鐵誘導(dǎo)alpha突觸核蛋白聚集機(jī)制研究

鐵誘導(dǎo)alpha．突觸核蛋白聚集的機(jī)制研摘要帕金森病disease，PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾以肌強(qiáng)直鐵誘導(dǎo)alpha．突觸核蛋白聚集的機(jī)制研摘要帕金森病disease，PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾以肌強(qiáng)直、肢體震顫和運(yùn)動減少等癥狀為主要臨床表現(xiàn)。其主要病理nigra，SN)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的缺失和細(xì)胞內(nèi)體(LewybodesLBs)51DFenton反應(yīng)形成羥自由基(hydroxylradical，OH·)，而Fe3+則可以通過Haber-循環(huán)還原成Fe2+進(jìn)而生成OH·。OH·酸的細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前已有大量證據(jù)表R珥alpha一突觸核蛋白在PD發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。Alpha成并對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。神經(jīng)病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)以alpha．突觸核蛋白異常聚集為主要病一定聯(lián)系。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)Fe2+署llFe3+可在體外及細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)alpha-突觸核蛋白的聚集region，UTR)發(fā)現(xiàn)最近，人們在alpha-突觸核蛋白的5’端未翻譯區(qū) 核蛋白聚集的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用甲基噻唑基四唑(methyl法，流式細(xì)胞術(shù)cytometry，F(xiàn)CM)，硫磺素S和熒光雙標(biāo)記，逆轉(zhuǎn)鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)5'-UTR類的質(zhì)粒alpha．synuclein—IRE．Luc，應(yīng)用雙熒光素酶檢測實(shí)鐵可以通過鐵調(diào)節(jié)核蛋白的表達(dá)。結(jié)果如下regulatoryproteins，IRPs)．IRE系統(tǒng)調(diào)節(jié)alpha．突1、1Fe2+和Fe3+處理SK-N．SH細(xì)胞24h，細(xì)胞存活率下降物質(zhì) species，ROS)生成增加，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意懨細(xì)胞內(nèi)alpha-突觸核蛋白的聚集較對照組明顯增多2、5lamol／LVE與mmol／LFe2+或mmol／LFe3+共孵育SK—N．SH細(xì)胞24h可以2、5lamol／LVE與mmol／LFe2+或mmol／LFe3+共孵育SK—N．SH細(xì)胞24h可以斷細(xì)胞內(nèi)alpha．突觸核蛋白聚集，提示氧化應(yīng)激部分參與了鐵誘導(dǎo)的alpha3、成功構(gòu)建了攜帶alpha一突觸核蛋白IRE．Lue熒光素酶報告載體，應(yīng)用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)在HEK293mRNA5'-UTR的Ferroportinl-IRE-Luc熒光素酶報告載體作為陽性對4、mmol／LFe3+孵育HEK293細(xì)胞可使alpha．synuclein．IRE．Luc轉(zhuǎn)染組熒光素表達(dá)上調(diào)，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<O．05)；100}tmol／Lmesylate，DFO)孵育HEK293細(xì)胞則alpha-synuclein．IRE．Luc轉(zhuǎn)IRE具有鐵反應(yīng)性5、IRPl的干涉載體pSilencerl．0．U6．IRPI與熒光素酶報告載體學(xué)意義(P<0．05)；而IRPI的高表達(dá)載體pCMV6一AC—AC01與alpha-synuclein．IRE．Luc共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞增加細(xì)胞內(nèi)IRPl表達(dá)后則alpha-突觸核蛋白的聚集較對照組明顯增上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：細(xì)胞內(nèi)鐵水平可以通過氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)SK．N．SH細(xì)胞alpha-突觸核蛋白聚集體的形成，VE完全阻斷氧化應(yīng)激后并未完全緩解alpha．突核蛋白的聚集，提示氧化應(yīng)激僅部分參與了鐵誘導(dǎo)alphaalpha—synuclein—IRE．Luc熒光素酶報告載體的轉(zhuǎn)錄受細(xì)胞內(nèi)鐵水平和IRPl聚集，繼而導(dǎo)致聚集，繼而導(dǎo)致DA能細(xì)胞的損傷和死亡。本研究將為鐵和alpha指導(dǎo)教師：謝俊disorder progressiveasymptomaticallybylossofdopaminergicneuronsinthesubstantiacharacterizedbyinintracellularinclusionsknownasandthepresenceofalpha-synucleinbodies(LBs)．TheincidenceofPDis1．7％inthepeopleoverinChina．Alongwith overwhelmingoftheeffertsusedinthe pathogenesisarenotfullytodayaimstoalleviatethesymptoms．Itisofgreatimportancedisorder progressiveasymptomaticallybylossofdopaminergicneuronsinthesubstantiacharacterizedbyinintracellularinclusionsknownasandthepresenceofalpha-synucleinbodies(LBs)．TheincidenceofPDis1．7％inthepeopleoverinChina．Alongwith overwhelmingoftheeffertsusedinthe pathogenesisarenotfullytodayaimstoalleviatethesymptoms．ItisofgreatimportanceunderlyingneurodegenerationinPD．tostudingtheIronplaysacrucialinPDpathogenesis．Excessivefreeiron，especiallyferrouscouldgeneratehydroxylFentonreducedtoferrousironbyHaber-Weisscycle．Thedamageandacids，whichfinallyoftherolepathosenesis．Hi曲inalpha-theoftheaggregatesduetoadecreasealpha-synucleinproneto andincreaseforrateassociatedwitllstudiesshowedlinkbetweenironandalpha-synuclein．Ithaswhichisconsistentafoundconcentrationofferrousandferricironpromotealpha- andinvitro．Recentlyapredicatedironresponsivediscoveredintheregion(UTR)ofalpha- awhichironcausethedeaththeup—regulatingalpha-synucleinexpression．Toiron-alpha-synucleinaggregation，3一(4，5·dimethylthiazol-2一yi)一2，5-bromide(M網(wǎng)Simmunofluorencestaining,reversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT—thealpha—westerninpresentoxidativestressaggregationwereobservediniron··treatedSK-N·-cellstoinvestigatethebetweenoxidativecontainedalpha—assayswhetherluciferaseIREisafunctionalelementinHEK293cells．