生物化學(xué)章合成加工

第十六章RNA的生物合成及轉(zhuǎn)錄后加工RNABiosynthesisandPost-transcriptionprocessingDNA依賴(lài)的RNA合成DNA-dependentRNASynthesis第一節(jié)轉(zhuǎn)錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄RNADNA

復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的比較原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:

DNA酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他因子:Mg2+，Zn2+

等（一）RNA聚合酶能直接啟動(dòng)RNA鏈的合成一、RNA合成由RNA聚合酶催化參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)(NMP)n

+

NTP

(NMP)n+1

+PPi

RNA

延長(zhǎng)的RNARNA聚合酶通過(guò)在RNA的3

-羥基端加入核苷酸延長(zhǎng)RNA鏈，以5

到3

方向合成RNA?？偟姆磻?yīng)可以表示為：DNA依賴(lài)的RNA聚合酶催化RNA的合成機(jī)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的特點(diǎn):RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動(dòng)RNA鏈的延長(zhǎng)。RNA聚合酶和DNA的特殊序列——啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合后，就能啟動(dòng)RNA合成。在RNA合成中會(huì)形成RNA-DNA雜合雙螺旋和轉(zhuǎn)錄泡(transcriptionbubble)的特殊結(jié)構(gòu)。RNA聚合酶向前移動(dòng)時(shí)，DNA雙螺旋伴有拓?fù)鋵W(xué)的結(jié)構(gòu)變化。E.coli的RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過(guò)程轉(zhuǎn)錄過(guò)程中DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)變化轉(zhuǎn)錄過(guò)程中DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)變化轉(zhuǎn)錄中起模板作用的只是兩條互補(bǔ)DNA中的一條稱(chēng)為模板鏈(templatestrand)，與其互補(bǔ)的稱(chēng)為非模板鏈(nontemplatestrand)或編碼鏈(codingstrand)

。5

CGCTATAGCGTTT3

DNA編碼鏈3

GCGATATCGCAAA5

DNA模板鏈5

CGCUAUAGCGUUU3

RNA轉(zhuǎn)錄物DNA模板鏈、編碼鏈和RNA轉(zhuǎn)錄本之間的關(guān)系不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)

在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。腺病毒基因組編碼信息的格局RNA轉(zhuǎn)錄3.6Х104bpDNA原核生物只有1種RNA聚合酶，催化合成mRNA、tRNA和rRNA。真核生物具有3種不同的RNA聚合酶，RNA聚合酶Ⅰ(RNAPolⅠ)、RNA聚合酶Ⅱ(RNAPolⅡ)和RNA聚合酶Ⅲ(RNAPolⅢ)。（二）原核生物有一種而真核生物有3種RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)

（三）RNA聚合酶是多亞基酶大腸桿菌RNA聚合酶

有證據(jù)表明，大腸桿菌RNA聚合酶還有第五個(gè)亞基(ω亞基)存在，其功能不詳。所有真核生物的RNA聚合酶都有幾個(gè)不同的大亞基和十幾個(gè)小亞基釀酒酵母的聚合酶Ⅱ羧基末端結(jié)構(gòu)域

(carboxyl-terminaldomain,CTD)RNA聚合酶Ⅱ最大亞基的羧基末端有一段共有序列為T(mén)yr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser重復(fù)序列片段這一序列在RNA聚合酶Ⅱ中是獨(dú)一無(wú)二的。所有真核生物的RNA聚合酶Ⅱ都具有CTD，只是共有序列的重復(fù)程度不同。去磷酸化的CTD在轉(zhuǎn)錄起始中發(fā)揮作用。RNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位，稱(chēng)為啟動(dòng)子(promoter)。二、RNA聚合酶通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子起動(dòng)轉(zhuǎn)錄（一）原核RNA聚合酶的σ亞基能識(shí)別啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動(dòng)子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因3

