第三章 細(xì)胞工程

第三章細(xì)胞工程〔cellengineering〕主講人：黃循吟編輯課件一、概述問題：1、什么是細(xì)胞？什么是細(xì)胞工程？2、開展簡史如何？3、細(xì)胞工程的根本技術(shù)是什么？編輯課件1、什么是細(xì)胞？什么是細(xì)胞工程？細(xì)胞：是由細(xì)胞質(zhì)膜包裹著的細(xì)胞質(zhì)和核或核帶組成的，能自我繁殖的結(jié)構(gòu)物，是生物體的根本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，是生命孕育的起點，是生物體的根本組成單位。Cellengineering:根據(jù)生物學(xué)和工程學(xué)的原理，在細(xì)胞水平上定向改造細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，培育具有新性狀的生物個體或細(xì)胞群體，并利用它們?yōu)槿祟惿a(chǎn)各類藥品和其他產(chǎn)品以及提供效勞的技術(shù)體系。編輯課件2、開展簡史如何？1〕1838〔最早〕馬勒，在脊椎動物的腫瘤細(xì)胞中觀察到多核現(xiàn)象2〕1849-1858年科學(xué)家們在肺組織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象。3〕1859年，A.巴里解開了這個謎團，他認(rèn)為“多核現(xiàn)象〞是由“單個細(xì)胞融合〞而成的。4〕到了1907年哈林發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)的方法。使人們能應(yīng)用這種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。5〕1965年哈里斯和奧金斯在前人的根底上在細(xì)胞融合中所做的奉獻。編輯課件6〕直到1960年，英國諾丁漢大學(xué)科金教授創(chuàng)造性地應(yīng)用酶解的方法，才首次成功地從番茄幼苗的根部制備到大量的原生原體。在此根底上，1972年美國的卡爾森等人用NaBO3作為融合的誘導(dǎo)劑，將來自不同種的兩個煙草原生質(zhì)體進行融合，獲得世界上第一個體細(xì)胞雜種植株。此后，分別以凱樂、高國楠和喬默爾曼等為首的三個科學(xué)家小組，從不同方面改進和開展了植物體細(xì)胞融合技術(shù)。目前常用的植物細(xì)胞融合技術(shù)，有高國楠建立的使用化學(xué)融合劑PEG〔聚乙二醇〕的融合技術(shù)〔1974〕，森達和喬默爾曼創(chuàng)立和開展的電融合技術(shù)，以及斯維格〔1978〕將電融合體系培養(yǎng)技術(shù)。近年來，在植物細(xì)胞融合研究方面的突出進展是建立了單對細(xì)胞融合體系培養(yǎng)技術(shù)，并根本上解決了融合細(xì)胞的選擇問題。現(xiàn)在，植物原生質(zhì)體及其應(yīng)用的研究已成為植物細(xì)胞工程中最活潑的研究領(lǐng)域之一。編輯課件3、細(xì)胞工程的根本技術(shù)是什么？細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)：是將生物體的某一局部組織取出一小塊，在體外進行外表消毒處理后，使之分散成單個游離的細(xì)胞，并放置在人工配制的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使之生長分裂的技術(shù)。由于生物體的一種組織，往往包含有兩種以上的細(xì)胞，如葉片組織至少年犯含有葉肉細(xì)胞，維菅束鞘細(xì)胞和表皮細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不易分開，所以細(xì)胞培養(yǎng)有時叫組織培養(yǎng)或統(tǒng)稱為細(xì)胞與組織培養(yǎng)。編輯課件細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)的意義細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)不僅是細(xì)胞工程的一項根本技術(shù)，也是生物工程的一項根底技術(shù)，掌握了細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，就可以利用細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性和變異性為細(xì)胞生物學(xué)的根底理論研究和生物工程的生產(chǎn)應(yīng)用提供用力的手段。例：1、研究者可以根據(jù)不同的研究內(nèi)容和目的，十分方便地在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加或減少某些特殊的物質(zhì)，如激素或生長因子等，這樣就可以確切了解這些因子對細(xì)胞生長發(fā)育的效應(yīng)及其生理生化本質(zhì)；編輯課件細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)的意義2、可以獲得比較均一的細(xì)胞群體，為基因工程和細(xì)胞工程提供遺傳的對象和受體獲得變異細(xì)胞株，以應(yīng)用于遺傳學(xué)和遺傳工程研究、代謝與發(fā)育過程及其調(diào)節(jié)的研究，獲得有用價值的或具有新型生物或細(xì)胞系；3、建立種質(zhì)資源庫，保存具有重要價值的或瀕臨滅絕的生物種類；4、生產(chǎn)各種有用的化合物〔藥物〕；5、進行無性系快速繁殖等。編輯課件