ThenweconfirminSK-N-ironregulatoryresults ironorferricirontreatment241．1reducedinSK-N-SHneuroblastomatocontr01)，andalpha-synucleinaggragateswereobservedto2．Pretreatmentwithfullyblocktheandreductionpartiallyalleviated．Thereasultsindicatedalpha-synucleinaggregationcouldonlycontributestoiron—-oxidativeironorferricirontreatment241．1reducedinSK-N-SHneuroblastomatocontr01)，andalpha-synucleinaggragateswereobservedto2．Pretreatmentwithfullyblocktheandreductionpartiallyalleviated．Thereasultsindicatedalpha-synucleinaggregationcouldonlycontributestoiron—-oxidativealpha··synucleinconstructedreporteralpha—synuclein-IRE— dualluciferaseassaywasappliedinHEK293cellstodetectthefunctionoftheIREpost-·transcriptionalregulation；Ferroportinl·-IRE··Lucwastobethepositive4．24hafterbypRL-pGL3vectors(pGL3-theratiowerealpha-withlmmol／Lironlalpha．．synuclein．．IRE．．Lucproducedconsistentlyactivitygroup(P<0．05)，whileinDFOtreatedthatofthepredicatedIl也iSirondetected(尸<0．05)，indicatingwithmixtureinratio5．Cellswere1：20：80(pRL-pSilencerlMl．O—U6- alpha-synuclein一Ⅱi正一luciferaseofthecontrolgroup儼comparedconsistentlypCMV6．AC．ACOlgroups，lOWerluciferaseactivitywasdetected儼<0．05)．ThewasmediatedbvintracellularIRP1indicatedthatiron．dependentcellsweretransfected6．SK-pSilencerntincellswithP1knockdwonUP-regulatedTheabovethatironcouldalpha-synucleinaggregationcells．a(chǎn)sindicatedbytheresultsthroughoxidativestressinblockedandoxidativeincells．Inregulatoryalpha-synucleinTheabovethatironcouldalpha-synucleinaggregationcells．a(chǎn)sindicatedbytheresultsthroughoxidativestressinblockedandoxidativeincells．Inregulatoryalpha-synucleinitonofIREintheII沖alterations．indicat酣5’-UTRalpha—functional．a(chǎn)ndcouldregulatealpha-synucleinevidencethatthepredicatedIREinthe5’-U豫ofalpha．synucleinOurfindingscausethedeathafunctionalelement．Ironbyalpha—synuclein aggregationthroughIRE／IRPsystemandoxidativeevidencetotheinteractionofironpresentstudyalpha—synucleininPDandprovidesanewtagetfortherapiticalapproachesofSupervisor：JunxiaKeywords：Parkinson’Sdisease；alpha-synuclein；iron；vitamin引引言帕金森病disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以黑nigra，SN)多巴引引言帕金森病disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以黑nigra，SN)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元慢性變性壞死和路易小體(Lewybodies，LBs)形成為病理特征Ⅲ。隨著人類社會老齡化的發(fā)病人數(shù)也逐年上升，在我國，65歲以上人群的發(fā)病率已到達(dá)1．7靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動減少為主要臨床表現(xiàn)，另外還包括協(xié)同運(yùn)動減少活動啟動困難，姿勢反射喪失，流涎，面具臉等癥狀，整個病程呈進(jìn)行性加重PD患者DA能神經(jīng)元死亡的病因和確切機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為環(huán)境和遺傳因素在D的發(fā)生、發(fā)展中起共同作用。由于目前D的發(fā)病機(jī)制尚未明了，尚無防治此病的有效方法。因此進(jìn)一步了解DA能神經(jīng)元變性死亡的關(guān)鍵機(jī)制成為攻克PD核心問題Alpha．突觸核蛋白是198810，極易受外界環(huán)境影響形成聚集體，如高溫，低PH值，殺蟲劑，金屬離子n1LBs癡呆、多系統(tǒng)萎縮，阿爾茨海默病和PD等多種神經(jīng)退行性疾病，這種以形態(tài)學(xué)標(biāo)志，因此N致密部神經(jīng)細(xì)胞體內(nèi)的ah-突觸核蛋白異常聚集是D態(tài)學(xué)特征，而alpha．突觸核蛋白基因的A53T，A30P和E46K的點(diǎn)突變可導(dǎo)致家族遺傳性PD睜121。據(jù)此推測alpha-突觸核蛋白聚集可能是散發(fā)性PD中心環(huán)節(jié)，了解細(xì)胞內(nèi)的alpa-突觸核蛋白聚集的機(jī)制對于理解PD的致病過程具有重要意義研究表明，鐵在PD的發(fā)病中是一個關(guān)鍵因素。臨床尸檢結(jié)果、動物模型等都供了越來越多的線索。經(jīng)顱超聲研究觀察到PD患者SN鐵水平增高早于的出現(xiàn)，在6一羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)和1．甲基4一苯基6．四氫吡啶(1methy4．henyl．1，2，3，6．etahydropyridie，MPTP)制備的經(jīng)典PD模型中也都發(fā)現(xiàn)了鐵含量的增加32¨。A由單胺氧化酶O．)誘發(fā)的氧化脫胺及自身氧化生成黑色素的過程中都能產(chǎn)生H202乜副，在細(xì)胞內(nèi)鐵水平存在的情況下，尤其是在Fd+過多的情況下，通過Fenton反應(yīng)瞳∞和Habe-Weiss循環(huán)Ⅲ1使H202轉(zhuǎn)換成·，導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)，最終造成A能神經(jīng)元的損傷。神經(jīng)病理學(xué)研青島人學(xué)碩Ij學(xué)位論Fe3+可以青島人學(xué)碩Ij學(xué)位論Fe3+可以增快alpha．突觸核蛋白單體在溶液內(nèi)的聚集啡，2引，高濃度的Fe2+可誘導(dǎo)過達(dá)A53T突變alpha-突觸核蛋白的DA能神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)alpha，突觸核蛋白聚集的形啪3。但是鐵誘導(dǎo)alpha．突觸核蛋白聚集的機(jī)制尚不清楚氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)alpha一突觸核蛋白聚集的重要途徑之一㈣，DA的氧化代謝物多巴醌可通過形成多巴胺．a(chǎn)lpha．突觸核蛋白聚合物增強(qiáng)alpha．突觸核蛋白聚集體的穩(wěn)定性，使alpha．突觸核蛋白聚集停留在有細(xì)胞毒性的寡聚體狀態(tài)，從而導(dǎo)致PD擇性的多巴胺能神經(jīng)元變性。馴。鐵是否可以通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)a．突觸核蛋白的聚集并損傷DA能神經(jīng)元有待進(jìn)一步證實(shí)。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)在編碼140個氨基酸的alpha．突觸核蛋白的mRNA的5’端未翻譯區(qū)的46個堿基對可形成一個環(huán)，這個結(jié)構(gòu)與H．erritin的IRE結(jié)構(gòu)極為相似，且與編碼L．