3

-60富含A和T

UP元件E.coli的RNA聚合酶全酶(具有σ70

亞基)識(shí)別的典型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示意有些原核RNA聚合酶具有與σ70不同的σ亞基，這些RNA聚合酶所識(shí)別啟動(dòng)子的共有序列與含σ70亞基的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子共有序列也不同。例如，識(shí)別和結(jié)合熱休克基因(heat-shockgenes)啟動(dòng)子的RNA聚合酶具有的是σ32(分子質(zhì)量32kD)，而不是σ70；識(shí)別與細(xì)胞移動(dòng)和細(xì)胞化學(xué)趨化(chemotaxis)相關(guān)基因啟動(dòng)子的是σ28；識(shí)別與氮代謝相關(guān)基因啟動(dòng)子的是σ54。因子基因功用-35順序間隔距離-10順序σ70rpoD正常狀態(tài)TTGACA10-18bpTATAATσ32rpoH熱休克CNCTTGAA13-15bpCCCCATNTσ54rpoN氮的利用CTGGNA6bpTTCGAE.coli的不同σ因子識(shí)別不同的共同順序通過(guò)不同的σ亞基，原核細(xì)胞能協(xié)同相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)胞適應(yīng)其所處的環(huán)境。原核生物轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始與延長(zhǎng)1.RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合啟動(dòng)子，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體

(closedtranscriptioncomplex)。2.閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體變成開(kāi)放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體

(opentranscriptioncomplex)。3.轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的構(gòu)象發(fā)生改變，并離開(kāi)啟動(dòng)子。4.當(dāng)RNA聚合酶進(jìn)入延長(zhǎng)階段，σ亞基即與RNA聚合酶解離。

σ

σ

形成閉合啟動(dòng)子復(fù)合體形成開(kāi)放啟動(dòng)子復(fù)合體RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄開(kāi)始啟動(dòng)子清除

轉(zhuǎn)錄延伸5’3’3’5’-35-10+1

E.coli的轉(zhuǎn)錄起始和延長(zhǎng)（二）真核RNA聚合酶Ⅱ催化轉(zhuǎn)錄需要其他蛋白質(zhì)因子真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，RNA-pol與模板的結(jié)合需要一些稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactors)的蛋白質(zhì)

，其起始過(guò)程比原核生物復(fù)雜。真核RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別的啟動(dòng)子共有序列

轉(zhuǎn)錄因子能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱(chēng)為反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactors,TF)。RNA聚合酶Ⅱ催化基因轉(zhuǎn)錄的過(guò)程可分為4個(gè)期：裝配期起始期延長(zhǎng)期終止RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始和延長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)因子蛋白因子亞基數(shù)功能起始階段TBP1特異識(shí)別TATA盒TFⅡA3穩(wěn)定TFⅡB與TBP對(duì)啟動(dòng)子的結(jié)合TFⅡB1結(jié)合TBP,并結(jié)合聚合酶Ⅱ-TFⅡF復(fù)合體TFⅡE2結(jié)合TFⅡH,具有ATP酶和解旋酶的活性TFⅡF2緊密與聚合酶Ⅱ結(jié)合;也與TFⅡB結(jié)合;阻遏聚合酶Ⅱ和非特異的NA序列結(jié)合TFⅡH12有解旋酶的活性活性使DNA解開(kāi)雙鏈;使聚合酶Ⅱ的CTD磷酸化;結(jié)合核苷酸-切除修復(fù)蛋白真核生物的轉(zhuǎn)錄起始真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性，有專(zhuān)一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡBPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-P閉合復(fù)合體組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化真核生物的閉合復(fù)合體的組裝

真核生物的轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)在整個(gè)延長(zhǎng)期，TFⅡF始終與RNA聚合酶Ⅱ相連，并需要延長(zhǎng)因子(elongationfactors)

。一旦RNA合成結(jié)束，轉(zhuǎn)錄即終止。RNA聚合酶Ⅱ去磷酸化，進(jìn)入再循環(huán)，啟動(dòng)另一次轉(zhuǎn)錄。真核RNA聚合酶Ⅱ與通用轉(zhuǎn)錄因子的作用過(guò)程（三）真核RNA聚合酶Ⅰ和聚合酶Ⅲ啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄與聚合酶Ⅱ基本相似RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ也有各自特異的通用轉(zhuǎn)錄因子，識(shí)別各自特異的DNA調(diào)控元件。聚合酶Ⅰ和聚合酶Ⅲ啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄不需ATP，而聚合酶則Ⅱ需要水解ATP。真核生物RNA聚合酶Ⅰ啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄RNA-polⅠ識(shí)別的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)兩個(gè)：人rRNA基因上游調(diào)控元件和核心元件+1-100rRNA前基因上游調(diào)控元件核心元件轉(zhuǎn)錄區(qū)有兩種DNA結(jié)合蛋白能使聚合酶Ⅰ準(zhǔn)確地啟動(dòng)rRNA前體分子基因的轉(zhuǎn)錄，一種叫上游結(jié)合因子(upstreambindingfactor,UBF),UBF先與DNA結(jié)合，結(jié)合的部位是UCE和核心元件的上游部分，再由另一種叫選擇性因子1(selectivityfactor1,SL1)結(jié)合，然后由聚合酶Ⅰ結(jié)合，并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。SL1的一個(gè)亞基就是上面提到的TBP。UBF1SL1PolⅠ真核生物RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄RNA-polⅢ識(shí)別的啟動(dòng)子位于被轉(zhuǎn)錄的序列之中，稱(chēng)為內(nèi)啟動(dòng)子

