細菌耐藥機制

細菌耐藥機制研究進展

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院俞云松精選課件精選課件精選課件一、外膜孔蛋白減少或喪失細胞內(nèi)抗生素濃度降低膜孔蛋白(OprD):

精選課件細胞外膜上的某些特殊蛋白是一種非特異性的、跨越細胞膜的水溶性物質擴散通道。膜孔蛋白精選課件革蘭陰性細菌細胞膜精選課件某些細菌本身存在的膜孔蛋白較少或蛋白通道較小，使一些抗菌藥物不能進入菌體內(nèi)部，稱為“內(nèi)在性耐藥〞或“固有性耐藥〞〔intrinsicallyresistant〕，即這種耐藥并非是由于任何染色體的突變或是耐藥質粒的獲得所致。如銅綠假單胞菌的細胞外膜上沒有大多數(shù)革蘭陰性細菌所具有的典型的高滲透性孔蛋白，它的孔蛋白通道對小分子物質的滲透速度僅為典型孔蛋白通道的1%。

“先天缺乏〞精選課件一些具有高滲透性外膜且對抗菌藥物敏感的細菌可以通過降低外膜的滲透性而開展成為耐藥菌，即原有的孔蛋白通道由于細菌發(fā)生突變而使該孔蛋白通道關閉或消失，那么細菌就會對該抗菌藥物產(chǎn)生很高的耐藥性。亞胺培南是一種非典型的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，主要是通過一個特殊的孔蛋白通道OprD2的擴散進入細菌的，一旦這一孔蛋白通道消失，那么產(chǎn)生耐藥性?！昂筇飓@得〞精選課件產(chǎn)氣腸桿菌從亞胺培能敏感株變?yōu)槟退幹昃x課件亞胺培南敏感及耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌PFGE圖C1C2:亞胺培南敏感C3C4:亞胺培南耐藥精選課件亞胺培南敏感及耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌SDS圖C1C2:亞胺培南敏感C3C4:亞胺培南耐藥精選課件PCR擴增Omp36全長及序列分析IS90398%〔約1000bp)精選課件插入序列引起OprD2缺失〔銅綠〕ISPa1328約2000bpOprD2精選課件細菌產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶來水解或修飾進入細胞內(nèi)的抗菌藥物，使之到達靶位之前失去活性細菌產(chǎn)生的滅活酶主要有：

β-內(nèi)酰胺酶氨基糖苷類鈍化酶氯霉素乙酰轉移酶

MLS鈍化酶二、產(chǎn)生滅活酶精選課件超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）高產(chǎn)AmpC酶碳青霉烯酶最主要的耐藥因素對

-內(nèi)酰胺抗生素造成威脅

-內(nèi)酰胺酶臨床上最重要的-內(nèi)酰胺酶精選課件是質粒介導的能夠水解頭孢他啶、頭孢噻肟等亞氨基β-內(nèi)酰胺類及氨曲南等單環(huán)酰胺類抗生素，并可被克拉維酸等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制的一類β-內(nèi)酰胺酶。ESBLs在分子生物學分類中屬于A類酶，在Bush分類中屬于2be類酶。超廣譜-內(nèi)酰胺酶〔extended-spectrum-lactamases，ESBLs〕精選課件ESBLs的分類根據(jù)基因同源性不同分為：TEM型80SHV型46CTX-M型37OXA型18其它型20:///studies/webt.htm.CTX-M-1組CTX-M-2組CTX-M-8組CTX-M-9組精選課件中國400株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分布精選課件32家醫(yī)院1994-2003年

大腸桿菌及肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs百分率精選課件頭孢菌素酶大局部腸桿菌科細菌如腸桿菌屬菌種、弗勞地枸櫞酸桿菌、摩根摩根菌、普魯菲登菌屬菌種粘質沙雷菌等都能產(chǎn)生染色體介導的AmpC酶。精選課件

陰溝腸桿菌精選課件ACT-1,DHA-1,CMY(Peking)DHA-1,CIT,ACT-1(Shanghai)

DHA-1(Zhejiang)DHA-1,ACT-1(GuangZhou)DHA-1isThePredominantTypeinChinaMapofChina精選課件克隆片段PCR產(chǎn)物1100bp共6432bp