細(xì)胞融合技術(shù)〔也稱細(xì)胞雜交技術(shù)〕：細(xì)胞融合技術(shù)是60年代創(chuàng)立的。它是在一定條件下，使不同來源的兩個或多個細(xì)胞合為一個細(xì)胞并增殖或形成新的生物體的技術(shù)。動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，可直接誘導(dǎo)融合；植物細(xì)胞進行融合時，必須先除去細(xì)胞壁。意義：動物細(xì)胞融合技術(shù)的成功，導(dǎo)致了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的出現(xiàn)，植物融合技術(shù)的成功不僅打破了雜交育種的親和性障礙，而且為實現(xiàn)“超遠(yuǎn)緣雜交〞提供了可能，因此在植物育種上有重大工的意義。編輯課件二、動物細(xì)胞工程問題：1、什么是動物細(xì)胞工程？研究的內(nèi)容是什么？2、動物細(xì)胞工程技層次如何？3、動物細(xì)胞工程有何理論與實踐意義？4、動物細(xì)胞培養(yǎng)有何特征？編輯課件1、什么是動物細(xì)胞工程？研究的內(nèi)容是什么？

動物細(xì)胞工程：是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)的原理，利用生物技術(shù)對動物細(xì)胞進行遺傳操作，定向改造動物的遺傳性，創(chuàng)造新的物種，以及從動物組織中別離有特定的功能的細(xì)胞并通過工程化在體外條件下使之快速繁殖，產(chǎn)生特定生物產(chǎn)品的工藝。編輯課件內(nèi)容：人工受精〔體外受精〕胚胎移植核移植哺乳動物孤雌生殖雙胞及嵌合體性別選擇胚胎分割及保存細(xì)胞融合細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞反響動力學(xué)動物細(xì)胞反響器主要研究內(nèi)容。編輯課件2、動物細(xì)胞工程技層次如何？遺傳操作可在不同層次上進行：1〕、在整體細(xì)胞水平上，利用細(xì)胞培養(yǎng)的各種工藝對細(xì)胞進行改造或用細(xì)胞融合的方法制備各種雜種細(xì)胞；2〕、在細(xì)胞器水平上，可以進行核移植，染色體注射或?qū)⑽⒑巳斯ぜ?xì)胞等進行融合以制備各種細(xì)胞質(zhì)體，或改變?nèi)旧w的組成倍性；3〕、在基因水平上，有采用外源基因?qū)氲姆椒?，賦予細(xì)胞以新的特征和新的功能。編輯課件4〕、通過制備全能性的胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過遺傳操作進而把它種植到假孕動物的子宮里孕育成動物以培育出新品種。理論與實踐意義：哺乳動物細(xì)胞是生產(chǎn)許多有著重要經(jīng)濟價值的醫(yī)藥產(chǎn)品的理想場所：它具有促進蛋白質(zhì)精確表達與形成三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)環(huán)境，能進行乙基化、二硫鍵等；它所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能分泌到細(xì)胞外，具有完全正常的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此用動物細(xì)胞工程生產(chǎn)的產(chǎn)品，其別離純化的程序比工程菌生產(chǎn)的產(chǎn)品要簡單得多，而且功能也可靠得多；另外通過動物細(xì)胞工程，還可以研究諸如細(xì)胞衰老調(diào)亡，基因定位遺傳病因等根底理論問題。編輯課件4、動物細(xì)胞培養(yǎng)有何特征？4、動物細(xì)胞培養(yǎng)特征。根據(jù)這些特點，我們在培養(yǎng)動物細(xì)胞時必須注意什么問題呢？1〕、培養(yǎng)時要用抗生素；〔細(xì)胞生長緩慢，易染菌〕；2〕、不能也不需要進行強力通風(fēng)或攪拌〔無細(xì)胞壁，很脆弱，需氧量少〕；3〕、有的細(xì)胞不能用懸浮培養(yǎng)法〔有錨地依賴性〕；4〕、在進行單細(xì)胞培養(yǎng)時，往往需要使用條件培養(yǎng)基〔有群體效應(yīng)〕；編輯課件5〕、一般不用于生產(chǎn)價格低廉的產(chǎn)品〔培養(yǎng)本錢較高〕；6〕、大規(guī)模培養(yǎng)時不能全用微生物反響的經(jīng)驗〔生長曲線不一樣，反響動力學(xué)也不同，有的需貼壁生長〕；7〕、經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，就必須進行傳代〔隨著細(xì)胞生長，營養(yǎng)物質(zhì)消耗，必然產(chǎn)生乳酸等代謝產(chǎn)物的積累，引起細(xì)胞衰亡，但一般繁殖50代即退化死亡，腫瘤細(xì)胞除外〕。