第三章 細(xì)胞工程

第三章細(xì)胞工程〔cellengineering〕主講人：黃循吟編輯課件一、概述問(wèn)題：1、什么是細(xì)胞？什么是細(xì)胞工程？2、開(kāi)展簡(jiǎn)史如何？3、細(xì)胞工程的根本技術(shù)是什么？編輯課件1、什么是細(xì)胞？什么是細(xì)胞工程？細(xì)胞：是由細(xì)胞質(zhì)膜包裹著的細(xì)胞質(zhì)和核或核帶組成的，能自我繁殖的結(jié)構(gòu)物，是生物體的根本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，是生命孕育的起點(diǎn)，是生物體的根本組成單位。Cellengineering:根據(jù)生物學(xué)和工程學(xué)的原理，在細(xì)胞水平上定向改造細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，培育具有新性狀的生物個(gè)體或細(xì)胞群體，并利用它們?yōu)槿祟惿a(chǎn)各類藥品和其他產(chǎn)品以及提供效勞的技術(shù)體系。編輯課件2、開(kāi)展簡(jiǎn)史如何？1〕1838〔最早〕馬勒，在脊椎動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞中觀察到多核現(xiàn)象2〕1849-1858年科學(xué)家們?cè)诜谓M織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象。3〕1859年，A.巴里解開(kāi)了這個(gè)謎團(tuán)，他認(rèn)為“多核現(xiàn)象〞是由“單個(gè)細(xì)胞融合〞而成的。4〕到了1907年哈林發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)的方法。使人們能應(yīng)用這種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。5〕1965年哈里斯和奧金斯在前人的根底上在細(xì)胞融合中所做的奉獻(xiàn)。編輯課件6〕直到1960年，英國(guó)諾丁漢大學(xué)科金教授創(chuàng)造性地應(yīng)用酶解的方法，才首次成功地從番茄幼苗的根部制備到大量的原生原體。在此根底上，1972年美國(guó)的卡爾森等人用NaBO3作為融合的誘導(dǎo)劑，將來(lái)自不同種的兩個(gè)煙草原生質(zhì)體進(jìn)行融合，獲得世界上第一個(gè)體細(xì)胞雜種植株。此后，分別以凱樂(lè)、高國(guó)楠和喬默爾曼等為首的三個(gè)科學(xué)家小組，從不同方面改進(jìn)和開(kāi)展了植物體細(xì)胞融合技術(shù)。目前常用的植物細(xì)胞融合技術(shù)，有高國(guó)楠建立的使用化學(xué)融合劑PEG〔聚乙二醇〕的融合技術(shù)〔1974〕，森達(dá)和喬默爾曼創(chuàng)立和開(kāi)展的電融合技術(shù)，以及斯維格〔1978〕將電融合體系培養(yǎng)技術(shù)。近年來(lái)，在植物細(xì)胞融合研究方面的突出進(jìn)展是建立了單對(duì)細(xì)胞融合體系培養(yǎng)技術(shù)，并根本上解決了融合細(xì)胞的選擇問(wèn)題?，F(xiàn)在，植物原生質(zhì)體及其應(yīng)用的研究已成為植物細(xì)胞工程中最活潑的研究領(lǐng)域之一。編輯課件3、細(xì)胞工程的根本技術(shù)是什么？細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)：是將生物體的某一局部組織取出一小塊，在體外進(jìn)行外表消毒處理后，使之分散成單個(gè)游離的細(xì)胞，并放置在人工配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長(zhǎng)分裂的技術(shù)。由于生物體的一種組織，往往包含有兩種以上的細(xì)胞，如葉片組織至少年犯含有葉肉細(xì)胞，維菅束鞘細(xì)胞和表皮細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中不易分開(kāi)，所以細(xì)胞培養(yǎng)有時(shí)叫組織培養(yǎng)或統(tǒng)稱為細(xì)胞與組織培養(yǎng)。編輯課件細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)的意義細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)不僅是細(xì)胞工程的一項(xiàng)根本技術(shù)，也是生物工程的一項(xiàng)根底技術(shù)，掌握了細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，就可以利用細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性和變異性為細(xì)胞生物學(xué)的根底理論研究和生物工程的生產(chǎn)應(yīng)用提供用力的手段。