erritin，feroportn，紅細(xì)胞系5．氨基酮戊酸合成酶(erythrod5．minoevlinate，ALS)和線粒體順烏頭酸酶的5'-UTR區(qū)的IRE也很相似。而突觸核蛋白家族的bata．突觸核蛋白、gama．突觸核蛋白、ortin1等沒有這個類RE口羽。鐵調(diào)節(jié)蛋白(ironregulatoryproteins，IRPs)可與IRE特異性結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵水平升高時，IRP$降解或活性降低∞3·訓(xùn)，使5'-區(qū)含有IRE的mRNA表達(dá)上調(diào)洶瑚1。這一推論為鐵可能通過IRE／IRP系統(tǒng)調(diào)節(jié)突觸核蛋白的表達(dá)從而導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的死亡提供了依本實(shí)驗(yàn)旨在闡明鐵與alpha．突觸核蛋白聚集之間的關(guān)系，通過證實(shí)alpha-突觸蛋白5'-UTR區(qū)的類IRE是功能性元件，闡明鐵不僅可以通過氧化誘導(dǎo)alpha．突觸核蛋白聚集，還可通過IRE／IRP系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)alpha．突觸核蛋白表達(dá)，使alphaDAP2材料和方1．細(xì)胞培1．1常用試胎牛血清(FetalSerum，F(xiàn)BS)：Biochromag公司產(chǎn)品D．hank’s液：Hyclone公司產(chǎn)青材料和方1．細(xì)胞培1．1常用試胎牛血清(FetalSerum，F(xiàn)BS)：Biochromag公司產(chǎn)品D．hank’s液：Hyclone公司產(chǎn)青霉素、鏈霉素：新華制藥廠產(chǎn)品1．2常用儀顆粒制冰機(jī)：Sanyo公司，日本1．3常用液體配DMEM培差基DMEM粉l袋(GibcoCat12500．039)溶于1000ml蒸餾水，加入gmol／L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7．2，用孔徑為滅菌，分裝為89ml／瓶，4℃保存?zhèn)溆胠tm的過濾器ml，Gibco)過細(xì)絲墻差旦Q：Q!墮Q!絲磋酸鹽緩泣遮(￡墾曼NaCl8．0g、KClg，Na2HP04·12H203．49g，KH2P040．2g，用蒸餾水定容至1000壹』壁堊塞籃在遮青霉素80萬U溶于 PBS，鏈霉素100萬U溶于PBS，各取到均為l萬U／ml的溶液，濾菌后分裝為mY管，于．20℃保存?zhèn)溆寐麷：叢：墨H紲照揸DEMEml，胎牛血清10ml，青／鏈霉素溶液1ml混勻叢蛋用D．Hank’S液配成0．25％的溶液，過濾除菌，．20℃保存1．4細(xì)胞培養(yǎng)步3后，用培養(yǎng)液懸浮，然后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37。C，％C022×104cm2接種于培養(yǎng)板或玻片上。2．1常用試硫酸亞鐵(ferrousammoniumFAC)、VE、MTT、DMSO．-Sigma異丙后，用培養(yǎng)液懸浮，然后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37。C，％C022×104cm2接種于培養(yǎng)板或玻片上。2．1常用試硫酸亞鐵(ferrousammoniumFAC)、VE、MTT、DMSO．-Sigma異丙醇：北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品2．2常用儀酶標(biāo)儀(R．T．2100C)：雷杜公司，中國稱取M丌5mg，溶于0．01mol／LPBS得mg／mlMTT溶液，0．22肛m微孔濾助溶DMSO，室溫保存筮酸亞筮渣將濃度為1mmol／L，現(xiàn)用現(xiàn)配E將FAC溶于ddH20，儲存液濃度為10mmol／ml，用無血清培養(yǎng)液稀釋為工1mmol／ml2．4MTTMTT是一種四甲基偶氮唑鹽，在活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下，被還取對數(shù)生長期的SK-N．SH細(xì)胞，胰酶消化后吹打制成單細(xì)胞懸液后離心4材料和方細(xì)胞數(shù)量為lXl04個，置于37。C、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加入不同稀釋度的(0．1、0．3、l、3mmol／L)或Fe3+(1、3、10、30mmol／L)，或VE(1、2、5、Fe3+共孵育細(xì)胞24h。陰性對照組以新鮮配制的DMEM與37℃、5％C02培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入mg／ml的MTT20pl，37"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)清后每材料和方細(xì)胞數(shù)量為lXl04個，置于37。C、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加入不同稀釋度的(0．1、0．3、l、3mmol／L)或Fe3+(1、3、10、30mmol／L)，或VE(1、2、5、Fe3+共孵育細(xì)胞24h。陰性對照組以新鮮配制的DMEM與37℃、5％C02培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入mg／ml的MTT20pl，37"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)清后每孑LJ；ll入 BI，自動酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(主波長494姍，次波長均值／陰性對照組吸光度均值x1003．12,7．二氫二氯熒光黃雙乙(2’7’-diacetate，H2DCF-DA)：Sigma公司3．2流式細(xì)胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)：BDBiosciences3．3常用液體的配H_H_2DCF-DA(遜取mgH2DCF—DA溶于ml的HEPES緩沖液H星￡亙墨堊煎鹽渣邃(叢亞笪壘墜堡盟亟逝i壁壘叢墾墨20mmol／LHEPES，150mmol／LNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH=7．2，用孔徑為0．22pm的濾器(1000ml，Gibco)過濾滅菌，分裝為500ml／瓶，4筮酸堊迭渣將mg硫酸亞鐵，溶于1“的pH值在5．5—6．0之間的DMEM無血清培內(nèi)，終濃度為lmmol／L，現(xiàn)用現(xiàn)配巡度lmmol／ml。3．45青島人學(xué)碩lj學(xué)位論ml。h青島人學(xué)碩lj學(xué)位論ml。hJ下常對照組：無血清培養(yǎng)液處理24鐵蛋白)或FAC(1mmol／L，pH=6．0，不含VE／Fe2+組：VE(2、5、10I_tmol／L)與硫酸亞鐵VE／Fe”組：VE(E、5、10gmol／L)與FAC(1mmol／L)共孵育243．5FCM檢測ROS原理及方H2DCFDA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平測定ROS：藥物處理結(jié)束，消化細(xì)胞并計數(shù)，每個樣本取lxl06個細(xì)胞；每個本加入H2DCF-DA(終濃度為5gmol／L)1ml，細(xì)胞中濃度為lxl06個／ml，37。C避光載30min；用HEPES緩沖液洗3次后；每樣本加入1目鋼絲網(wǎng)過濾；將樣品加入流式細(xì)胞儀的樣品室，以激發(fā)波長488nnl，發(fā)射波長nmNFC／SSC10000個細(xì)胞，CELLQuestPrDFC的熒光強(qiáng)度陽，鞏蚓。4．熒光雙標(biāo)檢測alpha．突觸核蛋白聚4．1常用試硫磺素S，LB509抗體：Sigma4．2常用儀4．3液體配硫磺素稱取硫磺素54％壘聚甲醛6材料和方4g的多聚甲醛，O．8g的氯化鈉，2．8g的Na2HP04．12H20，0．26g的溶于1L蒸餾水中，置于60。C001mol／Lml的 g溶于NaCl-2．125呂KCh餾水中70％材料和方4g的多聚甲醛，O．8g的氯化鈉，2．8g的Na2HP04．12H20，0．26g的溶于1L蒸餾水中，置于60。C001mol／Lml的 g溶于NaCl-2．125呂KCh餾水中70％甘油300lxlO．01mol／L的PBS加入700山的甘油硫酸亞鐵溶將度為1mmol／L，里繾將FAC溶于ddH20，儲存液濃度為100mmol／ml，用無血清培養(yǎng)液稀釋為工度mmol／ml4．4細(xì)胞接種與藥物處h后分組處理細(xì)胞，F(xiàn)e2+組／Ve3+組：無血清培養(yǎng)液作用24h，硫酸亞鐵鐵蛋白)或FAC．(1mmol／L)24mmol／L，pH=6．0vE／Fe3+組：VE(2、5、10gmol／L)與FAC(1mmol／L)共孵育244．5操作步SK-N．SH細(xì)胞種植于24孔板中，孔中預(yù)先放置高壓處理的蓋玻片進(jìn)行免疫光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。吸出培養(yǎng)液，用30min。