(internalpromoter)。

tRNA基因的內(nèi)部啟動(dòng)子

tRNA基因AboxBbox5s-rRNA5sRNA基因的內(nèi)部啟動(dòng)子Cbox起點(diǎn)boxAboxBTFⅢCTFⅢCTFⅢBPolⅢtRNA基因轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，先由TFⅢC與A盒和B盒結(jié)合，然后TFⅢC和TFⅢB結(jié)合，后者再結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約30bp處，RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。5SrRNA基因轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，先由另一個(gè)被稱(chēng)為T(mén)FⅢA的蛋白因子與C盒結(jié)合，然后TFⅢC與TFⅢA結(jié)合，再由TFⅢB與TFⅢC結(jié)合，RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

boxAboxcTFⅢATFⅢATFⅢCTFⅢBPolⅢ起點(diǎn)5SrRNA基因轉(zhuǎn)錄tRNA基因轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶缺乏有校讀(proofreading)功能的3’至5’核酸外切酶活性，因此轉(zhuǎn)錄發(fā)生的錯(cuò)誤率比復(fù)制發(fā)生的錯(cuò)誤率高。但一個(gè)基因可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生許多RNA拷貝，而且RNA最終是被降解和替代，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生錯(cuò)誤RNA對(duì)細(xì)胞的影響遠(yuǎn)比復(fù)制產(chǎn)生錯(cuò)誤DNA對(duì)細(xì)胞的影響小。RNA聚合酶缺乏校讀(proofreading)功能三、不同的機(jī)制參與轉(zhuǎn)錄終止（一）ρ(rho)-不依賴(lài)轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在大腸桿菌特異的DNA序列DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來(lái)終止轉(zhuǎn)錄。5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5

TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3

DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)E.coli色氨酸操縱子mRNA轉(zhuǎn)錄物3

端的轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理

使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5

pppG53

35RNA-polATP（二）λ噬菌體和大腸桿菌的一些基因有ρ-依賴(lài)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)富含CA的rut(rhoutilization)元件

真核生物的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制，迄今尚未闡明？RNA的加工RNAProcessing第二節(jié)一、真核mRNA成熟前經(jīng)歷首尾加工和中間剪接（一）mRNA前體在5

-末端加入“帽”結(jié)構(gòu)5

端形成帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppGp—)加帽酶(cappingenzyme)有兩個(gè)亞基，在加帽結(jié)構(gòu)的過(guò)程中，此酶與RNA聚合酶Ⅱ的CTD結(jié)合在一起，一個(gè)亞基的作用是去除新生RNA的5

端核苷酸的γ-磷酸，另一個(gè)亞基的作用是將一個(gè)GTP分子中的GMP部分和新生RNA的5‘端結(jié)合，形成5

-5

三磷酸結(jié)構(gòu)。真核mRNA5

-末端與7

-甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷以5

，5

三磷酸連接鍵相連真核mRNA5

加帽過(guò)程（二）mRNA前體在3

部位特異位點(diǎn)斷裂并聚腺苷酸化3

端加上多聚腺苷酸尾巴[poly（A）tail]5

------AAUAAA-5

------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)5

5

3

3

3加尾AAAAAAA······3mRNA

真核mRNA3

多聚腺苷酸化過(guò)程慢速多聚磷酸化AAUAAAG/UG/UG/UAAAAAAAAAAOHPAPAAAAAAAAAAOHAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHPoly(a)信號(hào)Poly(A)位點(diǎn)CPSFCPSFCPSFCFⅠ,CFⅡ,

CStFCF1CFⅡCStFPAPCStFCFⅡCF1CPSFPAP剪切CPSFOHPPAPCStFATPPPi降解PPABⅡPABⅡ快速多聚磷酸化PABⅡATPPPi真核mRNA3

多聚腺苷酸化過(guò)程真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開(kāi)但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱(chēng)為斷裂基因。CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)（三）mRNA前體通過(guò)剪接去除內(nèi)含子

