PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測

PikoReal熒光定量PCR使用培訓(xùn)

－致病菌檢測

內(nèi)容：1、熒光定量PCR根本原理介紹2、PikoReal功能簡介3、致病菌檢測實驗操作及結(jié)果分析PCR和定量PCR

——根本知識介紹

生命的遺傳物質(zhì)DNA〔少數(shù)物種為RNA〕，對于不同的物種來說，其堿基排列順序是獨一無二的檢測不同生物中特異的DNA片段，就可以清楚的區(qū)分不同的生物。中心法那么堿基配對原那么PolymeraseChainReaction〔PCR〕——聚合酶鏈?zhǔn)椒错戵w外的DNA復(fù)制PCR反響體外RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNART-PCR反響通過PCR或RT-PCR反響，就可累計大量的特異性目的片段，用于下游的檢測和研究Melting94CPrimersBind58CExtension72CPCR的根本原理PCR的根本原理PolymeraseChainReaction〔PCR〕——聚合酶鏈?zhǔn)椒错懺赑CR反響過程中，升溫，降溫交替進(jìn)行，循環(huán)往復(fù)——熱循環(huán)提供熱循環(huán)環(huán)境的儀器——熱循環(huán)儀〔PCR儀〕TemperatureTimeMeltAnnealCopyMeltAnnealCopyCycle1Cycle2PCR的根本原理模板〔DNAorRNA〕DNA：從animal,plant,bacteria,yeast,virus中抽提RNA：抽提后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(也在PCR儀上完成〕引物〔一對或多對〕脫氧核糖核苷酸(dNTP原料)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶Buffer〔緩沖液提供適合的酶作用環(huán)境〕反響體系：5-50ul〔常用〕PCR的根本原理PCR反響體系PCRkitPCR的根本原理PCR實驗流程圖:A模板，引物,dNTP,緩沖液,DNA聚合酶上樣PCR反響PCR的根本原理PCR實驗流程圖:B+-PCR產(chǎn)物電泳，EB染色兩種產(chǎn)物兩對特定引物擴(kuò)增的片段多種產(chǎn)物非特異性引物擴(kuò)增出一系列片段PCR實驗流程圖:CPCR的根本原理凝膠成像系統(tǒng)成像，定終產(chǎn)物濃度–半定量PCR是當(dāng)今應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù)之一幾乎所有的分子生物學(xué)實驗室，藥物研發(fā)中心，臨床診斷實驗室都在使用PCR技術(shù)，而且還有新的應(yīng)用方向不斷開發(fā)出來幾個重要的應(yīng)用領(lǐng)域:

科學(xué)研究

醫(yī)學(xué)研究及診斷

法醫(yī)鑒定

食品檢驗PCR應(yīng)用

PCR技術(shù)的優(yōu)點與缺點缺點：擴(kuò)增與檢測分開進(jìn)行→

繁瑣使用熒光染料EB檢測DNA→有毒不同實驗室之間結(jié)果沒有可比性通量太低擴(kuò)增檢測

PCR技術(shù)的優(yōu)點與缺點缺點：很難準(zhǔn)確得到樣本內(nèi)模板DNA或RNA的量終點的產(chǎn)物量不一定能如實反響和起始模板量的對應(yīng)關(guān)系相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖PCR反響進(jìn)入平臺期，合成新鏈的原料開始缺乏，酶的活力也下降，導(dǎo)致新增DNA的量增長緩慢，最后停止增長。熒光定量PCR——根本原理——熒光染料和探針——應(yīng)用介紹光源熒光定量PCR——根本原理熱循環(huán)儀探測器可以實時檢測出每輪循環(huán)的PCR產(chǎn)物量參加熒光染料的PCR體系模板，引物,dNTP,緩沖液,DNA聚合酶和熒光探針或熒光染料在體系中原料充足的情況下，產(chǎn)物按固定倍數(shù)呈指數(shù)增長指數(shù)增長期間，初始模板濃度不同的樣品的擴(kuò)增曲線彼此平行同時擴(kuò)增梯度稀釋的同一樣品〔濃度〕擴(kuò)增曲線循環(huán)數(shù)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關(guān)系Cq熒光定量PCR——根本原理未知濃度樣品Cq

=-klgX0+b

標(biāo)準(zhǔn)曲線：區(qū)別：普通PCR：可以粗略定出反響結(jié)束時終產(chǎn)物的量-半定量熒光定量PCR儀：可以精確測量出初始模板量熒光定量PCR——熒光染料和探針非特異性的熒光染料