固定后的培養(yǎng)細(xì)胞用0．01mol／LPBS洗3次，0．1％TritonX．100室溫處理min，用PBS洗滌一次后正常山羊血清37"C孵育lh。吸出封閉液，直接加入7突觸核蛋白一抗(1：1000)，4"C冰箱中孵育過夜(16h以上)；用PBS洗滌次；加入Rhodamine標(biāo)記的羊抗兔的二抗的混合液，37℃孵育30rain；用PBSmin×3次：0．05％硫磺素S避光孵育8min；80％乙醇洗滌5minx3；蒸餾水洗滌55．熒光素酶報突觸核蛋白一抗(1：1000)，4"C冰箱中孵育過夜(16h以上)；用PBS洗滌次；加入Rhodamine標(biāo)記的羊抗兔的二抗的混合液，37℃孵育30rain；用PBSmin×3次：0．05％硫磺素S避光孵育8min；80％乙醇洗滌5minx3；蒸餾水洗滌55．熒光素酶報告載體的構(gòu)雙熒光素酶報告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測，通常一個報構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報告基因表達(dá)活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾本實(shí)驗(yàn)為研究alpha．突觸核蛋白mRNA上的類IRE是否是功能性元件，需5．1常用試ligase：美國NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品限制性內(nèi)切酶III、I：日本TaKaRaBioGroup公司產(chǎn)QIAquickkit：德國Qiagen公司產(chǎn)品Endo．freePlasmidMiniI：PromegaLipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒：美國invitrogen公司產(chǎn)枸櫞酸鈉均為國產(chǎn)試劑5．2常用儀二氧化碳培養(yǎng)箱：美國Thennoelectron振蕩培養(yǎng)箱和照相裝置等均為國產(chǎn)儀5．3液體配材料和廈拉握邀緩泣速50mmol／L葡萄搪Tris-高壓滅菌后保NaOH渣邃5mol／L乙酸鉀60ml、冰乙酸11．5材料和廈拉握邀緩泣速50mmol／L葡萄搪Tris-高壓滅菌后保NaOH渣邃5mol／L乙酸鉀60ml、冰乙酸11．5ml、28．8m1!SSml去離子水中加入胰蛋白胨(Bacto—Trypton)1g，酵母提取物(Yeast—O．5g，NaClO．5g，聚乙二醇(PEG4000)10g，二甲基亞砜(DMSO)5MgCl25ml，調(diào)pH值至6．5，加去離子水定容存!Q豎土三煊基筮酸鈾(墨鰻i嬰!魚Q亟盟Y!§翊墼曼，墨Q墨2渲g高純度的SDS溶于68。C、約80ml的去離子水，滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至將溶液定容至100ml后，室10mmol／L"Iris．C1，lEDTA，調(diào)PH值至8．0，高壓滅菌，4"C旦叢△魚速緩泣速(§Q圣墜墾緩獨(dú)邃ml，用去離子水定容242g、冰乙酸1000ml，室溫保存，使用時50倍稀釋丕盒旦叢△酶的趔△酶渣速將胰RNA酶溶于10mmol／L"Iris—HCI(pH7．5)和15mmol／LNaCI溶液中，其濃為10mg／ml，加熱至100。C15rain，使其緩慢冷卻至室溫，分裝，．20"C凍存L旦速馇擅差胰蛋白胨g、細(xì)菌酵母提取物ml，用10g，NaCl10g，加蒸餾水至NaOH調(diào)pH至7．O，高壓滅菌，4"CL墾固馇墻菱9青島人學(xué)碩lj學(xué)位論胰蛋白胨g，酵母提取物5 g，細(xì)菌培青島人學(xué)碩lj學(xué)位論胰蛋白胨g，酵母提取物5 g，細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂15g，加蒸餾水至ml，用mol／LNaOH調(diào)pH至7．0，高壓滅菌，4℃保存氫芐壹霉用生理鹽水配制mg／ml儲存液，過濾除菌，．20。C保存?zhèn)溆?，工作液濃?00I_tg／ml載體pRL-TK(圖1)可在哺乳動物細(xì)胞中，組成型地表達(dá)海洋腔腸熒光素可同螢火蟲熒光素酶載體組合作為報告基因活力的內(nèi)對照。而載體pGL3(圖測基因表達(dá)。我們采用pGL3作為載體，插入片段則選取含有類IRE的序圖pRL-TK載體的環(huán)形圖。附加描述：內(nèi)含子的位置，Rluc，編碼RenillacDNA，Ampr,在E．coli中編碼氨芐抗性，ori，在E．coli中質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)。Rluc和Ampr基中的箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方材料和方5圖2pGL3載體的環(huán)形圖。附加描述：luc+，編碼firefly熒光素酶的cDNA，Ampr，在材料和方5圖2pGL3載體的環(huán)形圖。附加描述：luc+，編碼firefly熒光素酶的cDNA，Ampr，在中編碼氨芐抗性，硎，在E．coli中質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)。Luc+和Ampr向插入序列如NM00034-alpha-gcgacgcggaagtgaggtgc3'-ccagaaggggcccaagagagggggcgagCgcagcgcagaccccctccgagagcgtcctgggcgctccctcacgccttgccttcaagccttaaaggaattcattagcccc一accctcgtgagcggagaactgggagtggcattcgacgac1．—3'-tagctttccaacttcagctacagtgttagctaagtttggaaagaagacataaagaagaccggg舀tgctgtgcttatagccgtgcctttgccRacetgtgaagaagcccctgggcaagagcagctaaagctactagcatccgaacaaacaaggggagagc舀ct本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用化學(xué)合成法，由上海生物工程有限公司合成目的基因并連pMDl8．T．a(chǎn)lpha．synuclein．IRE、pMDl8一T—ferroportinl-IRE和載體pGL3分別用I和HindIII雙酶切，反應(yīng)體系如下性核酸內(nèi)切酶1、HindⅢ和NcoI雙110叢i煎l各無菌補(bǔ)至輕敲管壁混勻上述液體，37"0水浴h。用1．5％瓊脂糖凝膠電泳分離酶10叢i煎l各無菌補(bǔ)至輕敲管壁混勻上述液體，37"0水浴h。用1．5％瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片5待DNA完全消化后(電泳顯示單一條帶)，回收純化按照QIAquickPCRDNA片段所在位置，并以干凈刀片將之切下，盡可能切越小越好膠體不超過400mg，加入3倍體積之QGbuffer(即每100mg膠體加入300mlQGbuffer)5012水浴10rain，期間可每隔2～3rainsolution，靜置(5)將QIAquickspincolumn置于2ml收集管中，加入上一步的column之最大容量為800m，若樣品min，13，000rpm離心積超過800山，則需分次加入)column置回原離心管中，加入mlrpm離心1min，棄掉收集管中液體，將min復(fù)rpm離心(8)將spincolumn置于另一個干凈的1．5mI離心管中，加入l肚15“l(fā)EBbuffer到silicamembrane上，靜置minrpm離心column，洗脫DNAmin，丟棄5．6將目的基因與線性化的pGL3線性載1目的基因片1將上述各種試劑加至0．5ml離心管中混勻，16℃過夜反5．7連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)應(yīng)用TSS線性載1目的基因片1將上述各種試劑加至0．5ml離心管中混勻，16℃過夜反5．7連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)應(yīng)用TSS兩步法，將上述連接產(chǎn)物(重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化新鮮制備的09感受態(tài)細(xì)菌在氨芐霉素(濃度50gg／m1)LB平板上培養(yǎng)立空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對照和陰性對照J(rèn)Ml09)。具體轉(zhuǎn)化步驟如JMl09菌種，以三區(qū)劃線法接種于LB固體培(1)?。?0℃或．80℃下保存的基，37℃倒置培養(yǎng)過夜12．16h。自LB平板挑取單個新鮮E．coliJMl09LB液體培養(yǎng)基，37℃200r／min振蕩培養(yǎng)16～18h3(2)l：100稀釋活化菌液，37℃，200r／rain振蕩培養(yǎng)h(3)冰浴15min后取1m1菌液至ml離心管中r／min離心rain(4)棄上清，細(xì)菌沉淀用(5)加入連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴min。