外顯子(exons)和內(nèi)含子(introns)外顯子在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子隔斷基因的線(xiàn)性表達(dá)而在剪接過(guò)程中被除去的核酸序列。

70608010010095708045809080100808010010060GUA/GAGUCUA/GAC/UA/CAGNCAGG

出現(xiàn)幾率(%)前體RNA5’外顯子5’剪接位點(diǎn)分支點(diǎn)內(nèi)含子3’剪接位點(diǎn)3’外顯子嘧啶富含區(qū)（15b)20-50b內(nèi)含子-外顯子連接部位及內(nèi)含子的特征序列真核mRNA前體剪接機(jī)制內(nèi)含子-外顯子連接部位及內(nèi)含子的特征序列真核mRNA前體剪接機(jī)制大多數(shù)真核生物mRNA前體分子經(jīng)過(guò)加工只能產(chǎn)生一種成熟的mRNA，翻譯成相應(yīng)的一種多肽。有些真核生物mRNA前體能被加工成不同的mRNA，這種真核生物mRNA前體分子具有一個(gè)以上的、加多聚腺苷酸的斷裂和聚腺苷酸化的位點(diǎn)或/和選擇性剪接(alternativesplicing)模式，這是一種真核生物mRNA前體分子產(chǎn)生一種以上mRNA的選擇性加工機(jī)制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物交替加工兩種機(jī)制大鼠降鈣素基因轉(zhuǎn)錄物交替加工二、rRNA和tRNA加工需要核酸酶催化（一）真核rRNA前體加工比原核復(fù)雜細(xì)菌的rRNA前體約有6，500個(gè)核苷酸，這個(gè)30SrRNA前體包含了16S、23S和5SrRNA以及tRNA序列，從rRNA基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)。真核生物的45SrRNA前體約有14，000個(gè)核苷酸，含有18S、28S和5.8SrRNA序列，由rRNA基因編碼，RNA聚合酶Ⅰ催化合成，而5SrRNA則由RNA聚合酶Ⅲ催化合成。細(xì)菌rRNA前體加工1標(biāo)記的位置是RNaseⅢ作用位點(diǎn)2標(biāo)記的位置是RNaseP作用位點(diǎn)3標(biāo)記的位置是RNaseE的作用位點(diǎn)脊椎動(dòng)物rRNA前體加工甲基化和斷裂反應(yīng)都需要小核仁RNA(smallnucleolarRNAs,snoRNAs)參與，snoRNAs和蛋白質(zhì)形成小核仁核糖核蛋白顆粒(smallnucleolarribonucleo-proteinparticles,

snoRNPs)。45SrRNA前體分子合成后很快就與核糖體蛋白和核仁蛋白結(jié)合，形成80S前核糖核蛋白顆粒（pre-ribonucleo-proteinparticles，pre-rRNP），在細(xì)胞核內(nèi)加工過(guò)程中形成一些中間核糖核蛋白顆粒，最后在細(xì)胞漿內(nèi)形成核糖體的大亞基和小亞基。脊椎動(dòng)物rRNA前體加工及形成核糖體過(guò)程（二）原核生物與真核生物tRNA前體加工基本相同RNAaseP、內(nèi)切酶目錄tRNA加工過(guò)程tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶ATPADP目錄堿基修飾（2）還原反應(yīng)如：UD

（3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：Uψ（4）脫氨反應(yīng)如：A

I

如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）目錄tRNA分子化學(xué)修飾產(chǎn)生稀有堿基tRNA前體內(nèi)含子切除四膜蟲(chóng)rRNA的剪接采用自我剪接方式三、RNA催化一些內(nèi)含子的自剪接5

-端核苷酸序列四膜蟲(chóng)rRNA的剪接采用自我剪接方式三、RNA催化一些內(nèi)含子的自剪接自身剪接內(nèi)含子的RNA具有催化功能，是一種核酶(ribozyme)。在其他單細(xì)胞生物體、線(xiàn)粒體、葉綠體的rRNA前體，一些噬菌體的mRNA前體及細(xì)菌tRNA前體也發(fā)現(xiàn)有這類(lèi)自身剪接的內(nèi)含子。按剪接機(jī)制的不同可分為組Ⅰ內(nèi)含子(groupⅠintron)和組Ⅱ內(nèi)含子(groupⅡintron)。組I、組II內(nèi)含子的剪切四、有些mRNA經(jīng)歷編輯加工有些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列與基因初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的序列并不完全對(duì)應(yīng)，mRNA