素、維生素B12、泛酸、吡哆醇及維生素C是必不可少的。微量元素

細胞體外培養(yǎng)除需鉀、鈉、鈣、鎂、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如鐵、鋅、硒等。生長因子

包括激素類物質和促生長因子，胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、血小板生長因子、內(nèi)皮細胞生長因子、生長調(diào)節(jié)素等。7.附著物除少數(shù)懸浮型細胞外，絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細胞需附著在適宜的附著物上方能生長。原則上講，凡對細胞無毒性的物質都可用作附著物。現(xiàn)今，常用的細胞培養(yǎng)附著物有：玻璃是最常用的附著物，有透明、便于觀察、易洗滌和能反復使用等優(yōu)點，缺點是易破碎。一次性塑料種類很多，常用有聚苯乙烯，具有疏水性，制成的培養(yǎng)瓶皿光潔平坦，且經(jīng)加工處理后其表面帶有電荷，產(chǎn)生疏水性，有利于細胞生長。微載體是由聚苯乙烯、葡聚糖和聚丙烯酰胺制成的直徑為100至300微米的小球體，細胞貼附表面積大，能夠融合貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的特點。8.抑制物當細胞的體外培養(yǎng)時，由于缺乏體內(nèi)的調(diào)節(jié)機制，會造成代謝副產(chǎn)物的積累，從而抑制細胞的功能，最終導致細胞死亡。動物細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的抑制物主要有：乳酸可以螯合鈣離子，抑制谷氨酰胺酶，增加培養(yǎng)液的滲透壓，并使pH下降。氨能穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部，改變微環(huán)境的pH，刺激糖酵解，使葡萄糖消耗率和乳酸生成速率增加，抑制細胞呼吸。CO2

在培養(yǎng)液中過度積累會使pH下降，同時也會對細胞產(chǎn)生毒性作用。第五節(jié)

體外培養(yǎng)細胞的監(jiān)測（常規(guī)性檢查）細胞按種或傳代以后，在生存期間，實驗者每天或至多間隔1-2d，要對細胞做常規(guī)性檢查。隨時掌握細胞動態(tài)變化，以便做換液或傳代處理；如發(fā)現(xiàn)異常情況應及時采取措施。體外培養(yǎng)細胞的常規(guī)性檢查的目的是：考察三個問題污染與否？pH環(huán)境是否適宜？細胞的生長狀態(tài)如何？第四節(jié)

體外培養(yǎng)細胞的監(jiān)測（常規(guī)性檢查）為達到體外培養(yǎng)的常規(guī)性檢查目的，可采用的檢查方法有：1.微生物污染監(jiān)測2.培養(yǎng)液觀察3.細胞形態(tài)觀察4.細胞計數(shù)5.細胞活性檢測1.微生物污染在長時間多量培養(yǎng)工作中，即使用品消毒徹底，操作嚴密，亦難避免偶而發(fā)生污染。污染主要來于培養(yǎng)用液、培養(yǎng)基、血清或操作時由空氣播散所致。最常發(fā)生的是霉菌和細菌污染。霉菌污染易于發(fā)現(xiàn)，如培養(yǎng)液中長出了各種菌落，肉眼可見，不難確認。細菌感染時，有的引起培養(yǎng)液混濁，鏡下可見大量細菌，有的培養(yǎng)液無明顯改變?nèi)鐟岩晌廴?，必要時可向肉湯或瓊脂培養(yǎng)基里滴少量培養(yǎng)物，置37℃溫箱培養(yǎng)數(shù)日，觀察有無菌落形成，以驗證是否污染。經(jīng)常發(fā)生和難以發(fā)現(xiàn)的是支原體污染。PPLO體積小，只有0.25~1m大小，且無細胞壁。PPLO污染后的細胞仍然能生存，甚至無明顯變化，有時導致培養(yǎng)細胞發(fā)生不同程度的病理改變。2.培養(yǎng)液觀察在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。用一般恒溫箱培養(yǎng)時，隨細胞生長時間延長，二氧化碳（CO2）積累增多，在超出緩沖范圍后，營養(yǎng)液酸化變黃，此時如不調(diào)節(jié)pH，對細胞會發(fā)生不利影響，嚴重時細胞脫落死亡。營養(yǎng)液堿化變紅除因瓶口不嚴二氧化碳（CO2）溢出外，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞刷洗不潔，殘留堿性物質所致。更換營養(yǎng)液的時間，可依營養(yǎng)物的消耗而定，細胞生長旺盛時2-3d換一次，生長緩慢時3-4d亦可。3.細胞形態(tài)檢查

生長狀態(tài)良好的細胞在一般顯微鏡下觀察時透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清細胞的細微形態(tài)。細胞機能不良時輪廓增強，胞質中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其它顆粒狀物，細胞之間空隙加大，細胞形態(tài)常變得不規(guī)則和失去原有特點，如上皮細胞會變成纖維細胞等。4.細胞計數(shù)用細胞計數(shù)法測定細胞生長動力學是目前采用的最普遍的方法。常用的技術方法有兩種：用血細胞計數(shù)板人工計數(shù)，是最經(jīng)濟的方法；用細胞計數(shù)器，比較昂貴。血細胞計數(shù)板：有不同的型號，常用的是改良的紐巴氏血細胞計數(shù)板。紐巴氏血細胞計數(shù)板有兩個計算室，各室劃分為9個大格，每個大格的平均面積為1mm2。計算室上方蓋上血細胞計數(shù)板專用的蓋玻片后，室的深度則為1/10mm。在計算室四角的4個大方格又各劃分為16個中方格。計算室中央的一大格，用雙線劃分為25個中方格。每個中方格內(nèi)又劃分為16個小方格。用于血細胞計數(shù)時，白細胞用四角的4個大格，紅細胞用中央的1個大格。用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)的步驟S1[準備計數(shù)板]:用無水酒精或95%酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片將，讓后用綢布輕輕擦拭，并蓋玻片放于計算室上。S2[制備細胞懸液]:用消化液分散單層培養(yǎng)細胞或直接收集懸浮細胞，制成單細胞懸液，一般要求細胞密度不低于104/ml。S3[加樣]:用吸管輕輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側加微量細胞懸液，加樣時不要溢出蓋玻片也不能溢入兩側的玻璃槽內(nèi)，也不要過少或帶氣泡。S4[計數(shù)]:在顯微鏡下，用低倍鏡觀察對焦距找到劃格線區(qū)域。對好焦距進行細胞計數(shù)，計中央大方格內(nèi)的細胞，可依中方格順序計數(shù)中方格內(nèi)的細胞數(shù)，避免計數(shù)重復或漏計。細胞壓線時，只計左側和上方者，不