(勿振(6)42℃熱水浴90SO；，然后冰浴secr／min振搖minlal預(yù)溫至37℃的LB液體培養(yǎng)基(8)取100gl轉(zhuǎn)化菌，用無菌L棒均勻涂于瓊脂平板(含氨芐霉素50gg／m1)質(zhì)粒小提IIll含氨芐霉素的ALB培養(yǎng)液中，37。(1)挑取上述平板上轉(zhuǎn)化的單個菌落接種至劇烈振蕩培養(yǎng)h左右，至OD600約為O．5(2)取1．5ml培養(yǎng)物于1．5ml離心管中，4℃，12000r／min離心2min，棄上r／rain離心lmin，棄上清(3)加入預(yù)置4℃的TE緩沖液100“L，重懸菌液加100gl預(yù)冷的溶液I，混勻，4"C放置5～10min加200gl新配制的溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管數(shù)次混勻內(nèi)容物(不要振蕩)，冰浴5min。(6)加 青島人學(xué)碩Ij學(xué)位論r／min離心5min(7)加入等體積的(約450清轉(zhuǎn)移至新管；加等體積的冷無水乙醇，充分混勻，．20℃放置h。4"C，12000青島人學(xué)碩Ij學(xué)位論r／min離心5min(7)加入等體積的(約450清轉(zhuǎn)移至新管；加等體積的冷無水乙醇，充分混勻，．20℃放置h。4"C，12000離心10min，棄上清，倒置離心管使上清盡可能流盡。加心吸棄上清，倒置離心管使液體流盡，自然干燥10minplTE溶解沉淀，JJl：IRNase(20l咀g／m1)，37。C消化30min。酚、氯仿抽提TE溶解沉淀，．20℃保存?zhèn)溆贸鼿i迪l!!塑盟鯉!塑醴切將上述提取的質(zhì)粒DNA行HindlII和NcoI雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定否為重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒分別命名為alpha-synuclein—IRE-LucFerroportin-IRE—酶切鑒定體系如l22質(zhì)IIII和各無菌將重組質(zhì)粒陽性的克隆送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA定，檢測連接序列是否正確。測序結(jié)果與合成序列進(jìn)行比對，取正確克隆保存菌(甘油終濃度為155．9質(zhì)粒的大量提按照質(zhì)粒提取試劑盒E．z．N．A．Endo．freePlasmid驟如下l說明書進(jìn)行操作，ALB培養(yǎng)液中，37℃劇烈(1)從陽性克隆的菌液中蘸取少量接種至12．16l疵右g／min離心min(2)取ml菌液于15ml離心管中，室溫下(3)加250肛l預(yù)冷的solutionI／RNase(4)加250材料和g／rain離心10rain，將上清轉(zhuǎn)移至新的(6)室溫下mlEppendorf'管中(7)加入0．1體積的ETRsolution，顛倒混勻7。10次，冰上孵育minmin(9)將上述水相轉(zhuǎn)移至新的Eppendo艚中，加入0．5勻6．7次，室溫孵育1．2min，注意不要吸到底部ETRsolution，材料和g／rain離心10rain，將上清轉(zhuǎn)移至新的(6)室溫下mlEppendorf'管中(7)加入0．1體積的ETRsolution，顛倒混勻7。10次，冰上孵育minmin(9)將上述水相轉(zhuǎn)移至新的Eppendo艚中，加入0．5勻6．7次，室溫孵育1．2min，注意不要吸到底部ETRsolution，DNAcolumn并置于2ml收集管上，1(10)將上述所有液體column之最大容量為min(此lal，若樣品體積超過800rtl，則g／min離心分次加入)HBcolumn置回原收集管中，用500后10000g／rain離心lmin，此步驟保證去除蛋白質(zhì)污(12)棄掉收集管中液體，加入700plDNAwashbuffer，10000g／min離心加入一次700斗lDNAwashbuffer，1g／min離心1mincolumn中殘留的乙g／min離心(14)將ElutionBuffer，靜置1min后g／min離心min后l0000g／min離心1min。離心管內(nèi)即ElutionBuffer，靜置提純后的重組質(zhì)粒，．20℃保存?zhèn)溆?，用于下一步的定量和轉(zhuǎn)染5．10蛋白質(zhì)和DNA向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的載體。細(xì)胞攝取脂質(zhì)體包裝的質(zhì)粒DNA的能力比包裝的DNA高100倍。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、毒性低和包裝容量大。轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine刑2000使用說明書進(jìn)行操作，具體操作如下(1)以lxl05個細(xì)胞／ml將HEK293細(xì)胞接種12無抗生素DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到(2)取2肛1lipotamineTM2000溶于50p1的無血清無抗生素DMEMO．4pg的質(zhì)粒溶于501al的無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液，輕輕混勻后，室溫靜止將兩者充分混勻，室溫靜止(5)37℃孵箱孵育h，換成常規(guī)的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液，分別作用相應(yīng)的青島人學(xué)頌I：學(xué)位6．雙熒光素酶報告系統(tǒng)6．1常用試6．2常用儀M2多功能酶標(biāo)儀：美國MolecularDevices青島人學(xué)頌I：學(xué)位6．雙熒光素酶報告系統(tǒng)6．1常用試6．2常用儀M2多功能酶標(biāo)儀：美國MolecularDevicesC02培養(yǎng)箱：美國Corporation公司倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司6．3液體配將l體積的lysisbuffer與4體積蒸餾水混合均勻后4"C保存<1個月將substance凍干粉重懸于l buffer里，．20"C儲存1個月，．70℃儲存1 將0．2ml50xStop＆Glosubstance溶于10mlStop&Globuffer，渦旋10秒1×Stop&Gloreagent，一20。C儲存15巡將DFO溶于DMEM無血清培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為100|lmol／L，現(xiàn)E將FAC溶于ddH20，儲存液濃度為10mmol／ml，用無血清培養(yǎng)液稀釋為工作濃度mmol／ml6．4實(shí)驗(yàn)分1、陰性對照組：PRL-TK／PGL3．control／pSilencerTMl．0．U6一IRPl以l：20：80比例共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞242、目的基因組：PRL-TK／alpha-synuclein-IRE．Luc／pSilencoml．0．U6一IRPl以3、陽性對照組：PRL．TK／Ferroportin—IRE—Luc／pSilenc矗蹦1．0．U6．IRPl以80的比例共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞材料和方IRPl高表達(dá)l、陰性對照組：PRL．TK／PGL3．control／pCMV6．AC．AC01以l：20：80共材料和方IRPl高表達(dá)l、陰性對照組：PRL．TK／PGL3．control／pCMV6．AC．AC01以l：20：80共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞2、目的基因組：PRL-TK／alpha-synuclein．IRE—Luc／pCMV6．AC．AC01以80的比例共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24的比例共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24鐵孵h后，加入1mmol／L枸櫞酸鐵胺孵育242、目的基因組：PRL．TK／alpha—synuclein．IRE．Luc以1：20的比例共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，加入1mmol／L枸櫞酸鐵胺孵育細(xì)胞24h后，加入lmmol／L枸櫞酸鐵胺孵育24去鐵胺孵2、目的基因組：PRL．TK／alpha-synuclein—IRE—Luc以1：20的比例共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，加入100pmol／L去鐵胺孵育24細(xì)胞24h后，加入100I．tmol／L去鐵胺孵育24h6．