ORF1ORF2ORF3ORF4ORF5ORF6IS26orf-1

DHA-1ampRqacE⊿1sul15232bp精選課件指所有能明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類β內(nèi)酰胺酶分別屬于Ambler分子分類中的A類、B類、D類酶。碳青霉烯酶

精選課件天然來源碳青霉烯酶嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的L1酶獲得性碳青霉烯酶〔Ambler分子分類〕B類酶〔金屬酶〕：IMP、VIM類及SPM-1A類酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等D類酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其來源可分為精選課件金屬酶染色體編碼的金屬酶：BCⅡ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多來源于環(huán)境寄生菌。獲得性金屬酶：IMPVIMSPMGIM-1SIM-1，位于可轉移的基因元件上，造成區(qū)域性傳播。精選課件IMP型金屬酶IMP型金屬酶GenBank上已公布21種，比較它們相互之間的序列說明：IMP型金屬酶大致可以分為兩組：1〕IMP-1、IMP3-7、IMP9－11、IMP-162〕IMP-2和IMP-8、12、13、19、20精選課件中國IMP-42001年香港鮑曼2001年廣州楊格枸櫞酸桿菌、銅綠IMP-12004年12月江蘇無錫銅綠IMP-82001臺灣銅綠精選課件VIM型金屬酶VIM型金屬酶與IMP類金屬酶同源性40％，但兩類金屬酶的動力學性質相似，編碼基因都位于整合子上。目前VIM型金屬酶GenBank上已公布12種，比較它們相互之間的序列可將VIM金屬酶大致分為三組：1〕VIM-1、4、5、11a2〕VIM-2、3、6、8、9、10、11b3〕VIM-7精選課件VIM型金屬酶分布VIM-11999年意大利

銅綠氧化木糖產(chǎn)堿桿菌惡臭假單胞

2003－2004希臘

大腸肺克

法國肺克VIM-22000法國

銅綠

意大利希臘日本韓國葡萄牙西班牙波蘭克羅地亞智利阿根廷美國中國VIM-32001年臺灣地區(qū)

銅綠VIM-42002年希臘

銅綠

2003瑞典

銅綠2004意大利

肺克陰溝

2004波蘭銅綠精選課件VIM-52004土耳其肺克銅綠VIM-62004新加坡惡臭假單胞VIM-72004美國銅綠VIM-8哥倫比亞銅綠VIM-9，10英國VIM-11阿根廷意大利VIM型金屬酶分布精選課件亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌金屬酶檢測結果北京（27）上海（32）杭州（27）廣州（32）成都（22）金屬酶表型陽性菌株數(shù)35310百分率11.1％15.6％11.1％3.1％0.0％金屬酶基因型陽性菌株數(shù)36410百分率11.1％18.8％14.8％3.1％0.0％精選課件

VIM-2基因整合子結構圖A：B2，B3，B28，H19，H26，H54，G4結構同In72B：S5，S9，S10，S11，S12〔S15、H22除外〕

intI1attI1aacA459-bVIM-259-beaadB59-be3’-CS

intI1attI1aacA459-beVIM-259-be3’-CSAB精選課件H22H26g4s5s9s10s11s12s15b2b3b28w19w54Marker50kbABH22H26g4s5s9s10s11s12s15b2b3b28w19w54MarkerPFGE譜分析結果：共有七種類型，來自上海的六株為同一類型，來自北京的三株分兩個類型，來自杭州的四株同樣也分兩個類型。各地區(qū)之間的類型各不相同。反復嘗試通過接合試驗及質粒抽提物電轉化傳遞金屬酶基因均未獲成功。經(jīng)XbaI內(nèi)切酶消化的染色體PFGE與VIM-2探針雜交顯示其中10株銅綠假單胞菌50-kb大小的酶切片段雜交陽性，而其余3株〔H22、H26、B2〕沒有陽性片段。精選課件Ａ類酶包括陰溝腸桿菌、粘質沙雷菌中由染色體介導的NMC-A、Sme-1～Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中質粒介導的KPC-1-4酶、銅綠假單胞菌中質粒介導的GES-2酶。碳青霉烯類抗生素水解酶精選課件二株產(chǎn)IMI-1陰溝腸桿菌PFGE結果精選課件AntibioticsMIC(mg/l)EcloacaeEC600