編輯課件5、動物細(xì)胞的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)基動物細(xì)胞所需的營養(yǎng)要求更高，更復(fù)雜。主要表現(xiàn)在：1〕、C源不能用無機鹽，而大多數(shù)為葡萄糖；2〕、N源不能用無機物〔如氨、硝酸鹽等〕，而主要是各種氨基酸；3〕、要添加百分之5—20的小牛血清或動物胚胎浸出物。編輯課件用于培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基分為：維持液和生長液。相同點：都含有氨基酸、葡萄糖、核酸類物質(zhì)、維生素、輔酶、激素、生長因子、微量元素、緩沖系統(tǒng)。不同點：一是血清含量不同。維持液含量低或者不含血清，生長液含百分之5—20血清。二是用途不同。維持液主要用來保存細(xì)胞，而生長液用于培養(yǎng)、增殖細(xì)胞。編輯課件6、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)問題：什么是動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)？動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的材料來源如何？動物細(xì)胞培養(yǎng)方式如何？動物細(xì)胞培養(yǎng)方法如何？編輯課件動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：在一定條件下，通過人工供給營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子使離體動物細(xì)胞或組織生長繁殖的方法。如果是培養(yǎng)的材料是組織塊，那么稱為組織培養(yǎng)。材料：一是胚胎。如10日—12日齡的雞胚胎，實驗動物胚胎及人工流產(chǎn)胎兒。優(yōu)點是胞間的粘連作用較弱，易于消化與分散，細(xì)胞生命力強，易于培養(yǎng)與繁殖。二是成體組織和器官。如動物的肝臟、腎臟、脾臟及白血球等。優(yōu)缺點是與胚胎相反。但腫瘤細(xì)胞增殖力強，可在體外長期培養(yǎng)和繁殖，并可用微生物培養(yǎng)方式進行懸浮培養(yǎng)。編輯課件培養(yǎng)方式：一是非貼壁培養(yǎng)。這種方法一般用于血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞〔雜交瘤細(xì)胞〕和一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)，可采用懸浮培養(yǎng)法。二是貼壁培養(yǎng)。在多數(shù)的動物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞，多采用附著于帶適量正電荷的固體或半固體外表進行培養(yǎng)。培養(yǎng)方法：編輯課件1〕、組織塊培養(yǎng)法：將動物組織切成1—2立方毫米小塊進行培養(yǎng)的方法。2〕、細(xì)胞單層培養(yǎng)法：問題：什么是原代培養(yǎng)？什么是原代細(xì)胞？什么叫傳代培養(yǎng)〔繼代培養(yǎng)〕？什么是細(xì)胞系？什么是細(xì)胞株？兩者之間的關(guān)系如何？編輯課件細(xì)胞單層培養(yǎng)法：動物組織塊經(jīng)消化分散成單個細(xì)胞或細(xì)胞團塊后，粘附于培養(yǎng)容器外表培養(yǎng)成新生細(xì)胞單層的培養(yǎng)方法。細(xì)胞分散：實現(xiàn)細(xì)胞單層培養(yǎng)及克隆培養(yǎng)，需將組織中粘連在一塊的細(xì)胞分散成單個細(xì)胞。有酶消化法、物理分散法和酶消化與物理分散結(jié)合法。細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞懸浮液經(jīng)計數(shù)與稀釋后，接種于無菌培養(yǎng)容器中，加生長液，細(xì)胞就粘附于瓶底內(nèi)壁在37。C下培養(yǎng)，細(xì)胞就開始生長并形成單層。編輯課件這一培養(yǎng)過程稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)獲得的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，需要將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞〔單層〕用胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸浮液，再分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。