5操作步培養(yǎng)細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液，用lxPBS沖洗l遍，棄掉每孔加入250pLlxPLB，室溫下輕搖晃培養(yǎng)板15min，將溶解液移入新的測試管中96孔板，每孔加入20pLPLB溶解液，加入100肛LL懨II熒光強(qiáng)度(4)加入100laLStop＆Gloreagent，檢測海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度；注：(1)、分別用不同的注射器加入L懨II和Stop＆Glo(2)、檢測時使用112see延遲，讀數(shù)時間設(shè)為7．逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)(reversetranscriptionpolymerase青島人學(xué)碩lj學(xué)位論為檢測alpha．突觸核蛋白mRNA是否受IRE／IRP系統(tǒng)的調(diào)控，我們用青島人學(xué)碩lj學(xué)位論為檢測alpha．突觸核蛋白mRNA是否受IRE／IRP系統(tǒng)的調(diào)控，我們用核蛋白的表達(dá)變化。7．1常用試TRIzol試劑：Invitrogen公司產(chǎn)品TaqDNA聚合酶，dNTP，DNAmarker-Takara電泳緩沖體系Tris，EDTA、硼酸、溴酚藍(lán)：Solarbio公司產(chǎn)品7．2常用儀PCR儀：美國Thermo公司可調(diào)式微量移液器：德國Eppendorf公司電泳儀、水平電泳槽：美國Bio．Rad電子天平BS．200S型：德國Sartorius公司DEPC7筮1mlDEPC溶于 ddH20中，攪拌過夜，使DEPC充分溶解，定容至高壓滅菌，室溫保存2§豎乙醒ml無RNA酶污染的乙醇與 DEPC水充分混勻，．20℃冰箱儲存?zhèn)溆弥鱍圣I△星渣渣(衛(wèi)HL，室溫保存g，冰醋酸ml，EDTA·2Nag，ddH20定容至"Iris—base7．4細(xì)胞接種與轉(zhuǎn)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到90％1對，用lipotamine刑2000轉(zhuǎn)染pSilencerl．0U6．IRPI作h。具體步驟如(1)以lxl05個細(xì)胞／ml細(xì)胞接種24孔板，待細(xì)胞貼壁后，換用無血清無抗生DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到(2)取5pllipotamineTM2000溶于125pl的無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液中，同時取1¨g的質(zhì)粒溶于125pl的無血清h。具體步驟如(1)以lxl05個細(xì)胞／ml細(xì)胞接種24孔板，待細(xì)胞貼壁后，換用無血清無抗生DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到(2)取5pllipotamineTM2000溶于125pl的無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液中，同時取1¨g的質(zhì)粒溶于125pl的無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液，輕輕混勻后，室溫靜5(3)將兩者充分混勻，室溫靜置RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄(1)轉(zhuǎn)染結(jié)束后，吸盡培養(yǎng)液，加入1mlRNA提取試劑TRIzol吹打混勻后轉(zhuǎn)入處理過的Eppendorf管中，室溫靜置minmin小心吸取上層水相(注意：切勿吸取中『自J層以防DNA的EP管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后室溫靜置10rainmin沉淀RNA(5)4℃，12000g離心(6)棄上清，加75％乙醇ml漂洗RNA沉淀min，棄上清，將沉淀物(RNA)自然干燥(8)適量DEPC水溶解RNA后取l肛RNA，用DEPC水稀釋至100山，分光光度測定RNA樣品的OD260和002so值，以觀察所提取的RNA標(biāo)本的純度，并計算含量，OD260／OD280在1．8-2．0之間，表明無蛋白質(zhì)污逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系2AMV0．5RNAase0．51肛DEPC補(bǔ)至2042。C反應(yīng)1h，99℃加熱5rain，然后快速冷卻到0*C，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作PCR反應(yīng)7．6PCR42。C反應(yīng)1h，99℃加熱5rain，然后快速冷卻到0*C，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作PCR反應(yīng)7．6PCRMullis于1983PCR是一種體外擴(kuò)增特異性的DNA鏈的技術(shù)，是由明的?？梢詫⒁环N特異性的核酸序列，以PCR酶類處理后產(chǎn)生成千上萬條擴(kuò)增鏈因此可以對小量的基因樣品進(jìn)行分析。理論上認(rèn)為，PCR每一循環(huán)包括三個階段組成：樣本DNA解鏈，使目的基因的兩種鏈得以分開后為退火，以使特異性的單鏈核苷酸引物得以與目的DNA連接；最后為延伸DNA多聚酶作用使合成鏈自引物處延伸。因此一個循環(huán)的PCR可使目的DNAPC物(inter-primer)。用外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)后得到的產(chǎn)物再利用內(nèi)引PCR反應(yīng)。這種方法既可以提高從低拷貝基因或低豐度mRNA獲得目的基率，也有助于提高反應(yīng)的特異性核蛋白NM00034)序列用Primer5．0軟件設(shè)計，引物由上海生工生物工程公司合成，序列分別魚笸旦叢互I G．I’CA’I’GA-PCR擴(kuò)增條件為：94℃594℃3062℃3072。Csee，共30△!業(yè)壘：塞魅璧蛋自里lPCR擴(kuò)增條件為：94℃594℃30 62℃3072"C45sec，共30循環(huán)；72℃延伸10rain。擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為：244￡￡B廈廑佳丕材料和方8．細(xì)胞內(nèi)alpha．突觸核蛋白蛋白表達(dá)材料和方8．細(xì)胞內(nèi)alpha．突觸核蛋白蛋白表達(dá)變化的8．1免疫印8．1．1Tris—base、苯甲基磺酰胺(phenylmethylsulfonylfulride，PMSF)、N，N’一亞甲雙丙品N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED)：美國公司產(chǎn)品ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：密理博公司考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒、NaCl、MgCl2、甘油為北京化學(xué)試劑公司8．1．2bioscience公司8．1．3二葒公司產(chǎn)品，滴13-actin抗體為Sigma公司產(chǎn)品，滴度：1：8000一=亟anti-8．1．3二葒公司產(chǎn)品，滴13-actin抗體為Sigma公司產(chǎn)品，滴度：1：8000一=亟anti-8．1．4常用液體的ml異丙醇中，儲存液濃度為100mmol／L，保存于-20*(2細(xì)胞裂解液50mmol／L"IrispH7．5，150mmol／LNaCl，1％Nonidet40，O．5％脫氧膽酸鈉(避1mmol／LEDTA，10mmol／LPMSF，PH7．5，過濾后4"C避光保存。臨用時取987加入10pl100mM的PMSF，1plpepstatin(1lxg／m1)，1}llaprotinin(1I．tg／m1)，lI．tg／m1)g丙烯酰胺和1gN，N’·亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為37"(2溶解之，補(bǔ)水至終體積ml，pH<7．0，過濾后4"C避光保存gAPS加10gSDS溶于80ml蒸餾水，加熱溶解后定容至100ml，室溫保!：量墮Q叢!型墨：￡!(衛(wèi)H墨：墨Tris溶于mlml蒸餾水，用濃HCI調(diào)節(jié)pH值至8．8，定容至gQ：§匹Q叢!!區(qū)墨：￡!(衛(wèi)H魚：墨mlg"Iris溶于ml蒸餾水，用濃HCI調(diào)節(jié)pH值至6．8，定容至!Q蘭電速緩泣材料和方Tris30g，甘氨酸144g，SDS10g，ddH20定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH值至8．3!Q蘭鱧蹙緩獨(dú)遮mlTrisg，甘氨酸144g，ddH20定容至材料和方Tris30g，甘氨酸144g，SDS10g，ddH20定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH值至8．3!Q蘭鱧蹙緩獨(dú)遮mlTrisg，甘氨酸144g，ddH20定容至!蘭整腿緩泣邃10x轉(zhuǎn)膜緩沖液100ml，甲醇200 ml，調(diào)節(jié)pH值至8選題緩擅29．22gNaCl，28．87ml冰醋酸，定容至1000mliQ蘭至墾S!ml，Tween-24．280g，SDSg，1．