HPLC指紋圖譜建立的技術(shù)要求

第四節(jié)HPLC指紋圖譜建立的關(guān)鍵技術(shù)要求一、藥材樣品來(lái)源〔中間體和注射劑另有規(guī)定〕應(yīng)固定品種、藥用部位、產(chǎn)地、采收期、產(chǎn)地加工和炮制方法等。供試品的取樣參照?中華人民共和國(guó)藥典?2021年版中規(guī)定的中藥材取樣方法，以保證供試品的代表性和均一性。按1：10取樣。二、供試品制備必須確保中藥材的主要化學(xué)成分在指紋圖譜中的表達(dá)。多種有效組分應(yīng)分別提取制備。三、參照物的制備選擇適宜的對(duì)照品作為參照物，如果沒(méi)有適宜的對(duì)照品，可選擇適宜的內(nèi)標(biāo)物作為參照物。編輯課件四、測(cè)定方法包括測(cè)定方法、儀器、試劑、測(cè)定條件等必須固定。建議優(yōu)先考慮色譜方法。對(duì)于成分復(fù)雜的中藥材可以考慮采用多種測(cè)定方法，建立多張指紋圖譜。注意方法學(xué)考察。1、指紋圖譜第一，指紋圖譜記錄時(shí)間一般為1小時(shí)，但應(yīng)提供2小時(shí)的記錄圖。第二，TLC法必須提供從原點(diǎn)至溶劑前沿的圖譜。第三，對(duì)于化學(xué)成分復(fù)雜，必要時(shí)可建立多張指紋圖譜。2、共有指紋峰的標(biāo)定采用色譜方法制定指紋圖譜，必須根據(jù)參照物的保存時(shí)間，計(jì)算指紋的相對(duì)保存時(shí)間。根據(jù)10批次的檢測(cè)結(jié)果，標(biāo)定中藥材的共有指紋峰。編輯課件3、共有指紋峰面積的比值〔1〕以參照物峰面積作為1〔要求能出現(xiàn)穩(wěn)定的峰〕，計(jì)算各共有指紋峰面積與參照物峰面積的比值〔參照物可以是對(duì)照品也可以是內(nèi)標(biāo)物〕。〔2〕以內(nèi)標(biāo)物作為參照物的指紋圖譜，那么以共有指紋峰中其中一個(gè)峰〔要求面積相對(duì)較大、較為穩(wěn)定的共有峰〕的峰面積作為1，計(jì)算其他各共有指紋峰面積的比值。〔3〕各共有峰的面積比值必須相對(duì)固定?！?〕共有峰面積要求：?jiǎn)畏迕娣e占共有峰總面積20%的共有峰，其差值不得20%；假設(shè)20%面積10%共有峰，其差值不得25%；假設(shè)面積10%的共有峰，峰面積比值不作要求，但必須標(biāo)定相對(duì)保存時(shí)間。未到達(dá)基線別離的共有峰，應(yīng)計(jì)算該組峰的總峰面積作為峰面積，同時(shí)標(biāo)定該組各峰的相對(duì)保存時(shí)間。編輯課件4、非共有峰面積非共有峰總面積不得總面積的10%。5、方法學(xué)考察〔1〕穩(wěn)定性主要考察供試品的穩(wěn)定性。取同一供試品，分別在不同時(shí)間檢測(cè)，考察色譜峰的相對(duì)保存時(shí)間、峰面積的一致性，確定檢測(cè)時(shí)間。〔2〕精密度主要考察儀器的精密度。取同一供試品，連續(xù)進(jìn)樣5次以上，考察色譜峰的相對(duì)保存時(shí)間、峰面積比值的一致性。其峰面積比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD不得大于3%。〔3〕重現(xiàn)性主要考察實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性。取同一批號(hào)的供試品5份以上，按照供試品的制備和檢測(cè)方法制備供試品并進(jìn)行檢測(cè)，考察色譜峰的相對(duì)保存時(shí)間、峰面積比值的一致性。其峰面積比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD不得大于3%。編輯課件6、其他注意問(wèn)題〔1〕樣品定容一般制成樣品的標(biāo)示濃度單位為g/ml或mg/ml。〔2〕放置供試品溶液應(yīng)在避光、低溫、密閉容器條件下保存，一般不超過(guò)兩周，溶液不穩(wěn)定的，一般不超過(guò)48小時(shí)?！?〕有效數(shù)字相對(duì)保存時(shí)間和相對(duì)峰面積的有效數(shù)字要求取小數(shù)點(diǎn)后3位?！?〕留樣注意留樣的數(shù)量不少于實(shí)驗(yàn)實(shí)際用量的3倍。編輯課件〔5〕參照物復(fù)方制劑首選君藥的活性成分或指標(biāo)性成分，盡可能說(shuō)明參照物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)名稱，也可以選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物插入色譜中?！?〕量化的含義是指在定量的操作條件下，所得到的藥材指紋圖譜在整體特征上可以半定量的比較，以表達(dá)原料藥材指紋圖譜在“量〞方面的總體差異程度，以及半成品〔提取物〕和成品之間及成品批間指紋圖譜在“量〞的相對(duì)程度?！?〕相似度軟件2004年SFDA?中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件?，一般成品指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果在0.9-1.0之間為符合要求。編輯課件圖2福建太子參HPLC指紋圖譜圖1福建蓮子HPLC指紋圖譜編輯課件第五節(jié)研究實(shí)例丹參HPLC指紋圖譜構(gòu)建一、藥材來(lái)源〔GAP基地〕與鑒定二、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.1%乙酸〔5：95〕為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫為室溫；流速為1ml/min。編輯課件四、供試溶液的制備40目，10批次，各1g〔精密稱取〕，蒸餾水提取，趁熱過(guò)濾，得提取液100ml，加10%鹽酸調(diào)pH為2，再用乙酸乙酯40ml萃取1次。萃取液濃縮至干，殘?jiān)?ml流動(dòng)相溶解，作為供試品溶液，HPLC分析前用微孔濾膜過(guò)濾。五、測(cè)定分別取各批次藥材供試品10l，注入HPLC儀，記錄1h色譜。供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對(duì)照指紋圖譜有良好的相似性。指紋圖譜應(yīng)有12個(gè)特征峰。編輯課件相對(duì)保存時(shí)間/min〔特征峰序號(hào)〕0.150〔1〕、0.368〔2〕、0.437〔3〕、0.495〔4〕、0.591〔5〕、1.000〔S〕、1.143〔6〕、1.393〔7〕、1.627〔8〕、2.585〔9〕、2.911〔10〕3.968〔11〕。特征指紋峰面積積分相比照值0.152±30%(1)、0.72(2)、0.191±30%(3)、0.297±25%(4)、0.046(5)、1.000(S)、0.059(6)、0.038(7)