藥物對(duì)豚鼠離體腸平滑肌的作用及PA2、PD2測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方案

中藥學(xué)院綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案學(xué)生學(xué)號(hào)、姓名：2006038068蘇鶴桂2006038071譚柏森2006038102鐘潤(rùn)桃2006038062彭冠2006038075王衍棟 年級(jí)、專(zhuān)業(yè)：06藥學(xué)實(shí)驗(yàn)課程名稱(chēng)：藥物對(duì)豚鼠離體腸平滑肌的作用及PA2、PD2測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分組號(hào)： 填寫(xiě)日期：09.11.11. 實(shí)驗(yàn)名| 藥物對(duì)豚鼠離體腸平滑肌的作用及PA2、PD2測(cè)定稱(chēng)項(xiàng)目背景（實(shí)驗(yàn)的目的、意義，以及欲解決的問(wèn)題和國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀）實(shí)驗(yàn)的目的建立豚鼠離體腸平滑肌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；觀察阿托品對(duì)乙酰膽堿的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用掌握pA2、pD2值的測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)意義1建立方法研究藥物拮抗作用2掌握pA2、pD2值的測(cè)定方法國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析（一） 阿托品對(duì)胃腸道的研究狀況阿托品可以抑制受體節(jié)后膽堿能神經(jīng)支配的平滑肌與腺體活動(dòng)，并根據(jù)本品劑量大小，有刺激或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用。解毒系在M-膽堿受體部位拮抗膽堿酯酶抑制劑的作用，如增加氣管、腸道系粘液腺與唾液腺的分泌，腸道平滑肌攣縮，以及植物神經(jīng)節(jié)受刺激后的亢進(jìn)。此外，阿托品能興奮或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有一定的劑量依賴(lài)性。對(duì)心臟、腸和腸道平滑肌作用比其他顛茄生物堿更強(qiáng)而持久。（二） 乙酰膽堿的研究狀況ACh可明顯興奮胃腸道，使其收縮幅度、張力增加，胃、腸平滑肌蠕動(dòng)增加，并可促進(jìn)胃、腸分泌，導(dǎo)致惡心、曖氣、嘔吐、腹痛及排便等癥狀。Ach還可使淚腺、氣管和腸道腺體、唾液腺、消化道腺體和汗腺分泌增加，使腸道收縮，頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈體化學(xué)受體興奮。當(dāng)ACh局部滴眼時(shí)，可致瞳孔收縮，調(diào)節(jié)于近視。ACh尚可作用于自主神經(jīng)節(jié)和骨骼肌的神經(jīng)肌肉接頭的膽堿受體，引起交感、副交感神經(jīng)節(jié)興奮，肌肉收縮。由于ACh不易進(jìn)入中樞，故盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)有膽堿受體存在，但外周給藥很少產(chǎn)生中樞作用。臨床常見(jiàn)藥物有卡巴膽堿，毛果蕓香堿，氯貝膽堿等。（三）M受體對(duì)胃腸道的研究狀況1） 作用機(jī)制M受體廣泛分布在全身各平滑肌中，包括胃腸道，它在維持全身平滑肌收縮狀態(tài)時(shí)起主要作用。分布在肌纖維膜上的M受體亞型主要為Ml和M2其中M2數(shù)量占75%-80%，但M3受體是主要的功能類(lèi)型。許多實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)離體的胃腸平滑肌束接觸M興奮劑時(shí)，所引起的收縮對(duì)M受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑敏感，這種現(xiàn)象與M3激活機(jī)制一致。這種情況可用下述機(jī)制解釋:M3受體與GQ家族的G蛋白耦聯(lián)，導(dǎo)致磷脂酶C活化、磷酸肌醇水解，促使三磷酸肌醇和1,2-二?；视退皆龈?從而引起鈣離子動(dòng)員，即肌漿網(wǎng)內(nèi)儲(chǔ)存鈣離子釋放，胞漿內(nèi)鈣離子增多，觸發(fā)平滑肌收縮。DG水平的增高可激活蛋白激酶C，而使其發(fā)生重分布至胞膜，產(chǎn)生磷酸化功能。在大多數(shù)情況下，M1,M3,M5亞型的磷酸肌醇反應(yīng)對(duì)PTX不敏感。而M2亞型與GI家族的G蛋白相互作用，介導(dǎo)PTX敏感性的針對(duì)CAMP聚集的抑制反應(yīng)。M2,M4受體也可通過(guò)直接耦聯(lián)GI,G0蛋白來(lái)介導(dǎo)內(nèi)向整流鉀通道的激活和神經(jīng)元鈣通道的抑制，這些離子反應(yīng)也表現(xiàn)為PTX敏感性。