這個過程就稱傳代培養(yǎng)〔繼代培養(yǎng)也細(xì)胞傳代〕。原代細(xì)胞經(jīng)過第一次傳代所得到的細(xì)胞群稱為細(xì)胞系。從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得的能連續(xù)傳代、有特殊性質(zhì)或特殊標(biāo)記的細(xì)胞稱為細(xì)胞株。編輯課件兩者的關(guān)系：細(xì)胞系是由來自原代培養(yǎng)的許多細(xì)胞世代所組成的，而細(xì)胞株那么需具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記，并能在培養(yǎng)傳代中長期保存〔能穩(wěn)定遺傳〕，一旦失去為些特殊性質(zhì)或標(biāo)記，細(xì)胞株又回到細(xì)胞系。3〕、單細(xì)胞別離培養(yǎng)法：也稱細(xì)胞克隆培養(yǎng)、是將動物組織分散后，使其單個細(xì)胞培養(yǎng)成純系集體的技術(shù)。由于動物細(xì)胞具有群體效應(yīng)，因此要想將單個細(xì)胞培養(yǎng)成一個克隆相當(dāng)難，即使在最優(yōu)良的培養(yǎng)基中單個細(xì)胞也很難生長，那怎么辦呢？常用兩種方法：編輯課件一是采用條件培養(yǎng)基。即生長過懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液，其中含有能促進細(xì)胞正常生長和分裂的內(nèi)源代謝物；二是在培養(yǎng)基中加飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠胸腺細(xì)胞或腹腔細(xì)胞。為了滿足這些條件要求，通常采用有限稀釋法和微板克隆技術(shù)。所謂有限稀釋：就是細(xì)胞懸浮液經(jīng)過計數(shù)后，根據(jù)需要稀釋到一定的細(xì)胞濃度。編輯課件微板克隆技術(shù)：是利用微量板進行克隆培養(yǎng)的技術(shù)。微量板是指孔徑為6mm，容量為0.3ml的多孔培養(yǎng)板。通常有96孔、55孔、和24孔三種規(guī)格。培養(yǎng)方法：優(yōu)點：是別離混雜細(xì)胞的優(yōu)良方法。在傳代過程中，由于不容易產(chǎn)生交叉混雜，故單細(xì)胞培養(yǎng)的可靠性與重復(fù)性良好。用途：1〕、建立純細(xì)胞系；2〕、檢查細(xì)胞遺傳一致性；3〕、別離細(xì)胞變種〔細(xì)胞株〕；編輯課件4〕、評價藥物及毒物對細(xì)胞生長的影響；5〕、篩選淋巴細(xì)胞雜交瘤及基因工程細(xì)胞；6〕、制備單克隆抗體并用于病毒學(xué)研究。編輯課件7、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)問題：1〕、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)指的是什么？2〕、為什么要進行動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)？3〕、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)首先要解決的難題是什么？為什么？編輯課件動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)指的是工業(yè)大規(guī)模。在規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：是指在人工控制的條件下，高密度大量培養(yǎng)有用的動物細(xì)胞來生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。這種技術(shù)是目前生物工業(yè)中大量增殖基因工程、細(xì)胞融合或株化所形成的新型有用細(xì)胞不可缺少的技術(shù)。要解決動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，首先要解決的一個難題是培養(yǎng)基。編輯課件原因：一是血清來源難而昂，大量使用必然增加產(chǎn)品本錢；二是血清產(chǎn)地、批號及動物個體不同，其質(zhì)量差異很大，加上血清的組成還沒有完全搞清楚，因而細(xì)胞培養(yǎng)過程難以檢測控制，難以保證結(jié)果的可重性；三是血清中含有多種〔大量〕的蛋白質(zhì)，從而給產(chǎn)品別離純化帶來許多困難，容易混進污染物包括病毒和細(xì)菌。對于這種情況，人們自然提出這樣的問題，能不能不用血清或者能不能用別的東西來代替血清？編輯課件要答復(fù)這個問題，首先必須搞清楚血清在動物細(xì)胞培養(yǎng)中起到什么樣的作用？研究說明：在合成動物培養(yǎng)基中參加胎牛血清或小牛血清，主要是利用其中含有的血清蛋白及a-球蛋白兩種成分。血清蛋白能刺激細(xì)胞生長；a-球蛋白能促進細(xì)胞貼壁伸展及拮抗胰蛋白酶的活力，保證經(jīng)胰蛋白酶消化后的細(xì)胞能正常生長。