例：1、研究者可以根據(jù)不同的研究?jī)?nèi)容和目的，十分方便地在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加或減少某些特殊的物質(zhì)，如激素或生長(zhǎng)因子等，這樣就可以確切了解這些因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的效應(yīng)及其生理生化本質(zhì)；編輯課件細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)的意義2、可以獲得比較均一的細(xì)胞群體，為基因工程和細(xì)胞工程提供遺傳的對(duì)象和受體獲得變異細(xì)胞株，以應(yīng)用于遺傳學(xué)和遺傳工程研究、代謝與發(fā)育過(guò)程及其調(diào)節(jié)的研究，獲得有用價(jià)值的或具有新型生物或細(xì)胞系；3、建立種質(zhì)資源庫(kù)，保存具有重要價(jià)值的或?yàn)l臨滅絕的生物種類；4、生產(chǎn)各種有用的化合物〔藥物〕；5、進(jìn)行無(wú)性系快速繁殖等。編輯課件

細(xì)胞融合技術(shù)〔也稱細(xì)胞雜交技術(shù)〕：細(xì)胞融合技術(shù)是60年代創(chuàng)立的。它是在一定條件下，使不同來(lái)源的兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合為一個(gè)細(xì)胞并增殖或形成新的生物體的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，可直接誘導(dǎo)融合；植物細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，必須先除去細(xì)胞壁。意義：動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的成功，導(dǎo)致了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的出現(xiàn)，植物融合技術(shù)的成功不僅打破了雜交育種的親和性障礙，而且為實(shí)現(xiàn)“超遠(yuǎn)緣雜交〞提供了可能，因此在植物育種上有重大工的意義。編輯課件二、動(dòng)物細(xì)胞工程問(wèn)題：1、什么是動(dòng)物細(xì)胞工程？研究的內(nèi)容是什么？2、動(dòng)物細(xì)胞工程技層次如何？3、動(dòng)物細(xì)胞工程有何理論與實(shí)踐意義？4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有何特征？編輯課件1、什么是動(dòng)物細(xì)胞工程？研究的內(nèi)容是什么？

動(dòng)物細(xì)胞工程：是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)的原理，利用生物技術(shù)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，定向改造動(dòng)物的遺傳性，創(chuàng)造新的物種，以及從動(dòng)物組織中別離有特定的功能的細(xì)胞并通過(guò)工程化在體外條件下使之快速繁殖，產(chǎn)生特定生物產(chǎn)品的工藝。編輯課件內(nèi)容：人工受精〔體外受精〕胚胎移植核移植哺乳動(dòng)物孤雌生殖雙胞及嵌合體性別選擇胚胎分割及保存細(xì)胞融合細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞反響動(dòng)力學(xué)動(dòng)物細(xì)胞反響器主要研究?jī)?nèi)容。編輯課件2、動(dòng)物細(xì)胞工程技層次如何？遺傳操作可在不同層次上進(jìn)行：1〕、在整體細(xì)胞水平上，利用細(xì)胞培養(yǎng)的各種工藝對(duì)細(xì)胞進(jìn)行改造或用細(xì)胞融合的方法制備各種雜種細(xì)胞；2〕、在細(xì)胞器水平上，可以進(jìn)行核移植，染色體注射或?qū)⑽⒑巳斯ぜ?xì)胞等進(jìn)行融合以制備各種細(xì)胞質(zhì)體，或改變?nèi)旧w的組成倍性；3〕、在基因水平上，有采用外源基因?qū)氲姆椒ǎx予細(xì)胞以新的特征和新的功能。編輯課件4〕、通過(guò)制備全能性的胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)遺傳操作進(jìn)而把它種植到假孕動(dòng)物的子宮里孕育成動(dòng)物以培育出新品種。理論與實(shí)踐意義：哺乳動(dòng)物細(xì)胞是生產(chǎn)許多有著重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的醫(yī)藥產(chǎn)品的理想場(chǎng)所：它具有促進(jìn)蛋白質(zhì)精確表達(dá)與形成三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)環(huán)境，能進(jìn)行乙基化、二硫鍵等；它所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能分泌到細(xì)胞外，具有完全正常的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此用動(dòng)物細(xì)胞工程生產(chǎn)的產(chǎn)品，其別離純化的程序比工程菌生產(chǎn)的產(chǎn)品要簡(jiǎn)單得多，而且功能也可靠得多；另外通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞工程，還可以研究諸如細(xì)胞衰老調(diào)亡，基因定位遺傳病因等根底理論問(wèn)題。