E.coliC600E8

E.coliDH5

E.colipT103Imipenem≥320.38≥320.25≥32Ciprofloxacin0.0640.250.250.006008Amikacin4220.250.38Cefepime20.0640.0640.1250.047Ceftazidime160.50.380.50.25Cefotaxime120.050.1250.0940.047Cefoperazone≥2560.51.50.0474Cefoperazone/Sulbactam1280.25262Piperacillin/Tazobactam≥2562424Ticarcilliin/ClavulanicAcid≥2561232432Ampicillin/Sulbactam≥2568641.5NDEcloacae8,EC600,E.coliC600E8，E.colipT103和E.coliDH5

對抗菌藥物的體外抗菌活性精選課件陰溝腸桿菌、接合菌質粒電泳圖譜

M1ABM2

54kb15kb精選課件SchematicrepresentationoftheclonedE.coRⅠfragment

IS903IMI-2Imi-2RIS903IS2903bp921bp882bp876bp921bp10629bp(GenBankaccessionnumber:AY780889)Imi-R與ImiR同源性為97%。IMI-2與IMI-1同源性99%，僅在37位由天冬氨酸→天冬酰胺，106位由組氨酸→酪氨酸

精選課件抗菌藥物肺炎克雷伯菌亞胺培南>32亞胺培南/克拉維酸16美羅培南>32美羅培南/克拉維酸16厄他培南>256頭孢他啶>256頭孢他啶/克拉維酸>256頭孢噻肟>256頭孢噻肟/克拉維酸>256頭孢吡肟>256頭孢曲松>256頭孢西丁>256氨曲南>256頭孢哌酮/舒巴坦>256哌拉西林/三唑巴坦>256環(huán)丙沙星>32阿米卡星>256多重耐藥肺炎克雷伯菌精選課件轉化試驗抽提亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌質粒轉化DH5α，在含1g/ml的亞胺培南的MH平板上篩選成功篩選到亞胺培南耐藥的轉化菌〔轉化質粒約60kb〕染色體帶61kb精選課件PCRPCR篩選β內(nèi)酰胺酶耐藥基因包括TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM、OXA-10和KPC-1以肺炎克雷伯菌質粒DNA為模板PCR陽性為TEM、SHV和KPC轉化菌和克隆菌只有KPC陽性PCR產(chǎn)物測序分別為TEM-1、SHV-12和KPC-2精選課件轉化菌質?！瞾啺放嗄夏退幓蚩寺　矱coR?,HindⅢ，Nhe?等酶切Nhe?pTeasyVectorpTeasyVector1.5kb在含亞胺培南1

g/mlMH平板篩選精選課件克隆片段測序對重組質粒的插入片段進行步移測序，獲得1554bp核苷酸DNAssist軟件分析，1個開放讀碼框(ORF)經(jīng)GenBankBlast程序分析，該ORF與KPC-2(

GenBank注冊號:AY210886)

的核苷酸序列同源性為100%精選課件D類酶〔OXA酶〕在Bush分群中屬于2d類，對苯唑西林的水解活性很強。OXA型碳青霉烯酶對亞胺培南的水解活性較低，對頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉維酸抑制。OXA型碳青霉烯酶編碼基因可位于質?；蛉旧w上，或定位在I型整合子基因盒中，具備向其他菌種轉移的能力碳青霉烯類抗生素水解酶精選課件blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我國鮑曼不動桿菌最主要的碳青霉烯酶，

ISAba1與OXA基因的表達和轉移密切相關342株亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌中339株檢測到至少一種OXA基因，303株檢測到OXA-23-like和OXA-51-like基因，22株只檢測到OXA-23-like基因，17株只檢測到OXA-51-like基因；其中在313株菌株的OXA-23-like基因上游34bp處檢測到ISAba1，在13株菌株的OXA-51-like基因上游7bp處檢測到ISAba1。精選課件氨基糖苷類鈍化酶分為：磷酸轉移酶〔APH〕乙酰轉移酶〔AAC〕核苷轉移酶〔ANT〕氨基糖苷類鈍化酶作用機制：三者分別使抗生素的羥基磷酸化、氨基乙?；土u基核苷化，使之不能再與細菌核糖體結合。氨基糖苷類耐藥精選課件慶大霉素高水平耐藥〔HLGR〕主要的耐藥機制氨基糖苷類修飾酶耐藥基因百分率AAC(6’)-Ie-APH(2’)-Iaaac(6’)-Ie-aph(2’)-Ia＞90%APH(2’)-Icaph(2’)-IcAPH(2’)-Idaph(2’)-IdAPH(2’)-Ibaph(2’)-Ib＜10%氨基糖苷類耐藥精選課件8,724bpORF1ORF2ORF4

