大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化制作人：李國婧內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心編輯課件實驗原理實驗儀器實驗試劑實驗步驟本卷須知編輯課件實驗原理電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細胞上打孔，因而需用冰冷的超純水屢次洗滌處于對數(shù)生長前期的細胞，以使細胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。轉(zhuǎn)化效率為109～1010轉(zhuǎn)化子/μgDNA。熱激法是利用冰冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)〞，易于攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化效率為106～107轉(zhuǎn)化子/μgDNA。編輯課件實驗儀器1．超凈工作臺2．低溫離心機3．恒溫搖床4．恒溫培養(yǎng)箱5．-70℃冰箱6．制冰機7．移液器50ul、200ul、1000ul編輯課件實驗試劑１．氨芐〔母液50mg/ml，終濃度為50ug/ml〕：2ml母液需氨芐100mg２．CaCl2(終濃度20mM)：需貯液1M、20ml，需CaCl2固體4g３．MgCl2(終濃度80mM)：需貯液1M40ml，需MgCl2固體4g４．甘油：500ml編輯課件實驗步驟CaCl2感受態(tài)細胞的制備實驗步驟電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗步驟編輯課件CaCl2感受態(tài)細胞的制備實驗步驟

1．前夜接種受體菌〔DH5或DH10B〕，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜〔約16小時〕；2．取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時〔250-300rpm〕；3．將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；4．吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；6．棄去上清，參加100l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；8．棄去上清，參加100l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；9．細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑〔15%-20%甘油〕后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆谩玻?0℃〕。編輯課件電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞

實驗步驟

1．前夜接種受體菌〔DH5或DH10B〕，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜；2．取2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6〔約2.5-3小時〕；3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作；4．吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；6．棄去上清，參加1500l冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘8．棄去上清，參加750l冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘10．參加20l冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；11．立即使用或迅速置于-70oC超低溫保存。編輯課件本卷須知1．細菌的生長狀態(tài)：實驗中應(yīng)密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細胞〔一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml〕；2．所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進行；3．經(jīng)CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加，24小時到達最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降〔這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的〕；4．化合物及無機離子的影響：在Ca2+的根底上聯(lián)合其他二價金屬離子〔如Mn2+或Co2+〕、DMSO或復(fù)原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高〔100-1000倍〕；5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其