清咽潤喉檢驗方法

清咽潤喉檢驗方法1動物實驗1.1大鼠棉球植入實驗1.1.1實驗原理采用棉球作為異物植入動物局部皮下，可引起與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽組織增生。比較給予受試樣品后，實驗組動物與對照組動物肉芽腫重量的差異，以確定受試樣品是否具有干預慢性炎癥（肉芽腫形成）的作用。1.1.2實驗動物推薦使用成年雄性大鼠，體重150－220克。每組8－12只。1.1.3劑量分組及受試樣品給予時間實驗設三個劑量組和一個空白對照組，三個劑量組中應包括一個人體推薦量5倍的劑量組，必要時設陽性對照組。受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天。1.1.4儀器和材料手術(shù)器械、恒溫干燥箱、分析天平、注射器、乙醚（或異氟烷）、碘伏、脫脂棉、脫毛器1.1.5實驗步驟1.1.5.1棉球的處理將脫脂棉制成約20~25mg緊致的小棉球，經(jīng)高壓滅菌后，置恒溫干燥箱60℃干燥3h，取出無菌條件下稱重，干燥保存，備用。1.1.5.2肉芽腫的形成和測定實驗結(jié)束前8天，用脫毛器脫去大鼠兩側(cè)腹股溝處的毛，乙醚（或異氟烷）淺麻醉大鼠，碘伏消毒，在無菌條件下切開大鼠兩側(cè)腹股溝皮膚，植入備用的棉球，縫合切口，繼續(xù)給予受試物。實驗結(jié)束當天，給受試物1小時后，斷頸處死大鼠，在原縫合處剪開皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，置于已稱重潔凈平皿中，恒溫干燥箱60℃開蓋干燥1小時后稱重，計算肉芽腫凈量。肉芽腫凈量（mg）＝干燥后棉球肉芽腫重量－原棉球重量1.1.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需先進行方差齊性檢驗，方差齊，則計算F值。若F值<F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無顯著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05結(jié)論為各組均數(shù)間差異有顯著性，需進一步使用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計分析。對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)需進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)分布或方差齊的要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；若經(jīng)變量轉(zhuǎn)換仍不能達到正態(tài)分布或方差齊的目的，則改用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。結(jié)果判定：實驗組與空白對照組比較，肉芽腫凈量明顯下降，經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性，可判定該受試樣品大鼠棉球植入實驗結(jié)果陽性。1.1.7注意事項1.1.7.1所用棉球重量及表面積對實驗結(jié)果影響較大，故在實驗中，應盡可能保證所用棉球重量和表面積近似。1.1.7.2盡量使手術(shù)切口的大小一致，以減少差異。1.1.7.3植入棉球后，將切口縫合牢固，以免在實驗過程中棉球脫落，影響實驗結(jié)果。1.2大鼠足趾腫脹實驗1.2.1實驗原理一定量致炎劑注入大鼠后肢足趾皮下，可造成足趾腫脹。測定足趾容積，比較致炎劑作用前后實驗組和對照組足趾容積的變化，以確定受試樣品是否具有干預急性炎癥（足趾腫脹）的作用。1.2.2實驗動物1.2.3劑量分組及受試樣品給予時間1.2.4儀器和材料：致炎劑（推薦使用葡聚糖4萬）、足趾容積測量儀、無菌蒸餾水、0.25mL注射器。1.2.5實驗步驟1.2.5.1致炎劑的配制用無菌蒸餾水配制濃度為1%的葡聚糖4萬，備用。1.2.5.2足趾腫脹及測定實驗結(jié)束當天再給受試樣品一次，1小時后，用足趾容積測量儀測量各組大鼠右后足趾的容積，作為0小時足趾容積。然后在大鼠右后足趾皮下注入1%葡聚糖4萬0.1mL/只，分別于1、2、4、6小時測量大鼠足趾的容積，同一部位測量3次，取平均值。以不同時間所測足趾容積與致炎劑作用前的足趾容積之差為腫脹值，計算各個時間段的足趾腫脹率。腫脹率（%）=腫脹值／致炎前足趾容積×100%1.2.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需先進行方差齊性檢驗，方差齊，則計算F值。若F值<F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無顯著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05結(jié)論為各組均數(shù)間差異有顯著性，需進一步使用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計分析。對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)需進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)分布或方差齊的要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；若經(jīng)變量轉(zhuǎn)換仍不能達到正態(tài)分布或方差齊的目的，則改用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。結(jié)果判定：實驗組與空白對照組比較，任一時間點刺激前后足趾容積腫脹率明顯減少，差異有顯著性，可判定該受試樣品大鼠足趾腫脹實驗結(jié)果陽性。1.2.7注意事項1.2.7.1致炎劑注入的質(zhì)量對實驗結(jié)果影響很大，注入致炎劑時，應將動物后肢拉直，從右后足掌心向踝關(guān)節(jié)方向皮下注射致炎劑，并應盡可能使動物不動。建議由專人負責致炎劑的注射，以保證實驗結(jié)果的一致性。1.2.7.2測量足趾容積時，嚴格按儀器說明操作。注意應在鼠足某處用記號筆畫線作為測量標線，將鼠足緩緩放入測量筒內(nèi)，當水平面與鼠足上的測量標線重疊時，踏動腳踏開關(guān)，記錄足趾容積，用吸水紙擦干鼠足上的水后，分別再進行第2次和第3次測定。