0MHCl10ml，ddH20耋呈逝蹇堇(曼QQ堡箜墨適墜巫!!i壘垡壘!墜曼≥鎏魚甲醇45 ml，冰乙酸10ml，考馬斯亮藍(lán)0．25g避魚甲醇ml，冰乙酸10ml封閉用10xTBST配制5％脫脂奶粉8．1．5細(xì)胞接種與HEK293細(xì)胞以2x104／ml接種于六孔板內(nèi)中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％SKNSH2x104ml接種于六孔板內(nèi)中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到808．1．6細(xì)胞處理好后，用預(yù)冷的PBS洗三次，每孑L：JII入30rain，4℃，12000g離心20rain，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。用Brandford定蛋白含量，具體步驟如青島人學(xué)碩f：學(xué)位pl加到600pl考馬斯亮青島人學(xué)碩f：學(xué)位pl加到600pl考馬斯亮稀釋好的樣本pl加到600pl考馬斯亮藍(lán)工作液內(nèi)。選分光光度計的的蛋白量將蛋白按每份IIg分裝，并用生理鹽水調(diào)至相同的體積，加入混勻，用沸水煮沸5min，．80℃冰箱凍存8．1．7十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SOS．PAGE)操作步v，樣品前沿開始進(jìn)入分離膠后，恒壓120V(1)將蛋白上樣后，濃縮膠恒壓(2)將分離好的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PDVF膜，恒壓min(IRPI)；恒流mA，30min(alpha．突觸核蛋白(3)抗原抗體反應(yīng)：轉(zhuǎn)膜后，用TBST緩沖液漂洗PDVF膜5minx3次，用5％牛．TBST封閉液在搖床上震搖2hIgG，1：10000)室溫震搖2h，TBST緩沖液漂洗(5)an-抗次(6)顯色：將ECL化學(xué)發(fā)光試劑的A液和B液等體積混合，以ml／cm2的量于PDVF膜的蛋白面，室溫孵育minrain，顯影，定(7)暗室中去除A、B混合液，壓片，曝光(8)洗脫緩沖液15minx2次，TBST緩沖液5minxl次，加入目的蛋白的抗體強(qiáng)度的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平8．2熒光雙8．2．1常用試硫磺素S，LB509抗體：Sigma8．2．2激光共聚焦掃描顯微鏡：日本Olympus公司(IX．818．2．3材料利硫磺素稱取硫磺素0．01％的PBS中配成O．5％的貯存液4。C冰箱保存5mg溶于稀釋10倍即可材料利硫磺素稱取硫磺素0．01％的PBS中配成O．5％的貯存液4。C冰箱保存5mg溶于稀釋10倍即可4％多聚甲醛4g的多聚甲醛，0．8g的氯化鈉，2．8g的Na2HP04．12H20，0．26g的溶于1L蒸餾水中，置于60O．01ml的NaCl-2．125島KCh0．05島Na2HP04：0．7125舀KH2P04：0．0675g溶于餾水中70％-15淮300Hlmol／L的PBS加入700pl8．2．4細(xì)胞接種及蓋玻片依次用自來水、蒸餾水清洗，重鎘酸浸泡過夜，然后用無水乙醇浸泡2烘干，高壓滅菌后儲存?zhèn)溆谩?4孔培養(yǎng)板(Coming)內(nèi)預(yù)先置入處理好的直徑為5的蓋玻片(每孔一片)。用0．25％胰蛋白酶+0．02％EDTA的混合液消化離心，以2x104／ml的密度接種于含有小蓋玻片的二十四孔板上，24h胞24h塞驗(yàn)僉組正常對照組：無血清無抗生素培養(yǎng)液處理24高表達(dá)IRPl組：pCMV6-AC．AC01．轉(zhuǎn)染SK-N．SH細(xì)胞8．2．5操作步SK-N．SH細(xì)胞種植于24孔板中，孔中預(yù)先放置高壓處理的蓋玻片進(jìn)行免疫熒30min。固定后的培養(yǎng)細(xì)胞用0．01mol／LPBS洗3次，O．1％TritonX．100室溫處理min，用PBS洗滌一次后正常山羊血清37℃孵育突觸核蛋白一抗(1：1000)，4"C冰箱中孵育過夜(16h以上)；用PBS5minx3次；0．05％硫磺素s避光孵育8rnin；80％乙醇洗滌次，70％甘油磷酸次，70％甘油磷酸鹽緩沖液封閉。用激光共聚焦掃描顯微鏡掃描熒光圖像。9實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤(耀S．E．M．)表示。兩組以上均數(shù)的比較采用ANOVA)進(jìn)行比較，繼以Student-Newman．Keuls間的比較。P<0．05表明結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義結(jié)結(jié)果1．細(xì)胞內(nèi)鐵水平對SK．N．SH細(xì)胞存活率的影我們用不同濃度的Fe2+和Fe3+孵育SK．N．SH細(xì)胞 h后用MTT法觀察細(xì)胞活率的變化。結(jié)果顯示100．300pmol／L結(jié)結(jié)果1．細(xì)胞內(nèi)鐵水平對SK．N．SH細(xì)胞存活率的影我們用不同濃度的Fe2+和Fe3+孵育SK．N．SH細(xì)胞 h后用MTT法觀察細(xì)胞活率的變化。結(jié)果顯示100．300pmol／LFe2+對細(xì)胞存活率沒有影響mmol／LA)。l，3，10，30孵育后細(xì)胞存活率分別降至對照組的87．1％，56．7％(圖Fe3+孵育后細(xì)胞存活率分別降至對照組的88．O％，64．9％，42．6％，6．15％(圖B)多細(xì)胞死亡，我們選取AB【loJlcooJo零一童q^o圖 MTT法檢測不同濃度的鐵離子作用SK-N．SH細(xì)胞24h后細(xì)胞存活率的變Fig．1M'IffanalysisofcellviabilityinSK-N-SHcellswithironA：Theviabilityofcellstreatedwithferrousirofor24hwasunchangedcomparedtothatofobservedwhencellsweretreatedmmol／Lsignificantreductionofviability1-treatedwithl-waswhencellsreductionofferriciron．Datamean士S．E．M．ofindependentexperiments．專withthe我們應(yīng)用硫磺素S和免疫熒光雙染的方法檢’狽JJFe2+和Fe3+孵育的SK．N．SH細(xì)胞mmol／L的Fe2+(圖2alpha．突觸核蛋白的聚集情況(圖2)。從圖2我們可以看出或Fe”(圖D／d)孵育細(xì)胞外5，10mmol／L的鐵離子孵育細(xì)胞可產(chǎn)生更加嚴(yán)重的alpha．突觸核蛋白的聚集，同青島大學(xué)碩士學(xué)SK．N．SH細(xì)胞有毒性作用圖VE可部分緩解SK-N．SH細(xì)胞內(nèi)鐵離子誘導(dǎo)的alpha．突觸核青島大學(xué)碩士學(xué)SK．N．SH細(xì)胞有毒性作用圖VE可部分緩解SK-N．SH細(xì)胞內(nèi)鐵離子誘導(dǎo)的alpha．突觸核蛋白的Fig．2VEcouldonlypartiallyalleviateintracellularironinducedalpha-synucleinSK．N．SHAlmostalpha-synucleingroups(A／a)，whilecouldbeobservedinwasobservedinthecellstreatedwithferrous(B／b)orferricalpha—synucleinaroundthecellularnucleus．Inthe wereaggregationsinthecells，butlessthantheirontreatedgroups．Arrowspointtothepositive3．鐵可以部分通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)SK-N．SH細(xì)胞內(nèi)alpha．突觸核蛋白集體的形我們用H2DCF．DA這種熒光探針和FCM檢測不同處理組內(nèi)ROS的生成量。如圖所示，lmmol／L的Fe2+(圖3A／C)和Fe”(圖3B／D)可以導(dǎo)致ROS生成增加VE可完全阻斷rtrnol／L)處理后ROS的生成明顯減少，5lxmol／L)處理后細(xì)胞的Fe2+和Fe”生成的ROS。MTT結(jié)果(圖3E)顯示VE與鐵lamol／LVE可使細(xì)胞存活率回復(fù)正常。于是我們用C／c和圖E／e結(jié)示，VE和鐵共處理組的細(xì)胞內(nèi)認(rèn)可觀察到較少量的聚集體，證明VE不能完全阻斷鐵誘導(dǎo)i拘alpha-突觸核蛋白的聚集的形成。這些結(jié)果證實(shí)結(jié)示，VE和鐵共處理組的細(xì)胞內(nèi)認(rèn)可觀察到較少量的聚集體，證明VE不能完全阻斷鐵誘導(dǎo)i拘alpha-突觸核蛋白的聚集的形成。這些結(jié)果證實(shí)鐵誘alpha．突觸核蛋白的聚集可以部分通過氧化應(yīng)激引起，但這并不是唯一途徑ABCo5尜叱0圈圈+∞C3ooD一一oJlcoo芑器一∞o世圈圈Eo亡0o0零．>=o∞如加2pM10青島人學(xué)顧l：學(xué)位圖 andFig．3EffectsofVE青島人學(xué)顧l：學(xué)位圖 andFig．