SYBRGreenI

特異性的熒光探針

TaqMan

SYBR-GreenI5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission非特異性熒光染料–SYBR-GreenSYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission非特異性熒光染料–SYBR-Green融解曲線分析〔Tm〕非特異性熒光染料–SYBR-GreenTm：50%的DNA產(chǎn)物解鏈時的溫度一種DNA片段只有一個特定的Tm，所以通過溶解曲線分析，可以檢驗擴(kuò)增的產(chǎn)物是否是目的片段Tm非特異性熒光染料–SYBR-Green應(yīng)用列舉：酵母菌檢測根據(jù)Tm值判斷是否是酵母菌RQSequenceSpecificProbes:Taqmanprobes5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation特異性熒光探針–Taqmanprobes

特異性熒光探針–Taqmanprobes

常用的標(biāo)記探針的染料：第一通道：FAM第二通道：HEX第三通道：Rox第四通道：CY5致病微生物：沙門氏菌金黃色葡萄球菌單核細(xì)胞增生李斯特氏桿菌腸毒素大腸桿菌阪崎腸桿菌彎曲桿菌〔禽類〕肉毒梭菌志賀氏菌小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌副溶血弧菌創(chuàng)傷弧菌等均能把3-5天的檢測時間縮短到一天之內(nèi)特異性熒光探針–Taqmanprobes

單重和多重?zé)晒舛縋CR單通道〔單色〕：一個PCR管里只做一個基因定量〔多用SybrGreen〕雙通道〔兩色〕：一個PCR管里做兩個基因的定量多通道〔多色〕：一個PCR管里做三個以上基因定量常用FAMHEXPikoReal功能簡介研發(fā)生產(chǎn)中心：位于芬蘭Espoo光源:5xLED壽命長，終身無需更換，為qPCR實驗提供持續(xù)，穩(wěn)定的激發(fā)信號無需使用ROX染料進(jìn)行光強(qiáng)校正探測器：CCD相機(jī)能同時快速收集整板多重?zé)晒庑盘枖?shù)據(jù)高靈敏度PCR模塊：96孔半導(dǎo)體PCRPikoREAL的硬件系統(tǒng):功能：絕對定量雙探針法HRM法相對定量基因型分析熔解曲線分析選配模塊五通道四色：激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)預(yù)校正的染料475–500520–550FAM,SYBRGreen515–535557–590HEX,YakimaYellow570–590615–650ROX,TexasRed600–640666–740Cy5475–500520–590單色通道，HRM通道一個反響管里最多可同時檢測4種不同的致病菌核酸儀器特點：1、硬件組合優(yōu)越，設(shè)計創(chuàng)新2、更加適合5-10ul小反響體系，成倍節(jié)省實驗本錢3、小巧、快速、穩(wěn)定、安靜無聲

致病菌檢測實驗操作及結(jié)果分析檢測流程25g或25ml樣品＋225ml預(yù)增菌培養(yǎng)液，混勻，適宜的溫度下培養(yǎng)24小時取1ml培養(yǎng)液，參加裂解液，裂解細(xì)菌，釋放核酸〔45min〕配制標(biāo)準(zhǔn)品，PCR反響液，加樣〔30min〕定量PCR反響，查看并分析結(jié)果〔1.5h〕陰性：出結(jié)果報告陽性：繼續(xù)用培養(yǎng)法驗證結(jié)果兩天內(nèi)可出結(jié)果檢測項目

GB中的名稱OXOID的英文名稱OXOID的中文名稱OXOID貨號規(guī)格沙門氏菌緩沖蛋白胨水（BPW）BufferPeptoneWater(ISO)緩沖蛋白胨水(ISO)CM1049B500gCM1049R2.5kgCM1049T5kg金葡菌10%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯TryptoneSoyaBroth（Soybean

CaseinDigestMediumUSP）胰蛋白胨大豆肉湯（美國藥典中大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基）CM0129B500gCM0129R2.5kgCM0129T5kg大腸埃希氏菌O157：H7/NM改良EC肉湯ECBROTH(ReducedBileSalts)EC肉湯（減少膽鹽）CM0990B500g志賀氏菌GN增菌液GNBrothGN增菌液R453511100gR453512500gR4535142.5kgOXOID常用預(yù)增菌培養(yǎng)液：賽默飛咨詢熱線：800－810－51181、預(yù)增菌－按說明書操作2、細(xì)菌裂解，配制反響液及上樣1〕細(xì)菌裂解：獲得待測樣品。2〕配制標(biāo)準(zhǔn)品：陰性對照樣品，陽性對照樣品〔4個濃度〕3〕按檢測樣品量計算所需反響液的量4〕配制所需反響液，混合均勻5〕把反響液參加反響板，并分別在相應(yīng)的孔參加陰性對照樣品、陽性對照樣品，待測樣品。以下操作均按照檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行：檢測試劑開放，可選擇各國產(chǎn)及進(jìn)口廠家試劑盒