編輯課件4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有何特征？4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特征。根據(jù)這些特點(diǎn)，我們?cè)谂囵B(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)必須注意什么問(wèn)題呢？1〕、培養(yǎng)時(shí)要用抗生素；〔細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易染菌〕；2〕、不能也不需要進(jìn)行強(qiáng)力通風(fēng)或攪拌〔無(wú)細(xì)胞壁，很脆弱，需氧量少〕；3〕、有的細(xì)胞不能用懸浮培養(yǎng)法〔有錨地依賴性〕；4〕、在進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，往往需要使用條件培養(yǎng)基〔有群體效應(yīng)〕；編輯課件5〕、一般不用于生產(chǎn)價(jià)格低廉的產(chǎn)品〔培養(yǎng)本錢較高〕；6〕、大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)不能全用微生物反響的經(jīng)驗(yàn)〔生長(zhǎng)曲線不一樣，反響動(dòng)力學(xué)也不同，有的需貼壁生長(zhǎng)〕；7〕、經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，就必須進(jìn)行傳代〔隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，必然產(chǎn)生乳酸等代謝產(chǎn)物的積累，引起細(xì)胞衰亡，但一般繁殖50代即退化死亡，腫瘤細(xì)胞除外〕。編輯課件5、動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)要求更高，更復(fù)雜。主要表現(xiàn)在：1〕、C源不能用無(wú)機(jī)鹽，而大多數(shù)為葡萄糖；2〕、N源不能用無(wú)機(jī)物〔如氨、硝酸鹽等〕，而主要是各種氨基酸；3〕、要添加百分之5—20的小牛血清或動(dòng)物胚胎浸出物。編輯課件用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基分為：維持液和生長(zhǎng)液。相同點(diǎn)：都含有氨基酸、葡萄糖、核酸類物質(zhì)、維生素、輔酶、激素、生長(zhǎng)因子、微量元素、緩沖系統(tǒng)。不同點(diǎn)：一是血清含量不同。維持液含量低或者不含血清，生長(zhǎng)液含百分之5—20血清。二是用途不同。維持液主要用來(lái)保存細(xì)胞，而生長(zhǎng)液用于培養(yǎng)、增殖細(xì)胞。編輯課件6、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)問(wèn)題：什么是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的材料來(lái)源如何？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式如何？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法如何？編輯課件動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：在一定條件下，通過(guò)人工供給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)因子使離體動(dòng)物細(xì)胞或組織生長(zhǎng)繁殖的方法。如果是培養(yǎng)的材料是組織塊，那么稱為組織培養(yǎng)。材料：一是胚胎。如10日—12日齡的雞胚胎，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎及人工流產(chǎn)胎兒。優(yōu)點(diǎn)是胞間的粘連作用較弱，易于消化與分散，細(xì)胞生命力強(qiáng)，易于培養(yǎng)與繁殖。二是成體組織和器官。如動(dòng)物的肝臟、腎臟、脾臟及白血球等。優(yōu)缺點(diǎn)是與胚胎相反。但腫瘤細(xì)胞增殖力強(qiáng)，可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和繁殖，并可用微生物培養(yǎng)方式進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。