搞清了這個問題后，我們才有可能來開發(fā)無血清培養(yǎng)基。目前這項工作已經(jīng)成為動物細(xì)胞工程的重要內(nèi)容之一。編輯課件無血清培養(yǎng)基分為：根本培養(yǎng)基：是成分的培養(yǎng)基，大多數(shù)以DME培養(yǎng)基與HamF12培養(yǎng)基等量混合。根本合成培養(yǎng)基+生長因子〔激素和維生素等約有30多種有機物和無機微量物質(zhì)，包括哺乳動物絕大多數(shù)內(nèi)分泌激素〕。根本合成培養(yǎng)基+組織抽提液〔如乳蛋白水解液、酪蛋白水解物和胚胎浸出液〕。編輯課件現(xiàn)在用的最多的是第二種，也稱為添加生長因子培養(yǎng)基，它的特點是：組成物質(zhì)的種類與數(shù)量均為，并可按需要調(diào)節(jié)。優(yōu)點：一是可用于培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞及在不含血清培養(yǎng)基中不能生長的細(xì)胞；二是可用于雜種細(xì)胞、基因工程細(xì)胞及突變體細(xì)胞的培養(yǎng)，生產(chǎn)有用物質(zhì)；三是大大簡化細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物別離純化的操作程序。編輯課件能起血清作用的激素和生長因子主要有：鐵傳遞蛋白、乙醇胺、胰島素、促胃激素、維生素C、氫化考的松和硒等。培養(yǎng)技術(shù)與其條件控制：動物細(xì)胞培養(yǎng)方法很多，但可概括為兩大類即懸浮培養(yǎng)法和固定化培養(yǎng)法。微載體培養(yǎng)法是兩者結(jié)合而衍生出來的。下面簡單介紹懸浮培養(yǎng)法：定義：即讓細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)下生長繁殖。其培養(yǎng)方式又有批量法、半連續(xù)法及連續(xù)法。編輯課件適用范圍：雜交瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血液細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。主要用于生產(chǎn)疫苗、r-干擾素、白介素及單克隆抗體等生物藥品或制品。優(yōu)點：可連續(xù)收集局部細(xì)胞進行移植繼代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)時無需消化分散，免受酶類、EDTA及機械損害；細(xì)胞必集率高，并可連續(xù)測定細(xì)胞濃度，還可能實現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。但此法不適用于正常組織細(xì)胞的培養(yǎng)。編輯課件動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程：編輯課件編輯課件8、胚胎干細(xì)胞系的建立及其利用技術(shù)概述：編輯課件編輯課件問題：什么是胚胎干細(xì)胞？胚胎細(xì)胞有何特征？胚胎干細(xì)胞如何獲得？如何培養(yǎng)？胚胎干細(xì)胞如何發(fā)育成個體？編輯課件胚胎干細(xì)胞〔EmbryonicStemCell簡稱ES〕：是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團別離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度末分化的細(xì)胞。編輯課件編輯課件

編輯課件胚胎細(xì)胞的特征：一是具有正常二倍染色體；二是具有發(fā)育的全能性〔一個細(xì)胞，都包含有某個體的全部遺傳信息，在離體培養(yǎng)條件下能生長為完整的個體〕廣泛地分化成各種組織；三是能在體外擴增，可進行遺傳操作，選擇、克隆和凍存。編輯課件胚胎干細(xì)胞獲得有兩條途徑：一是從早期胚胎中獲得；二是結(jié)合克隆技術(shù)獲得。胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)：由于大多數(shù)胚胎干細(xì)胞必須生長在滋養(yǎng)層細(xì)胞上，體外培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿需要百分之0.1明膠鋪底，常用STO細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞〔即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞〕。編輯課件