以金黃色葡萄球菌的檢測為例1、樣品預(yù)增菌25g或25ml樣品＋10%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯37度，24小時金黃色葡萄球菌：StaphylococcusAureus(SA)

以金黃色葡萄球菌的檢測為例2、細(xì)菌裂解，樣品制備A、取1ml培養(yǎng)液，13000rpm離心2分鐘B、去上清液，參加100ulDNA提取液充分混勻C、沸水浴加熱10分鐘〔誤差不超過1分鐘〕D、13000rmp離心5分鐘，上清液備用〔樣品〕試劑盒：Liferiver金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒〔熒光法〕生產(chǎn)商：上海之江生物科技貨號：DD－0041－023、梯度標(biāo)準(zhǔn)品配制A、內(nèi)部對照：取內(nèi)部對照品4ul，加36ul水，震蕩混勻后，3000rmp離心10秒，備用。B、10倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品〔如只需出陰陽性結(jié)果，那么無需配制系列濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品〕1〕取4只2ml離心管，分別標(biāo)記為：2、3、4、5〔濃度依次為：5×106、5×105、5×104、5×103拷貝/ml)。2〕各管中分別參加36ul水3〕取4ul陽性對照品參加1號管中，震蕩混勻后取4ul參加2號管，2號管震蕩混勻后取4ul參加3號管。依此處理4號管。4、反響液配制1〔絕對定量法用)計算所需各反響液成分，按下表量參加2ml離心管，震蕩混合均勻絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品：5(5個濃度，可定量出未知樣品拷貝數(shù)〕陰性對照：1未知樣品：n〔n為未知樣品數(shù)〕成分需要量（ul）SA核酸熒光PCR檢測反應(yīng)液（6＋n）×17.5ul×110％酶（Taq＋UNG）（6＋n）×0.2ul×110％內(nèi)部對照（6＋n）×0.5ul×110％×110％是指多配10％，以補(bǔ)償配制和加樣過程中的損耗如每個樣品需要做2個或3個重復(fù)，那么在各算式后再乘2或3即可4、反響液配制1(陰陽性判定法用)計算所需各反響液成分，按下表量參加2ml離心管，震蕩混合均勻，3000rmp離心10秒，備用。絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品：1(1個濃度，作為陽性參照〕陰性對照：1未知樣品：n〔n為未知樣品數(shù)〕成分需要量（ul）SA核酸熒光PCR檢測反應(yīng)液（2＋n）×17.5ul×110％酶（Taq＋UNG）（2＋n）×0.2ul×110％內(nèi)部對照（2＋n）×0.5ul×110％×110％是指多配10％，以補(bǔ)償配制和加樣過程中的損耗如每個樣品需要做2個或3個重復(fù)，那么在各算式后再乘2或3即可5、上樣A、取一片96孔Piko板，放入上樣輔助儀，每孔參加反響液18ulB、取裂解的樣品，參加un孔，每種樣品1孔；取稀釋號的標(biāo)準(zhǔn)品，依次參加最后一列的孔中。在0孔中參加2ul水。unununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSununununununununununununununun0樣品排列建議：S-陽性標(biāo)準(zhǔn)品、0–陰性對照、un–未知樣品

6、覆膜，離心，放入qPCR7、設(shè)置程序，點擊Run啟動PCR反響編程雙擊桌面儀器圖標(biāo)，翻開軟件2、點擊New，新建一個運(yùn)行文件，點擊Protocol，進(jìn)入程序編輯界面編程選中以上各步，可以修改，添加和刪除反響步驟點擊反白不需要檢測的染料，輸入反響體系。編程添加新循環(huán)添加溶解曲線檢測上下移動或刪除反響步驟輸入或輸出反響程序開始運(yùn)行程序添加一個反響步驟添加數(shù)據(jù)采集步驟編程參數(shù)修改左邊選中要修改的步驟，右邊相應(yīng)的框中修改溫度和時間如要修改升降溫速率，熱蓋溫度，點擊“AdvancedProperties〞點擊Run啟動PCR反響狀態(tài)監(jiān)控電腦監(jiān)控隨時可以點擊HOME，回主界面編輯新程序，分析已有實驗結(jié)果?；蜻M(jìn)入PlateLayout進(jìn)行板式設(shè)置。8、板布局點擊PlateLayout，進(jìn)入板布局界面，定位樣品，輸入名稱，確定樣品屬性。-程序運(yùn)行前，運(yùn)行中，運(yùn)行