對電離輻射危害有輔助保護作用檢驗方法

對電離輻射危害有輔助保護作用檢驗方法1外周血白細胞計數(shù)實驗1.1原理外周血白細胞數(shù)減少是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一定范圍內(nèi)，照射劑量與外周血中白細胞數(shù)成反比，恢復(fù)時間與外周血中白細胞數(shù)成正比，外周血中白細胞數(shù)可代表血液系統(tǒng)受損的狀況。1.2儀器和試劑20μL定量取血管、血球計數(shù)板、顯微鏡、1%鹽酸等。1.3實驗方法1.3.1實驗動物：小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。1.3.2劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組和一個輻射模型對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時可延長至451.3.3實驗步驟受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇3Gy－5Gy。分別于照射前、照射后第3天、照射后第14天三次采末梢血20μL，加入0.38mL1%鹽酸中，混勻后，加入血球計數(shù)板中，計算計數(shù)池中四個大方格中白細胞總數(shù)。白細胞數(shù)（109/L）=四個大方格白細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×1071.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定白細胞數(shù)為計量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。照射前的外周血白細胞計數(shù)，用于各組間白細胞數(shù)目的均衡性檢驗，劑量組與輻射模型對照組比較，差異無顯著性，再進行照射及后續(xù)實驗。照射后3天輻射模型對照組的白細胞數(shù)分別與照射前進行自身比較，差異有顯著性，則判定輻射損傷模型成立；任一時間點、任一劑量組與輻射模型對照組比較，白細胞總數(shù)增多，差異有顯著性，則可判定該實驗陽性。2．骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù)實驗2.1原理骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù)降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一定范圍內(nèi)，照射劑量與骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù)成反比，恢復(fù)時間與骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù)成正比，骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù)可代表造血系統(tǒng)受損的狀況。2.2儀器和試劑血球計數(shù)板、顯微鏡、注射器、手術(shù)器械、紫外分光光度計、Hank’s液等。2.3實驗方法2.3.1實驗動物：小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。2.3.2劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組和一個輻射模型對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時可適當(dāng)延長至45天。2.3.3實驗步驟受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇3Gy－5Gy。于照射后第3天，頸椎脫臼處死動物，剝離出股骨，用1mL注射器（6.5號針頭）吸取一定體積的Hank’s液，沖出股骨中的全部骨髓細胞；最后，讓細胞懸液通過4號針頭的注射器，使細胞在懸液中充分分散。鏡下計數(shù)。計算每mL骨髓細胞懸液中的有核細胞數(shù)。或用紫外分光光度計260nm處測定DNA含量。2.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定骨髓有核細胞數(shù)或骨髓細胞DNA含量為計量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。任一劑量組與輻射模型對照組比較，骨髓有核細胞數(shù)或骨髓細胞DNA含量增多，差異有顯著性，則可判定該實驗陽性。3小鼠骨髓細胞微核實驗3.1原理骨髓細胞微核數(shù)增高是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一定范圍內(nèi)，照射劑量與骨髓細胞微核率成正比，恢復(fù)時間與骨髓細胞微核率成反比，骨髓細胞微核數(shù)可代表機體染色體受損的狀況。3.2儀器和試劑解剖器械，生物顯微鏡，載玻片等。小牛血清：小牛血清濾菌后放入56℃恒溫水浴保溫1h進行補體活性滅活。－20℃保存。亦可用大、小鼠血清代替。Giemsa染液及應(yīng)用液1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）甲醇（分析純）3.3實驗方法3.3.1實驗動物：小鼠，體重18－22g，單一性別，每組10－15只。3.3.2劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組和一個輻射模型對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時可適當(dāng)延長至45天。3.3.3實驗步驟：受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇3Gy－5Gy。于照射后第3天，頸椎脫臼處死動物，取胸骨或股骨，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片?；蛴眯∨Ｑ鍥_洗股骨骨髓腔制成細胞懸液涂片，涂片自然干燥后，放入甲醇中固定5－10min，放入Giemsa應(yīng)用液中，染色10－15min，立即用磷酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗，晾干。鏡檢，每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細胞中微核細胞數(shù)，微核率以千分率表示。抑制率計算：C－DA（%）=───────×100%C－E式中A－抑制率C－致突變物對照組微核率D－受試樣品組微核率E－陰性對照組微核率3.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定采用卡方檢驗、泊松分布或方差分析等統(tǒng)計方法進行數(shù)據(jù)處理。任一劑量組微核率低于輻射模型對照組微核率，差異有顯著性，可判定該實驗結(jié)果陽性。4血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性實驗4.1原理血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一定范圍內(nèi)，照射劑量與血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性成反比，恢復(fù)時間與血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性成正比，血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性可代表機體氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)受損的狀況。O2－氧化羥基的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽，后者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，在波長530nm處有最大吸收峰，可用分光光度法進行測定，當(dāng)SOD消除O2－后形成的亞硝酸鹽減少。4.2儀器與試劑儀器721分光光度計、離心機、恒溫水浴、勻漿器試劑1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.8、SOD標(biāo)準(zhǔn)品、三氯甲烷、95%乙醇（v/v）、0.9%生理鹽水10mmol/L鹽酸羥胺鹽酸羥胺6.95mg，加PBS至10mL7.5mmol/L黃嘌呤黃嘌呤11.41mg，加0.1MNaOH2.5mL溶解，加PBS至10mL0.2mg/mL黃嘌呤氧化酶取10mg/mL黃嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL0.1%甲萘胺取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸餾水，涼至室溫加50mL冰醋酸，再加110mL涼蒸餾水至200mL0.33%對氨基苯磺酸取0.66g對氨基苯磺酸溶于150mL溫蒸餾水，加50mL冰醋酸至200mL4.3實驗方法4.3.1實驗動物：小鼠，體重18－22g，單一性別，每組10－15只。