為避免測量誤差，測定人員應事先進行訓練，掌握將鼠足放入測量筒內(nèi)的最佳方式，每個樣品的測量最好由專人進行。1.2.7.3每次測定的部位要固定。1.3小鼠耳腫脹實驗1.3.1實驗原理二甲苯為無色澄清液體，涂抹于小鼠耳廓后，由于其刺激作用，可引起鼠耳局部毛細血管充血，通透性增加，導致急性炎癥。比較實驗組和對照組二甲苯作用后耳腫脹率的差異，以確定受試樣品是否具有干預急性炎癥（小鼠耳腫脹）的作用。1.3.2儀器和材料直徑9mm打孔器、致炎劑（二甲苯）、微量加樣器、分析天平1.3.3實驗動物推薦使用近交系雄性小鼠，體重18－22克，每組10－15只。1.3.4劑量分組及受試樣品給予時間實驗設三個劑量組和一個空白對照組，三個劑量組中應包括一個人體推薦量10倍的劑量組，必要時設陽性對照組。受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天。1.3.5實驗步驟汲取二甲苯20μL，滴加在小鼠右耳外側(cè)面耳廓的中央，讓其自由擴散，30分鐘后，將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用9mm直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱重，以兩耳重量之差為耳廓腫脹值，計算耳廓腫脹率。耳廓腫脹率（%）=耳廓腫脹值／對照耳片重量×100%1.3.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需先進行方差齊性檢驗，方差齊，則計算F值。若F值<F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無顯著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05結(jié)論為各組均數(shù)間差異有顯著性，需進一步使用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計分析。對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)需進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)分布或方差齊的要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；若經(jīng)變量轉(zhuǎn)換仍不能達到正態(tài)分布或方差齊的目的，則改用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。結(jié)果判定：實驗組與空白對照組比較，耳廓腫脹率明顯減少，差異有顯著性，可判定該受試樣品小鼠耳腫脹實驗結(jié)果陽性。1.3.7注意事項1.3.7.1二甲苯具有對眼及上呼吸道有刺激作用，操作時，操作者應注意自身的防護。1.3.7.2打下的耳片應及時稱重，以避免水分失去而影響實驗結(jié)果的準確性。1.4結(jié)果判定大鼠棉球植入實驗結(jié)果陽性，同時大鼠足趾腫脹實驗或小鼠耳腫脹實驗結(jié)果任意一項陽性，可判定該受試樣品清咽潤喉動物實驗結(jié)果為陽性。2人體試食試驗2.1受試者納入標準2.1.1體征：慢性咽炎人群，主觀癥狀有咽痛、咽癢、咽干、干咳、異物感、多言加重等。2.1.2咽部癥狀：咽部粘膜水腫、粘膜充血、咽后壁淋巴濾泡增生、分泌物附著。具有2.1.1及2.1.2中至少一項檢查所見的自愿受試者，即可納入觀察。2.2受試者排除標準2.2.1慢性咽炎急性發(fā)作期或急性咽炎、聲帶結(jié)節(jié)、感冒或吸煙因素所致者。2.2.2鼻咽、咽、喉、鼻、喉、食管、頸部及結(jié)核、轉(zhuǎn)移性肺癌病變所致者。2.2.3年齡在18歲以下或65歲以上者，妊娠和哺乳期婦女及對受試產(chǎn)品過敏者。2.2.4合并有心、腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)、支氣管和肺等嚴重疾病及精神病患者和有睡眠疾病的患者。2.2.5短期內(nèi)已服用與受試功能有關(guān)的物品，影響到對結(jié)果的判斷者。2.2.6未按規(guī)定服用受試樣品或中途加服其它藥物，無法判斷功效或資料不全者。2.3試驗設計及分組要求采用自身和組間兩種對照設計。按受試者的咽部癥狀、體征隨機分為試食組和對照組，分組時盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如病程、年齡、性別等，進行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.4受試樣品的劑量和使用方法試食組按推薦服用方法和服用量每日服用受試產(chǎn)品，對照組可服用安慰劑或采用空白對照，也可使用具有清咽潤喉的保健食品作為對照。受試樣品給予時間15天~30天。試驗期間受試者不改變生活、工作環(huán)境，不改變原來生活、飲食習慣。2.5觀察指標2.5.1安全性指標2.5.1.1一般狀況（包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等）2.5.1.2血、尿、便常規(guī)檢查2.5.1.3肝、腎功能檢查2.5.1.4胸片、心電圖、腹部B超檢查（試驗前檢查一次）2.5.2功效性指標2.5.2.1癥狀觀察準確記錄受試者試食前后的咽部主觀癥狀，主要咽部癥狀包括：咽痛、咽癢、咽干、干咳、異物感多言加重等，按癥狀輕重計算積分（1度—1分，2度—2分，3度—3分統(tǒng)計積分變化和癥狀改善率。2.5.2.2體征觀察咽部檢查：咽部粘膜充血、粘膜水腫、咽后壁淋巴濾泡增生、分泌物等體征。按檢查結(jié)果的輕、中、重分為I、II、III級，分別記錄試食前后體征變化，計算體征積分和改善率。觀察指標功效判定：有效：癥狀減輕1度，咽部體征檢查結(jié)果減輕I級無效：癥狀、體征均無明顯改變2.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定積分變化可用t檢驗進行分析。凡自身對照資料可以采用配對t檢驗，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗，后者需進行方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進行t檢驗；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t’檢驗或秩和檢驗；但變異系數(shù)太大