編輯課件STO的特征：具有接觸抑制，它能分泌一些促使細(xì)胞生長和抑制細(xì)胞分化的因子或某些細(xì)胞外基質(zhì)，使胚胎內(nèi)細(xì)胞團能在比較穩(wěn)定的環(huán)境中生長并保持末分化狀態(tài)。胚胎干細(xì)胞是否培養(yǎng)成功在于：一是胚胎發(fā)育的精細(xì)階段；二是要從單個胚胎中獲得足夠量的具有多能干細(xì)胞的前體細(xì)胞；三是培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式。編輯課件目前，ES技術(shù)實用化還需要解決的技術(shù)難題還用很多，主要表現(xiàn)在：一是胚胎干細(xì)胞極易分化為其它細(xì)胞，如何維持體外擴增時不發(fā)生分化？二是如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化？三是由ES在體外發(fā)育成一完整的器官特別是像心、肝、腎、肺等大型精細(xì)復(fù)雜的器官這一目標(biāo)，還需要技術(shù)上的突破；四是如何克服移植排拆反響。編輯課件〔二〕、動物細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用1、動物細(xì)胞融合技術(shù)：定義：在外力作用下，使兩個或兩個以上的異源細(xì)胞合并為一個多核細(xì)胞的過程。操作過程：編輯課件編輯課件意義：是用人工的方法打破了生物界物種間的屏障，使人們能夠按照自己的意愿把各種動物的、植物的、動植物的不同組織類型的細(xì)胞融合在一起；還可以把不同細(xì)胞的不同組分，胞核和胞質(zhì)體，單個染色體或少數(shù)染色體，不同胞漿成分，通過微核、人工細(xì)胞、類脂小泡等彼此融合，而制備各種類型的重組細(xì)胞。用來融合的體細(xì)胞一般都是已分化的二倍體細(xì)胞。融合形成四倍體細(xì)胞。這種細(xì)胞是人類強制自然的結(jié)果，因此產(chǎn)生了很少發(fā)生的雜種細(xì)胞。編輯課件2、促融因素及其誘導(dǎo)融合作用1〕、病毒誘導(dǎo)融合：2〕、PEG誘導(dǎo)融合：3〕、電場誘導(dǎo)融合：編輯課件3、細(xì)胞融合的方式1〕、完整細(xì)胞之間的融合：2〕、核體、胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合：3〕、微細(xì)胞與完整細(xì)胞的融合：4〕、脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞融合：這四種融合方式，共同點均有一方為完整細(xì)胞，這個完整細(xì)胞可用于檢測另一種細(xì)胞、細(xì)胞器及生物大分子對其遺傳性及表達的影響。所以這個完整細(xì)胞相當(dāng)于一個活試管或微型反響器。編輯課件4、雜種細(xì)胞的篩選原理及篩選系統(tǒng)篩選雜種細(xì)胞是細(xì)胞融合過程中最重要環(huán)節(jié)之一。雜種細(xì)胞在總體細(xì)胞中為數(shù)較少，因此在進行細(xì)胞融合之前就必須先設(shè)計如何把雜交細(xì)胞從眾多的細(xì)胞群體中篩選出來，篩選的目的是獲得性能優(yōu)良的雜種細(xì)胞。編輯課件編輯課件篩選的原理：將融合混合物接種于選擇性培養(yǎng)基上，終止同核多型、異核多型及末融合的親本細(xì)胞的繁殖，而僅允許異型雙核細(xì)胞繁殖。在動物細(xì)胞的融合過程中，需要根據(jù)篩選系統(tǒng)來選擇適當(dāng)?shù)挠H本細(xì)胞或依據(jù)細(xì)胞的生理生化特性來設(shè)計特定的篩選系統(tǒng)，以便于獲得具有活力的有益雜種細(xì)胞。編輯課件篩選的方法：HAT選擇系統(tǒng)：含一定濃度的次黃嘌呤〔H〕、氨基喋呤〔A〕及胸腺嘧啶核苷〔T〕的一種選擇性培養(yǎng)基。它們與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。編輯課件編輯課件編輯課件抗藥性選擇系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對藥物敏感性的差異來篩選雜種細(xì)胞。細(xì)胞不同，其生理生化特征不一樣，對同一種藥物的敏感性差異很大?；パa選擇法：利用兩種親本營養(yǎng)缺陷型互補原理來篩選雜種細(xì)胞的方法。原位雜交法和基因探針選擇法前面已介紹過。編輯課件5、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用理論上：基因定位及繪制人類基因圖，基因互補分析；應(yīng)用上：主要是生產(chǎn)活性物質(zhì)。編輯課件〔三〕、單克隆抗體技術(shù)1、概述：2、根本原理：3、經(jīng)典的方法獲取抗體存在以下缺點：一是這些抗體不是均勻的，而是多種抗體的混合物。特異性差、檢測靈敏度低、使用效果不好；二是由于動物個體差異而導(dǎo)致各批血清內(nèi)抗體的種類與含量不一，無法標(biāo)準(zhǔn)化；三是由于分泌抗體的B細(xì)胞壽命很短，一般只能存活幾天，因此抗體的產(chǎn)生是有限的，無法大量生產(chǎn)。編輯課件4、雜交瘤技術(shù)：將骨髓瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞的過程。通過這樣的技術(shù)得到的雜交瘤細(xì)胞具有了兩組親本細(xì)胞的遺傳特征。能在體外長期培養(yǎng)，快