ORF35’3’ISEcp1(tnpA)

aph-Ie

repD

str局部序列一種新的質粒介導的腸球菌氨基糖苷類耐藥基因aph(2〞)-Ie精選課件三、靶位改變精選課件主要抗菌藥物作用靶位-內(nèi)酰胺類青霉素結合蛋白〔PBP〕氨基糖苷類核糖體30S亞基大環(huán)內(nèi)酯類核糖體50S亞基氟喹諾酮類DNA旋轉酶〔拓撲異構酶Ⅱ〕、拓撲異構酶Ⅳ糖肽類D-丙氨酰D-丙氨酸四環(huán)素類核糖體50S亞基

精選課件PBP2a的作用PBP2a與β-內(nèi)酰胺抗生素親和力低，替代正常PBP功能

87Kda——PBP1——80——PBP2——

78——PBP2a75——PBP3’——70——PBP3——41——PBP4——精選課件精選課件精選課件DRIRIRDRSCCmecccrAccrBmecImecR1mecAorfXJ1J3J2SCCmec精選課件精選課件I－V型精選課件VSHA-MRSACA-MRSA

高耐藥性較低

陰性

PVL陽性I、II、IIISCCmecIV、V精選課件金葡菌耐藥性的開展歷程S.aureusPenicillin-resistantS.aureusMethicillin-resistantS.aureus(MRSA)PenicillinMethicillinVancomycin-resistantenterococcus(VRE)Vancomycin(glycopeptide)-Intermediate-ResistantS.Aureus〔VISA、GISA〕Vancomycin-ResistantS.Aureus〔VRSA〕Vancomycin[1940][1960s][1990s][1996]Superbugs[2002]精選課件氟喹喏酮的耐藥機理拓撲異構酶IV(parC,parE)拓撲異構酶II(gyrA,gyrB)左氧氟沙星氟喹喏酮精選課件糖肽類抗生素包括萬古霉素、替考拉寧等，是高分子量的疏水性化合物。主要耐藥機制：VRE的細胞壁肽糖前體末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸發(fā)生了改變，萬古霉素不能與之相結合，因此不能抑制VRE的細胞壁合成。耐萬古霉素的腸球菌〔VRE〕精選課件transposaseresolvasevanRvanSvanHvanAvanX6590bp(ZY02,HS3)表示PCR擴增vanYvanZ10Kb〔ZY01〕轉座功能〔轉座酶transposase基因和解離酶revolsase基因，分別編碼產(chǎn)生轉座酶和解離酶在轉座過程中發(fā)揮作用〕調(diào)控耐藥基因〔VanR和VanS〕產(chǎn)生耐糖肽類的縮肽〔VanH脫氫酶、VanA連接酶和VanX二肽酶〕輔助蛋白〔VanY和VanZ〕含VanA基因簇的轉座子轉座入各種質粒，或通過接合轉座導致VRE耐藥性的傳播

精選課件大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥機制核糖體靶位點的改變:erm編碼，高耐;法國、西班牙、中國主動外排泵:

mef

編碼，低耐

，加拿大、美國、修飾酶精選課件16SrRNA甲基化酶氨基糖苷類抗生素作用位點：細菌16SrRNA以往認為最重要的氨基糖苷類抗生素耐藥機制：修飾酶，作用位點在藥物，引起一種或幾種藥物耐藥2002最新發(fā)現(xiàn)一類新的氨基糖苷類抗生素耐藥機制：16SrRNA甲基化酶，引起藥物作用位點的甲基化，導致細菌對所有氨基糖苷類抗生素高水平耐藥，目前發(fā)現(xiàn)4種：armA、rmtA、rmtB、rmtC多重耐藥鮑曼不動桿菌在我國各省市廣泛流行，該菌對氨基糖苷類抗生素耐藥率和耐藥水平高16SrRNA甲基化酶是否在介導該菌對氨基糖苷類抗生素耐藥中發(fā)揮作用需要系統(tǒng)研究精選課件700株鮑曼不動桿菌對5種氨基糖苷類