4.3.2劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組和一個輻射模型對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時可適當(dāng)延長至45天。4.3.3實驗步驟受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇6Gy－8Gy。于照射后第7天，進行實驗。4.3.3.1紅細胞抽提液制備：10μL全血沖入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心3min，棄上清，加冰冷的雙蒸水0.2mL混勻，加入95%乙醇0.1mL，振蕩30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min離心3min，分層，上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，記錄上清液體積待測。4.3.3.2組織勻漿的制備：剪取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進行三次，制成1%組織勻漿最好用超聲波發(fā)生器處理30s使線粒體振破，以中性紅－詹鈉氏綠B染色證明線粒體已振碎。以4000r/min離心5min，取上清液20μL待測。4.3.3.3SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線將SOD標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸鹽緩沖液配制成750U/mL的溶液，再稀釋到50倍，即SOD量為15U/mL（1.5μg/mL用本法測定不同量的SOD標(biāo)準(zhǔn)液的百分抑制率，以百分抑制率為縱坐標(biāo)，以SOD活力單位U/mL為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對照管OD－測定管ODSOD百分抑制率=────────────────×100%對照管OD計算每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個單位。 對照管ODSOD活力（U/mL）=───────────────────────×──────────────×樣品稀釋倍數(shù)也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的SODU/mL，乘以稀釋倍數(shù)若樣品為組織勻漿液，根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量，將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細胞抽提液，根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/gHb。4.3.3.4樣品測定步驟：試劑測定管對照管1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8（mL）1.01.0樣品A*10mmol/L鹽酸羥胺（mL）0.10.17.5mmol/L黃嘌呤（mL）0.20.20.2mg/mL黃嘌呤氧化酶（mL）0.20.2雙蒸水（mL）0.490.49混勻，25℃恒溫水浴20min0.33%對氨基苯磺酸（mL）2.02.00.1%甲萘胺（mL）2.02.0混勻15min后，倒入1cm光徑比色杯，以蒸餾水調(diào)零，530nm處比色測定OD值。20－30μL（溶血樣品剔除）4.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定SOD活性值為計量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。任一劑量組與輻射模型對照組比較，血／組織中SOD活性增強，差異有顯著性，則可判定該實驗陽性。5血清溶血素實驗5.1原理免疫系統(tǒng)是機體輻射損傷較敏感的組織之一，血清溶血素值可代表體液免疫系統(tǒng)的狀況。在一定范圍內(nèi)，照射劑量與血清中溶血素水平成反比，恢復(fù)時間與血清中溶血素水平成正比，血清中溶血素可代表機體體液免疫系統(tǒng)受損的狀況。5.2實驗方法5.2.1實驗動物：小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。5.2.2劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組和一個輻射模型對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品于照射前給予14－30天，照射后仍然給予受試物，必要時可適當(dāng)延長至45天。5.2.3實驗步驟受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次，照射劑量宜選擇1Gy－3Gy。于照射后20天內(nèi)，進行血清溶血素的測定。（可任選下列方法之一）5.2.3.1血凝法用SRBC免疫動物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素利用其凝集SRBC的程度來檢測溶血素的水平。5.2.3.1.2儀器和材料SRBC、生理鹽水、微量血凝實驗板、離心機。5.2.3.1.3實驗步驟5.2.3.1.3.1SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。5.2.3.1.3.2免疫動物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。5.2.3.1.3.3凝集反應(yīng)用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi)，每孔100μL，再加入100μL0.5%（v/v）的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。血清凝集程度一般分為5級（0－IV）記錄，按下式計算抗體積數(shù)，抗體水平S1+2S2+3S3……nSn）式中1、2、3……n代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0級紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰。I級紅細胞大部分沉集在孔底成圓點狀，四周有少量凝集的紅細胞。II級凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點。III級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。IV級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。5.2.3.1.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定抗體積數(shù)為計量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于模型對照組的抗體水平，可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.2.3.1.5注意事項血清稀釋時要充分混勻。最后一個稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。5.2.3.2半數(shù)溶血值（HC50）的測定5.2.3.2.1原理用SRBC免疫動物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素與SRBC一起孵育，在補體參與下，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。5.2.3.2.2儀器和材料721分光光度計、離心機、恒溫水浴、SRBC、補體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑（碳酸氫鈉1.0g、高鐵氰化鉀0.2g、氰化鉀0.05g，加蒸餾水至1000mL）。5.2.3.2.3實驗步驟5.2.3.2.3.1SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。5.2.3.2.3.2制備補體采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝70℃保存。用時以SA液按1∶8稀釋。5.2.3.2.3.3免疫動物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液每只鼠腹腔注射0.2mL進行