編輯課件培養(yǎng)方式：一是非貼壁培養(yǎng)。這種方法一般用于血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞〔雜交瘤細(xì)胞〕和一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)，可采用懸浮培養(yǎng)法。二是貼壁培養(yǎng)。在多數(shù)的動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞，多采用附著于帶適量正電荷的固體或半固體外表進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)方法：編輯課件1〕、組織塊培養(yǎng)法：將動(dòng)物組織切成1—2立方毫米小塊進(jìn)行培養(yǎng)的方法。2〕、細(xì)胞單層培養(yǎng)法：?jiǎn)栴}：什么是原代培養(yǎng)？什么是原代細(xì)胞？什么叫傳代培養(yǎng)〔繼代培養(yǎng)〕？什么是細(xì)胞系？什么是細(xì)胞株？?jī)烧咧g的關(guān)系如何？編輯課件細(xì)胞單層培養(yǎng)法：動(dòng)物組織塊經(jīng)消化分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊后，粘附于培養(yǎng)容器外表培養(yǎng)成新生細(xì)胞單層的培養(yǎng)方法。細(xì)胞分散：實(shí)現(xiàn)細(xì)胞單層培養(yǎng)及克隆培養(yǎng)，需將組織中粘連在一塊的細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。有酶消化法、物理分散法和酶消化與物理分散結(jié)合法。細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞懸浮液經(jīng)計(jì)數(shù)與稀釋后，接種于無(wú)菌培養(yǎng)容器中，加生長(zhǎng)液，細(xì)胞就粘附于瓶底內(nèi)壁在37。C下培養(yǎng)，細(xì)胞就開(kāi)始生長(zhǎng)并形成單層。編輯課件這一培養(yǎng)過(guò)程稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)獲得的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，需要將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞〔單層〕用胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸浮液，再分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。這個(gè)過(guò)程就稱傳代培養(yǎng)〔繼代培養(yǎng)也細(xì)胞傳代〕。原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)第一次傳代所得到的細(xì)胞群稱為細(xì)胞系。從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得的能連續(xù)傳代、有特殊性質(zhì)或特殊標(biāo)記的細(xì)胞稱為細(xì)胞株。編輯課件兩者的關(guān)系：細(xì)胞系是由來(lái)自原代培養(yǎng)的許多細(xì)胞世代所組成的，而細(xì)胞株那么需具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記，并能在培養(yǎng)傳代中長(zhǎng)期保存〔能穩(wěn)定遺傳〕，一旦失去為些特殊性質(zhì)或標(biāo)記，細(xì)胞株又回到細(xì)胞系。3〕、單細(xì)胞別離培養(yǎng)法：也稱細(xì)胞克隆培養(yǎng)、是將動(dòng)物組織分散后，使其單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成純系集體的技術(shù)。由于動(dòng)物細(xì)胞具有群體效應(yīng)，因此要想將單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成一個(gè)克隆相當(dāng)難，即使在最優(yōu)良的培養(yǎng)基中單個(gè)細(xì)胞也很難生長(zhǎng)，那怎么辦呢？常用兩種方法：編輯課件一是采用條件培養(yǎng)基。即生長(zhǎng)過(guò)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液，其中含有能促進(jìn)細(xì)胞正常生長(zhǎng)和分裂的內(nèi)源代謝物；二是在培養(yǎng)基中加飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠胸腺細(xì)胞或腹腔細(xì)胞。為了滿足這些條件要求，通常采用有限稀釋法和微板克隆技術(shù)。