【生物課件】植物DNA、RNA及蛋白提取與分析互聯(lián)網(wǎng)資料

1/1【生物課件】植物DNA、RNA及蛋白提取與分析-互聯(lián)網(wǎng)資料

植物DNA、RNA及蛋白的提取與分析

植物DNA提取

DNA提取原則

保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性排解有機溶劑和金屬離子的污染排解其它核酸分子的污染蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度純化后不應(yīng)存在對酶抑制性的物質(zhì)

植物DNA提取的方法

CTAB法SDS法煮提法

--植物DNA提取的經(jīng)典方法

DNA提取的基本步驟

材料的預(yù)備(新奇或冷凍保存)細(xì)胞的裂解(液氮研磨，釋放內(nèi)容物)DNA的分別與純化(酚氯仿抽提)DNA的沉淀與洗滌(2V無水乙醇或2/3V異丙醇)DNA的干燥與溶解(ddH2O或TE)

CTAB法流程植物材料裂解液沉淀

液氮研磨

抽提

離心洗滌

細(xì)胞裂解

上層溶液

干燥溶解

CTAB提取液主要成分CTAB:十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇或異丙醇沉淀即可使核酸分別出來。

Tris-HCl(pH8.0):供應(yīng)一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。EDTA:螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性。NaCl:供應(yīng)一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中。

CTAB法步驟1.取約0.1g的水稻葉片在液態(tài)中磨成粉末，將適量的粉末材料轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中。2.加入600l預(yù)熱(95℃)的1.5CTAB緩沖液，然后65℃溫浴20~60min。3.取出EP管，冷卻后加入600l氯仿:異戊醇(24:1)混合勻稱，然后10000rpm離心10min,取出后吸取上清液到另一新的EP管中。4.加入2/3V異丙醇或2V無水乙醇混合勻稱，冰浴至DNA絲狀物消失。5.略微離心沉淀DNA,倒掉上清液。6.加入600l75%乙醇洗滌，放臵30min。7.倒掉上清液，室溫下吹干DNA。8.加入100lTE溶解DNA。9.取5-10ul電泳檢測提取效果10.-20℃下貯存?zhèn)溆?/p>

留意事項

1.全部用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。2.全部試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。3.在提取過程，應(yīng)盡量在溫柔的條件下操作,如盡量削減酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩,以保證得到較長的DNA。

DNA的質(zhì)量檢測

電泳帶型單一無拖尾現(xiàn)象點樣孔無殘留雜質(zhì)OD值測定DNA純品的OD260/OD280為1.8,若比值較高說明含有RNA,比值較低說明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。

植物RNA提取

分別RNA的目的

RT-PCRNorthernblot構(gòu)建cDNA文庫GeneChips體外翻譯

RNA提取的關(guān)鍵--防止RNase降解RNA

試驗失敗的主要緣由是RNA酶的污染。RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要幫助因子。討論人員的手、唾液、灰塵、器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、各種試劑及各種組織

和細(xì)胞中。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在試驗中，一方面要嚴(yán)格掌握外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。

防止RNase污染的措施1.耐高溫的器具(如玻璃制品、研缽、剪刀、鑷子等)于180℃下干烤8h2.塑料耗材(Tip、EP管等)用0.1%的DEPC水浸泡過夜，然后高壓，再烤干備用3.試驗用的氯仿、乙醇為RNA專用，水為DEPC處理水4.使用有效的RNase抑制劑：如異硫氫酸胍、RNasin5.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制6.試驗過程需帶一次性塑料手套且常常更換7.設(shè)臵RNA操作專用試驗室，全部器械等應(yīng)為專用。留意：DEPC有致癌之嫌，必需當(dāng)心操作，防止接觸與吸入！

常用的RNase抑制劑

DEPC(焦磷酸二乙酯):是一種劇烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。異硫氫酸胍∶目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有劇烈的變性作用。RNasin(RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑)一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活氧釩核糖核苷復(fù)合物:由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有肯定抑制作用。

分別總RNA的方法1.胍鹽法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和-巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經(jīng)酚氯仿抽提后再沉淀。2.氯化鋰沉淀法：由于鋰在在肯定pH下能使RNA相對特異地沉淀，但簡單使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對mRNA有抑制作用。3.苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA。

TRIReagent提取總RNATRIReagent含有異硫氰酸胍和苯酚，能夠有效溶解RNA,DNA和蛋白質(zhì)。在加入氯仿并離心后，上層水相中含有RNA。水相的RNA經(jīng)過沉淀和洗滌后幾乎沒有DNA或者蛋白質(zhì)污染

TRIReagent提取步驟1.研缽研杵預(yù)冷后,加入少量樣品用液N快速研磨成冰粉狀2.將樣品(樣品量不超過100mg)移入1.5mlEP管中,快速加入1mlTRIReagent混勻,室溫靜臵5min3.加0.2ml氯仿,猛烈振蕩15S,室溫靜臵10min4.4℃,120

00g,15min;取上清于另一EP管中，加0.5ml異丙醇混勻，室溫靜臵10min5.4℃,12000g,8min;去上清，加1ml75%乙醇，渦漩沉淀6.去75%乙醇，室溫晾干5~10min7.加30~50ulDEPC-H2O溶解8.電泳檢測提取的RNA質(zhì)量

留意事項

材料新奇，冷凍材料切忌反復(fù)凍融，如要多次提取，分成多份保存(液氮長期保存，-70℃短期保存)先用液氮研磨植物材料，研