2） M受體在小腸的分布和介導(dǎo)作用1986年CHOO等采用放射配體法發(fā)現(xiàn)M2受體在回腸分布的高度優(yōu)勢(shì)傾向。此后，許多實(shí)驗(yàn)表明在小腸全層組織中均存在M2,M3受體，其中M2受體比例占多數(shù)，M3受體數(shù)量大約僅占M2受體1/4。比如，MICHEL等用】3H]-聯(lián)苯乙酰氧基甲基六氫吡啶（M3配體）選擇性標(biāo)記豚鼠回腸縱肌層內(nèi)的M3受體，發(fā)現(xiàn)M3受體密度較低。在豚鼠、大鼠、狗和人的在體、離體及單個(gè)平滑肌細(xì)胞眾多實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，M3受體是調(diào)節(jié)小腸平滑肌收縮的主要受體。有實(shí)驗(yàn)表明，M3受體特異性拮抗劑等對(duì)兔和豚鼠回腸的親和力與M3受體的活化一致。另外，選擇性M受體烷基化和脫敏實(shí)驗(yàn)也表明，M3受體在標(biāo)準(zhǔn)條件下介導(dǎo)回腸收縮，包括縱肌層和環(huán)肌層。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，M3受體是調(diào)節(jié)狗小腸移行性運(yùn)動(dòng)復(fù)合波的主要受體。這些實(shí)驗(yàn)的對(duì)象大多是全層平滑肌，而有人提出環(huán)肌和縱肌的收縮機(jī)制可能不一樣。SHI等在分別分析狗小腸環(huán)肌和縱肌實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，雖然M3受體是調(diào)節(jié)環(huán)肌收縮的主要受體，但M2,M3均參與縱肌的收縮，因?yàn)镸2受體拮抗劑在離體或在體實(shí)驗(yàn)中用較低濃度即可顯著抑制縱肌收縮，而對(duì)環(huán)肌無(wú)明顯影響。二、實(shí)施方案（包括實(shí)驗(yàn)的原理或技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)器材與藥品、具體操作過(guò)程、每個(gè)成員的具體分工、實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程安排等）實(shí)驗(yàn)原理1、激動(dòng)藥與拮抗藥.激動(dòng)藥(agonist)：與受體有親和力又有內(nèi)在活性藥物。完全激動(dòng)藥fullagonist):a=1部分激動(dòng)藥(partialagonist,mixedagonist):與受體有親和力，但內(nèi)在活性較弱(a<1)的藥物。.拮抗藥(antagonist)：與受體有親和力，而無(wú)內(nèi)在活性的藥物(a=0)。

競(jìng)爭(zhēng)性拮抗藥(competitiveantagonist)與激動(dòng)藥競(jìng)爭(zhēng)同一受體的拮抗藥。激動(dòng)藥的量效反應(yīng)曲線可以被競(jìng)爭(zhēng)性拮抗藥平行右移。非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗藥(noncompetitiveantagonist)與激動(dòng)劑作用于同一受體，結(jié)合牢固，分解慢或是不可逆的，或作用于相互關(guān)聯(lián)的不同受體。2、PA、PD2值22PA是一種用以表示競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑作用強(qiáng)度的指標(biāo)，其意義是能使激動(dòng)劑2提高到原來(lái)的2倍時(shí)，可產(chǎn)生與原來(lái)濃度相同效應(yīng)所需的拮抗劑克分子濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(B))。PA2的值越大說(shuō)明拮抗劑的作用越強(qiáng)。pA是拮抗參數(shù)(ant2agonismparameter)：當(dāng)有一定濃度的拮抗藥存在時(shí)，激動(dòng)劑增加2倍時(shí)才能達(dá)到原來(lái)效應(yīng)，此時(shí)拮抗藥的負(fù)對(duì)數(shù)即拮抗參數(shù)，pA=-log[I]=-logK2 IPD:是激動(dòng)劑與受體親和力的定量表示。按照Ariens的定義，PD是產(chǎn)22生50%最大效應(yīng)(E=l/2Emax)的摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log[D])。PD值越大，說(shuō)2明藥物和受體的親和力越大，藥效越強(qiáng)。計(jì)算方法與PA2相似實(shí)驗(yàn)材料乙酰膽堿(mol/L)：10-6、10-5、10-4、10-3、10-2阿托品(mol/L)：310-7臺(tái)氏液配制1000ml臺(tái)氏液含：NaCl8.0g、10%KCl2.0ml(0.2g) 、10%MgS04.7H202.6ml(0.26g) 、5%NaH2P04.2H2O1.3ml(0.065g)、NaHCO31.0g、1MCaCL21.8ml (0.2g)、葡萄糖1.0g。