所謂有限稀釋：就是細(xì)胞懸浮液經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)后，根據(jù)需要稀釋到一定的細(xì)胞濃度。編輯課件微板克隆技術(shù)：是利用微量板進(jìn)行克隆培養(yǎng)的技術(shù)。微量板是指孔徑為6mm，容量為0.3ml的多孔培養(yǎng)板。通常有96孔、55孔、和24孔三種規(guī)格。培養(yǎng)方法：優(yōu)點(diǎn)：是別離混雜細(xì)胞的優(yōu)良方法。在傳代過(guò)程中，由于不容易產(chǎn)生交叉混雜，故單細(xì)胞培養(yǎng)的可靠性與重復(fù)性良好。用途：1〕、建立純細(xì)胞系；2〕、檢查細(xì)胞遺傳一致性；3〕、別離細(xì)胞變種〔細(xì)胞株〕；編輯課件4〕、評(píng)價(jià)藥物及毒物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；5〕、篩選淋巴細(xì)胞雜交瘤及基因工程細(xì)胞；6〕、制備單克隆抗體并用于病毒學(xué)研究。編輯課件7、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)問(wèn)題：1〕、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)指的是什么？2〕、為什么要進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)？3〕、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)首先要解決的難題是什么？為什么？編輯課件動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)指的是工業(yè)大規(guī)模。在規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：是指在人工控制的條件下，高密度大量培養(yǎng)有用的動(dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。這種技術(shù)是目前生物工業(yè)中大量增殖基因工程、細(xì)胞融合或株化所形成的新型有用細(xì)胞不可缺少的技術(shù)。要解決動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，首先要解決的一個(gè)難題是培養(yǎng)基。編輯課件原因：一是血清來(lái)源難而昂，大量使用必然增加產(chǎn)品本錢；二是血清產(chǎn)地、批號(hào)及動(dòng)物個(gè)體不同，其質(zhì)量差異很大，加上血清的組成還沒(méi)有完全搞清楚，因而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程難以檢測(cè)控制，難以保證結(jié)果的可重性；三是血清中含有多種〔大量〕的蛋白質(zhì)，從而給產(chǎn)品別離純化帶來(lái)許多困難，容易混進(jìn)污染物包括病毒和細(xì)菌。對(duì)于這種情況，人們自然提出這樣的問(wèn)題，能不能不用血清或者能不能用別的東西來(lái)代替血清？編輯課件要答復(fù)這個(gè)問(wèn)題，首先必須搞清楚血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中起到什么樣的作用？研究說(shuō)明：在合成動(dòng)物培養(yǎng)基中參加胎牛血清或小牛血清，主要是利用其中含有的血清蛋白及a-球蛋白兩種成分。血清蛋白能刺激細(xì)胞生長(zhǎng)；a-球蛋白能促進(jìn)細(xì)胞貼壁伸展及拮抗胰蛋白酶的活力，保證經(jīng)胰蛋白酶消化后的細(xì)胞能正常生長(zhǎng)。搞清了這個(gè)問(wèn)題后，我們才有可能來(lái)開(kāi)發(fā)無(wú)血清培養(yǎng)基。目前這項(xiàng)工作已經(jīng)成為動(dòng)物細(xì)胞工程的重要內(nèi)容之一。編輯課件無(wú)血清培養(yǎng)基分為：根本培養(yǎng)基：是成分的培養(yǎng)基，大多數(shù)以DME培養(yǎng)基與HamF12培養(yǎng)基等量混合。根本合成培養(yǎng)基+生長(zhǎng)因子〔激素和維生素等約有30多種有機(jī)物和無(wú)機(jī)微量物質(zhì)，包括哺乳動(dòng)物絕大多數(shù)內(nèi)分泌激素〕。根本合成培養(yǎng)基+組織抽提液〔如乳蛋白水解液、酪蛋白水解物和胚胎浸出液〕。編輯課件現(xiàn)在用的最多的是第二種，也稱為添加生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基，它的特點(diǎn)是：組成物質(zhì)的種類與數(shù)量均為，并可按需要調(diào)節(jié)。