某大學(xué)《基因工程》課程考試試卷(含答案)

PAGE第1頁(yè)共1頁(yè)院系：________________專業(yè)班級(jí)：______________姓名：院系：________________專業(yè)班級(jí)：______________姓名：_________學(xué)號(hào)：_______裝訂線適用專業(yè)試卷所需時(shí)間試卷總分100分考試日期開(kāi)卷/閉卷成績(jī)一、名詞解釋（共10小題，每小題1分，共10分）1、粘性末端2、基因工程3、質(zhì)粒的不相容性4、基因組文庫(kù)5、克隆(clone)6、電擊轉(zhuǎn)化法7、重組PCR8、限制性酶切圖譜法9、質(zhì)粒10、重組率的定義二、填空題（共10小題，每小題1分，共10分）1、在基因克隆中堿性磷酸單酯酶的主要用途有：A、在用P標(biāo)記DNA5′端之前；B、在DNA重組技術(shù)中，去除DNA片段的，可防止酶切后的載體的與。2、載體的功能是運(yùn)送高效轉(zhuǎn)入；為外源基因提供能力或能力；為外源基因的或提供必要的條件。三、簡(jiǎn)答題（共10小題，每小題4分，共40分）1、載體應(yīng)具備的條件是什么？2、受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件？3、藍(lán)白斑篩選原理是什么？4、PCR克隆目的基因的基本程序是什么？5、酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)是什么？6、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記是什么？7、λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)是什么？8、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)特征及優(yōu)勢(shì)是什么？9、融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則是什么？10、分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建策略是什么？四、論述題（1-2每小題8分，3-4題每小題12分，共40分）1、論述PCR原理及引物設(shè)計(jì)的基本原則。2、強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性是什么？3、請(qǐng)論述λ-DNA載體的構(gòu)建策略是什么。4、請(qǐng)論述植物基因工程的共整合轉(zhuǎn)化程序和二元整合轉(zhuǎn)化程序及二元整合轉(zhuǎn)化程序的特征。院系：________________專業(yè)班級(jí)：______________姓名：_________學(xué)號(hào)：_______院系：________________專業(yè)班級(jí)：______________姓名：_________學(xué)號(hào)：_______裝訂線院系：________________專業(yè)班級(jí)：______________姓名：_________學(xué)號(hào)：_______裝訂線適用專業(yè)試卷所需時(shí)間試卷總分100分考試日期開(kāi)卷/閉卷成績(jī)一、名詞解釋（共10小題，每小題1分，共10分）1、粘性末端因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上不同（對(duì)稱）酶切后形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個(gè)粘性末端很容易通過(guò)互補(bǔ)堿基的配對(duì)而重新連接起來(lái)。2、基因工程指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過(guò)程。3、質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。4、基因組文庫(kù)將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫(kù)，它包含了該生物的所有基因。5、克隆(clone)作名詞時(shí)指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無(wú)性繁殖系，作動(dòng)詞時(shí)是指基因的分離與重組過(guò)程。6、電擊轉(zhuǎn)化法酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過(guò)程中應(yīng)避免使用PEG，它對(duì)受電擊的細(xì)胞具有較很大的負(fù)作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105/mgDNA。7、重組PCR在兩個(gè)PCR擴(kuò)增體系中,兩對(duì)引物分別由其中之一在其5’-端和3’-端引物上帶上一段互補(bǔ)的序列,混合兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)變性和復(fù)性,兩組PCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng),產(chǎn)生一個(gè)包含兩個(gè)不同基因的雜合基因。8、限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。9、質(zhì)粒質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。10、重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%，重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化DNA重組的后續(xù)操作。二、填空題（共10小題，每小題1分，共10分）1、在基因克隆中堿性磷酸單酯酶的主要用途有：A、在用P標(biāo)記DNA5′端之前，去除5′端的磷；B、在DNA重組技術(shù)中，去除DNA片段的5′磷酸集團(tuán)，可防止酶切后的載體的自身連接與環(huán)化。2、載體的功能是運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。三、簡(jiǎn)答題（共10小題，每小題4分，共40分）1、載體應(yīng)具備的條件是什么？具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)；具有較高的外源DNA的載裝能力；具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)；具有合適的篩選標(biāo)記。2、受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件？限制性缺陷型外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重組整合缺陷型，用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-）具有較高的轉(zhuǎn)化效率，具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型，感染寄生缺陷型，防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外。3、藍(lán)白斑篩選原理是什么？Amoresophisticatedprocedurecanbecarriedoutonasingletransformationplate;Bluewhitescreening;InvolvestheinsertionalinavtivationofthegenelacZ.lacZ’:編碼-半乳糖苷酶a-肽N端，TheinsertionofaDNAfragmentinterruptstheORF（開(kāi)放閱讀框）oflacZ’gene,resultinginnon-functionalgeneproductthatcannotdigestitssubstratex-gal。4、PCR克隆目的基因的基本程序是什么？由TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是A，因?yàn)門(mén)aqDNA聚合酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門(mén)的T5、酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)是什么？全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便；具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)；大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉；能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中；不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）；酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物。6、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記是什么？含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補(bǔ)。含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（hprt-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補(bǔ)。7、λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)是什么？λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌，λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量，重組λ-DNA分子的篩選較為方便，重組λ-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便，λ-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因。8、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)特征及優(yōu)勢(shì)是什么？巴斯德畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長(zhǎng)迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)。由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有20余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。9、融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則是什么？受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過(guò)于接近，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件，兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架。10、分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建策略是什么？包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中，這一過(guò)程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)上的磷酸酯酶，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。因此，只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適的質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型的受體細(xì)胞。此時(shí)，用另一種攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞，并使用相同性質(zhì)的啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，則可實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。四、論述題（1-2每小題8分，3-4題每小題12分，共40分）1、論述PCR原理及引物設(shè)計(jì)的基本原則。答案要點(diǎn)：PCR是在體外擴(kuò)增DNA序列的方法，原理并不復(fù)雜，首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。包括：DNA解鏈（變性）、引物與模板DNA結(jié)合（退火）DNA合成（延伸）三步，可以被不斷重復(fù)。2、強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性是什么？外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過(guò)長(zhǎng)的mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗；更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。3、請(qǐng)論述λ-DNA載體的構(gòu)建策略是什么。1）λ-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度，野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的（除去非必需區(qū)段，除去左右兩臂必要區(qū)域中的限制位點(diǎn)代以ＭＣＳ，插入選擇位點(diǎn)如Ｌac）。根據(jù)切除的多少，可將λ-DNA分成兩大類載體：插入型載體，取代型載體。2）λ-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)，野生型的λ-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)，同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)。3