離體器官浴池及恒溫裝置、PowerLab系統(tǒng)、混合氣體(95%02+5%C02)、負(fù)荷500mg、加液器、培養(yǎng)皿、縫針、線、眼科鑷子、剪刀。【實(shí)驗(yàn)步驟】離體腸肌的制備猛擊豚鼠頭部至昏，立即剖開(kāi)腹腔，自幽門(mén)下5cm剪取空腸和回腸上段，迅速置于臺(tái)氏液液中。小心剪去腸系膜,用吸管吸取臺(tái)氏液液緩慢沖洗腸內(nèi)容物;將空腸段分割成2cm的小段備用，然后用縫針在腸段兩端各穿一根線，作為固定腸肌之用。實(shí)驗(yàn)裝置將制成的標(biāo)本一端固定于通氣鉤上，另一端連接于肌力換能器并接入PowerLab系統(tǒng)的橋式放大器上，浴池內(nèi)放20ml臺(tái)氏液液，加500mg負(fù)荷，恒溫37±1。C,浴池內(nèi)持續(xù)通入95%02與5%CO2的混合氣體。累積劑量一效應(yīng)曲線的制作實(shí)驗(yàn)裝置完畢以后，打開(kāi)PowerLab系統(tǒng)，按“操作指南”設(shè)置參數(shù)：選擇channel1記錄速度10/BridgeAmplifer中Qrang”選擇20mv，“LowPass”選擇50Hz調(diào)零“zero”描記腸肌收縮曲線，待收縮基線平穩(wěn)后，按下列(表6-2)次序在浴池中加入預(yù)先配好的不同分子濃度的乙酰膽堿。表6-2累積劑量法加藥順序累加次序藥液濃度(mol/L)藥液的毫升數(shù)(ml)每L中累積劑量(pmol)110-60.20.01210-60.40.03310-50.140.1410-50.40.3510-40.141610-40.43710-30.1410810-30.430910-20.141001010-20.4300隨藥液的依次加入，浴池內(nèi)藥物濃度不斷提高。每加入一個(gè)劑量后，約經(jīng)數(shù)秒鐘腸肌的收縮達(dá)高峰。應(yīng)在高峰未下降前，迅速加入下一個(gè)劑量。當(dāng)反應(yīng)到一定高峰，再遞增劑量，效應(yīng)不再增加，此時(shí)的效應(yīng)為最大效應(yīng)。阿托品拮抗乙酰膽堿的劑量一效應(yīng)曲線的制作放去浴池中的液體，用臺(tái)氏液液沖洗三次，以后每隔lOmin沖洗一次，共沖洗三次，再加入臺(tái)氏液液至20ml。待收縮基線平穩(wěn)后，加入阿托品3X10Tmol/L0.2ml，培育15min,再按“方法3”依次加入不同濃度的乙酰膽堿，便可得到有拮抗劑時(shí)乙酰膽堿的累積劑量效應(yīng)曲線，此時(shí)拮抗劑邙阿托品）摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)即pAx。【統(tǒng)計(jì)與處理】繪制累積劑量效應(yīng)曲線取方格紙，以腸肌收縮幅度（mv）作為縱坐標(biāo)即效應(yīng)（E），以藥物對(duì)數(shù)濃度（lgC）為橫坐標(biāo)，繪制量效曲線。KD值即達(dá)到50%最大效應(yīng)時(shí)，在橫坐標(biāo)上所對(duì)應(yīng)的藥物濃度。藥物的最大效應(yīng)（Emax）即曲線的高度。當(dāng)比較同類(lèi)藥物的Emax時(shí)，即比較曲線的高度（腸肌收縮最大幅度）。直線回歸（LR）計(jì)算參數(shù)為了正確求得各參數(shù)，必須將曲線直線化?？砂碊/R式（改良Lineweaver-Burk式）使劑量效應(yīng)曲線直線化。[D]K 1曠+ [D]K 1曠+ [D]E(a)EE(y)maxmax(b)(x)式中：D為藥物劑量（濃度），E為某一劑量的效應(yīng)，KD為藥物的解離常數(shù),Emax為藥物的最大效應(yīng)。以［D］/E為縱坐標(biāo)，［D］為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸。截距a=E按直線公式y(tǒng)=a+bx，則—LogKD即pD2斜率b=

1E =—max ba K= xE =Kb E max Dmax根據(jù)公式pA2=pAx+log(x-1),用拮抗劑后與用拮抗劑前KD之比。式中pAx為拮抗劑摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，x為x實(shí)驗(yàn)安排2009/11/2-2009/11/20制定實(shí)驗(yàn)方案，并對(duì)方案進(jìn)仃陳述2009/11/30-2009/12/1根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料2009/12/2?2009/12/3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)2009/12/4統(tǒng)計(jì)結(jié)果及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)2009/12/5-2009/12/8實(shí)驗(yàn)總結(jié)及撰寫(xiě)報(bào)告四、參考文獻(xiàn)葛建國(guó).不合理用藥實(shí)例分析.中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