優(yōu)點(diǎn)：一是可用于培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞及在不含血清培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的細(xì)胞；二是可用于雜種細(xì)胞、基因工程細(xì)胞及突變體細(xì)胞的培養(yǎng)，生產(chǎn)有用物質(zhì)；三是大大簡(jiǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物別離純化的操作程序。編輯課件能起血清作用的激素和生長(zhǎng)因子主要有：鐵傳遞蛋白、乙醇胺、胰島素、促胃激素、維生素C、氫化考的松和硒等。培養(yǎng)技術(shù)與其條件控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法很多，但可概括為兩大類即懸浮培養(yǎng)法和固定化培養(yǎng)法。微載體培養(yǎng)法是兩者結(jié)合而衍生出來(lái)的。下面簡(jiǎn)單介紹懸浮培養(yǎng)法：定義：即讓細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)繁殖。其培養(yǎng)方式又有批量法、半連續(xù)法及連續(xù)法。編輯課件適用范圍：雜交瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血液細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。主要用于生產(chǎn)疫苗、r-干擾素、白介素及單克隆抗體等生物藥品或制品。優(yōu)點(diǎn)：可連續(xù)收集局部細(xì)胞進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)時(shí)無(wú)需消化分散，免受酶類、EDTA及機(jī)械損害；細(xì)胞必集率高，并可連續(xù)測(cè)定細(xì)胞濃度，還可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。但此法不適用于正常組織細(xì)胞的培養(yǎng)。編輯課件動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程：編輯課件編輯課件8、胚胎干細(xì)胞系的建立及其利用技術(shù)概述：編輯課件編輯課件問(wèn)題：什么是胚胎干細(xì)胞？胚胎細(xì)胞有何特征？胚胎干細(xì)胞如何獲得？如何培養(yǎng)？胚胎干細(xì)胞如何發(fā)育成個(gè)體？編輯課件胚胎干細(xì)胞〔EmbryonicStemCell簡(jiǎn)稱ES〕：是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)別離出來(lái)的，能在體外培養(yǎng)的一種高度末分化的細(xì)胞。編輯課件編輯課件

編輯課件胚胎細(xì)胞的特征：一是具有正常二倍染色體；二是具有發(fā)育的全能性〔一個(gè)細(xì)胞，都包含有某個(gè)體的全部遺傳信息，在離體培養(yǎng)條件下能生長(zhǎng)為完整的個(gè)體〕廣泛地分化成各種組織；三是能在體外擴(kuò)增，可進(jìn)行遺傳操作，選擇、克隆和凍存。編輯課件胚胎干細(xì)胞獲得有兩條途徑：一是從早期胚胎中獲得；二是結(jié)合克隆技術(shù)獲得。胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)：由于大多數(shù)胚胎干細(xì)胞必須生長(zhǎng)在滋養(yǎng)層細(xì)胞上，體外培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿需要百分之0.1明膠鋪底，常用STO細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞〔即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞〕。編輯課件

編輯課件STO的特征：具有接觸抑制，它能分泌一些促使細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制細(xì)胞分化的因子或某些細(xì)胞外基質(zhì)，使胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)能在比較穩(wěn)定的環(huán)境中生長(zhǎng)并保持末分化狀態(tài)。胚胎干細(xì)胞是否培養(yǎng)成功在于：一是胚胎發(fā)育的精細(xì)階段；二是要從單個(gè)胚胎中獲得足夠量的具有多能干細(xì)胞的前體細(xì)胞；三是培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式。編輯課件目前，ES技術(shù)實(shí)用化還需要解決的技術(shù)難題還用很多，主要表現(xiàn)在：一是胚胎干細(xì)胞極易分化為其它細(xì)胞，如何維持體外擴(kuò)增時(shí)不發(fā)生分化？二是如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化？三是由ES在體外發(fā)育成一完整的器官特別是像心、肝、腎、肺等大型精細(xì)復(fù)雜的器官這一目標(biāo)，還需要技術(shù)上的突破；四是如何克服移植排拆反響。