抗生素體外抗菌活性·5種氨基糖苷類抗生素耐藥率均大于60％；·377株〔53.9％〕菌株對5種氨基糖苷類抗生素均耐藥；·334株〔47.7％〕菌株armA陽性；·armA陽性菌株對上述所有氨基糖苷類抗生素均高水平耐藥,MIC＞256mg/L·反復進行接合實驗、質粒抽提、電轉化均未成功·Southern-blot雜交證實armA基因位于克隆A、B、C約220kb、300kb、220kb大小的染色體ApaI酶切條帶上armA基因定位于鮑曼不動桿菌染色體精選課件四、主動外運有些抗菌藥物〔常見的如四環(huán)素類及喹諾酮類〕能誘導細菌的主動外運，抗菌藥物難以在細菌內(nèi)積累到有效濃度，造成對抗菌藥物耐藥程度的普遍提高。精選課件外排泵的結構外排系統(tǒng)由3個局部組成：位于內(nèi)膜的腫瘤耐藥分化家族(resistant—nodulation—divisionfamily，RND)的質膜轉運體內(nèi)外膜之間的膜周連接蛋白或膜融合蛋白(MFP)位于外膜的孔道形成蛋白(0EP)

精選課件組間外排泵表達量均值比較精選課件是指細菌粘附于固體或有機腔道外表，形成微菌落，并分泌細胞外多糖蛋白復合物將自身包裹其中而形成的膜狀物。其生化組成為藻酸鹽多糖和蛋白復合物。菌膜可阻止巨噬細胞、抗體、藥物作用于菌體五、細菌生物被膜〔Biofilm〕精選課件生物被膜精選課件細菌形成生物被膜后，往往對抗菌藥物產(chǎn)生高度耐藥性，原因有細菌生物被膜可減少抗菌藥物滲透吸附抗菌藥物鈍化酶，促進抗菌藥物水解細菌生物被膜下細菌代謝低下，對抗菌藥物不敏感生物被膜的存在阻止了機體對細菌的免疫力，產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象，減弱機體免疫力與抗菌藥物的協(xié)同殺菌作用精選課件其他耐藥機制缺乏自溶酶替代途徑酶的過量產(chǎn)生等靶位保護機制精選課件質粒介導的喹喏酮耐藥1998年George.A.Jacoby等從一株肺炎克雷伯菌〔UAB1〕中發(fā)現(xiàn)能介導多種抗生素耐藥的質粒pMG252，經(jīng)接合傳遞后其接合子對環(huán)丙沙星的耐藥性增加近30倍(MIC0.008→0.25μg/mL)。在該質粒內(nèi)發(fā)現(xiàn)了喹諾酮耐藥〔quinoloneresistance〕基因，命名為qnr(Lancet1998;351:797–99)精選課件作用機制保護DNA旋轉酶Qnr通過與旋轉酶特異地結合從而影響酶的內(nèi)在活性,降低了酶與DNA的結合,導致喹諾酮類藥物的作用靶位數(shù)量減少Q(mào)nr與旋轉酶的結合,改變了藥物結合區(qū)域的構象,從而降低了藥物識別靶位的效率保護拓撲異構酶Ⅳ細菌對拓撲異構酶Ⅳ的保護作用與DNA旋轉酶類似Hegde,S.S.etal.Science308:1480,2005QnrDNA旋轉酶精選課件表5株qnrA陽性大腸埃希菌及其接合菌的MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP63128256643225616212>256Tc631410.5>2564414>256140642566432322888>256Tc1401421162884>256142484162564424>256Tc1420.50.511322882>256Z8161616321284256>256>256>256TcZ80.060.060.1250.06128464>256>256>256Z11326416321284256>256>256>256TcZ110.060.060.1250.0664464>256>256>256J530.0150.1250.1250.030.060.1254112J53為受體菌精選課件表38株qnrA陽性肺炎克雷伯菌及其接合菌的MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP14-264128＞64128322111>256Tc14-20.250.510.25162221>2562564256643225616422>256Tc2518121284414>256316425612812825616212>256Tc311812>2568412>2569628221282428>256Tc9618122568414>25615181684644428>256Tc1511110.25321212>256152864441282428>256Tc1520.520.50.5641414>25615332128161632>64>256>256>256>256Tc1530.5112161212>2561564821644428>256Tc1562820.25644414>256J530.0150.1250.1250.030.060.1254112精選課件質粒DNA與PCR產(chǎn)物探針的Southern雜交A:肺炎克雷伯菌96號原始菌