編輯課件〔二〕、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用1、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)：定義：在外力作用下，使兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源細(xì)胞合并為一個(gè)多核細(xì)胞的過(guò)程。操作過(guò)程：編輯課件編輯課件意義：是用人工的方法打破了生物界物種間的屏障，使人們能夠按照自己的意愿把各種動(dòng)物的、植物的、動(dòng)植物的不同組織類型的細(xì)胞融合在一起；還可以把不同細(xì)胞的不同組分，胞核和胞質(zhì)體，單個(gè)染色體或少數(shù)染色體，不同胞漿成分，通過(guò)微核、人工細(xì)胞、類脂小泡等彼此融合，而制備各種類型的重組細(xì)胞。用來(lái)融合的體細(xì)胞一般都是已分化的二倍體細(xì)胞。融合形成四倍體細(xì)胞。這種細(xì)胞是人類強(qiáng)制自然的結(jié)果，因此產(chǎn)生了很少發(fā)生的雜種細(xì)胞。編輯課件2、促融因素及其誘導(dǎo)融合作用1〕、病毒誘導(dǎo)融合：2〕、PEG誘導(dǎo)融合：3〕、電場(chǎng)誘導(dǎo)融合：編輯課件3、細(xì)胞融合的方式1〕、完整細(xì)胞之間的融合：2〕、核體、胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合：3〕、微細(xì)胞與完整細(xì)胞的融合：4〕、脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞融合：這四種融合方式，共同點(diǎn)均有一方為完整細(xì)胞，這個(gè)完整細(xì)胞可用于檢測(cè)另一種細(xì)胞、細(xì)胞器及生物大分子對(duì)其遺傳性及表達(dá)的影響。所以這個(gè)完整細(xì)胞相當(dāng)于一個(gè)活試管或微型反響器。編輯課件4、雜種細(xì)胞的篩選原理及篩選系統(tǒng)篩選雜種細(xì)胞是細(xì)胞融合過(guò)程中最重要環(huán)節(jié)之一。雜種細(xì)胞在總體細(xì)胞中為數(shù)較少，因此在進(jìn)行細(xì)胞融合之前就必須先設(shè)計(jì)如何把雜交細(xì)胞從眾多的細(xì)胞群體中篩選出來(lái)，篩選的目的是獲得性能優(yōu)良的雜種細(xì)胞。編輯課件編輯課件篩選的原理：將融合混合物接種于選擇性培養(yǎng)基上，終止同核多型、異核多型及末融合的親本細(xì)胞的繁殖，而僅允許異型雙核細(xì)胞繁殖。在動(dòng)物細(xì)胞的融合過(guò)程中，需要根據(jù)篩選系統(tǒng)來(lái)選擇適當(dāng)?shù)挠H本細(xì)胞或依據(jù)細(xì)胞的生理生化特性來(lái)設(shè)計(jì)特定的篩選系統(tǒng)，以便于獲得具有活力的有益雜種細(xì)胞。編輯課件篩選的方法：HAT選擇系統(tǒng)：含一定濃度的次黃嘌呤〔H〕、氨基喋呤〔A〕及胸腺嘧啶核苷〔T〕的一種選擇性培養(yǎng)基。它們與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。編輯課件編輯課件編輯課件抗藥性選擇系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對(duì)藥物敏感性的差異來(lái)篩選雜種細(xì)胞。細(xì)胞不同，其生理生化特征不一樣，對(duì)同一種藥物的敏感性差異很大。互補(bǔ)選擇法：利用兩種親本營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)原理來(lái)篩選雜種細(xì)胞的方法。原位雜交法和基因探針選擇法前面已介紹過(guò)。編輯課件5、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用理論上：基因定位及繪制人類基因圖，基因互補(bǔ)分析；應(yīng)用上：主要是生產(chǎn)活性物質(zhì)。編輯課件〔三〕、單克隆抗體技術(shù)1、概述：2、根本原理：3、經(jīng)典的方法獲取抗體存在以下缺點(diǎn)：一是這些抗體不是均勻的，而是多種抗體的混合物。特異性差、檢測(cè)靈敏度低、使用效果不好；二是由于動(dòng)物個(gè)體差異而導(dǎo)致各批血清內(nèi)抗體的種類與含量不一，無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化；三是由于分泌抗體的B細(xì)胞壽命很短，一般只能存活幾天，因此抗體的產(chǎn)生是有限的，無(wú)法大量生產(chǎn)。編輯課件4、雜交瘤技術(shù)：將骨髓瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞的過(guò)程。通過(guò)這樣的技術(shù)得到的雜交瘤細(xì)胞具有了兩組親本細(xì)胞的遺傳特征。能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，快