3EffectsofVEtreatment ferricironSK-N-SHcellsoftheinferrousferricironassaypartiallyblockedbothferrousandferricironinducedROScells．2pxnol／LVEROSgenerationwasbroughttOthenormallevel1esswith5—10pmol／LVEmean士S．E．M．ofindependenttOthevaluestheeonwoll00％．settreatedSK．N．SHcellsfollowedbyadditionofferrousironwasdeterminedbvpartiallybiockedirollinducedassay．2gmol／LVE、，iabilityGanberecoveredtOthenormallevelorevenbetter、歷th5．10ttmol／L werepresentedasmean士S．E．M．of5independentexperiments．叩)<O．05．comparedwiththe達(dá)所示，在1mmol／LFe”處理組(圖4A)和100Itmmol／LDFO處理組(圖4B)中mmol／LFeDFO處理組(圖4B)中二者的比例下降為25．9％。作為陽性對照ferroportin-IRE．Luc組，比值的調(diào)節(jié)與alpha-synuclein．IRE．Luc組一致，鐵處理組比升高25．4％，DFO處理組中降低28．5％。結(jié)果說明構(gòu)建的alpha-synuclein．IRE．Luc質(zhì)R對alpha．synuclein．IRE—Luc質(zhì)粒的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)結(jié)皇§拿意星毫鼉；童星芑21羔。圖4細(xì)胞內(nèi)鐵水平可調(diào)節(jié)alpha．synuclein．IRE．Luc在HEK293細(xì)胞內(nèi)的Fig．4Iron-dependentregulationofluciferaseactivityin結(jié)皇§拿意星毫鼉；童星芑21羔。圖4細(xì)胞內(nèi)鐵水平可調(diào)節(jié)alpha．synuclein．IRE．Luc在HEK293細(xì)胞內(nèi)的Fig．4Iron-dependentregulationofluciferaseactivityinHEK293After24h vectors(pGL3一control，alpha—synuclein—IRE—bypRL-theratioferroportin—IRE—incubatedwithl11．tmmol／LDFO(B)for24h，andthendualluciferasereporterassaywasconducted．Luciferaseinalpha·synuclein-IRE-Lucgroupwasthanthecontrolgroupirongroups．AnditwaslowerDFOwereobservedgroup．Similarwhichwereferroportin-II迮-Lucgroups．TheluciferasebeennormalizedfortheRenillalightunitsbymean4-S．E．M．ofindependentexperiments．奉pRL-withthecontrolofferricthecontrolofthe5．細(xì)胞內(nèi)1表達(dá)水平可調(diào)節(jié)alpha—synuclein．IRE．Luc的表如圖5所示，在轉(zhuǎn)染pSilellcerⅢ1．0．U6．IRPl組(圖A)和轉(zhuǎn)染組(圖5B)中，陰性對照組的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值設(shè)為100％。轉(zhuǎn)染pSilellcer¨Ⅵ1．O．U6．IRPl組@alpha—synuclen．IRE．Luc組中二者的比值較對照高23．0％。而在pCMV6．AC—AC01處理組中比值下降21％。作為陽性對照 比值的調(diào)節(jié)與alpha-synuclein—IRE．Luc組致．pSilencer刪1．0一u6．IRPl組和轉(zhuǎn)染pCMV6．AC．AC01平的調(diào)節(jié)，IRPl可能通過插入的類IRE對alpha—synuclein．IRE．Luc質(zhì)粒的表達(dá)進(jìn)行錄后調(diào)節(jié)。由此我們推斷類IRE為功能性元件，細(xì)胞內(nèi)鐵水平可通過IRE／IRP青島人學(xué)碩Ij學(xué)位論alpha—synuclein—IRE—Luc進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)}．．．．上+薛拌pCMV6-AC-圖IPJpI表達(dá)水平可調(diào)節(jié)alpha-synuclein—IRE-Luc在HEK293細(xì)胞內(nèi)的ofactivityHEK293Fig．5IRPl-dependentCellsweretransfectedwiththreeplasmidmixtureinratio1：20：80(pRL—青島人學(xué)碩Ij學(xué)位論alpha—synuclein—IRE—Luc進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)}．．．．上+薛拌pCMV6-AC-圖IPJpI表達(dá)水平可調(diào)節(jié)alpha-synuclein—IRE-Luc在HEK293細(xì)胞內(nèi)的ofactivityHEK293Fig．5IRPl-dependentCellsweretransfectedwiththreeplasmidmixtureinratio1：20：80(pRL— pCMV6-AC—1”1．0一U6一 1pCMV6一AC—alpha—synuclein—IRE—ferroportin—IRE—isobservedwhichwerethepositivecontrolgroups．ThereportedvaluesofFireflyluciferasehavebeenfortheluciferaseunitsbycotransfectingthepRL-TKplasmid．Datamean士S．E．M．ofindependentexperiments．幸P<0．05．comparedthecontrolwiththecontrolofpCMV6-AC-ACO16．干涉n-]I-i壓]SK—N．SH細(xì)胞內(nèi)alpha一突觸核蛋白為了驗(yàn)證上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們在SK-N—SH細(xì)胞內(nèi)觀察IRPl表達(dá)是否可以alpha-突觸核蛋白mRNA和蛋白水平的變化。如圖6所示，半定量PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)pSilenc盯兀Ⅵ1．0．U6．IRPl質(zhì)粒組的alpha．突觸核蛋白mRNA表達(dá)量較對照組和空載組明顯增加，Westernblot(圖7)結(jié)果和熒光雙標(biāo)(圖8)結(jié)果均顯示，干涉IRPl的alpha．突觸核蛋白的表達(dá)水平較對照組明顯增加(尸<O．05)，而高表達(dá)IRPl組較照組無明顯改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞alpha-突觸核蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)水平IRPl的蛋白表達(dá)水平調(diào)節(jié)，在細(xì)胞內(nèi)干涉IRPl可使alpha．突觸核蛋白mRNA結(jié)Alpha—豳|(zhì)。工(：In《G、c—G—c一一c>讓．正L|c一冗-cmRNAlevelwereup-regulated結(jié)Alpha—豳|(zhì)。工(：In《G、c—G—c一一c>讓．正L|c一冗-cmRNAlevelwereup-regulatedinSK-N-SHceHswithIRPlFig．6Alpha-mRNAwasinthepSilencerTMAlpha—therewassignificantobservedincontrolandpSilencerTM1．0一U6groups．MouseGAPDHwascontr01．Dataastheofalpha-toGAPDH．Eachtothecontrolexperiments．宰尸thepSilencerTM嘲—_嘲— Alpha-哥cllu對．對：l矗q／cx∞．時工A一時oopCMV6一AC—pSilencerl．0一U6一圖7于涉IP,P1可增加alpha-突觸核蛋白在SK-N．SHFig．7Down-regulationenhancesalpha-synucleininSK-N．SHA：Western嘲—_嘲— Alpha-哥cllu對．對：l矗q／cx∞．時工A一時oopCMV6一AC—pSilencerl．0一U6一圖7于涉IP,P1可增加alpha-突觸核蛋白在SK-N．SHFig．7Down-regulationenhancesalpha-synucleininSK-N．SHA：Westernblotstoalpha-synucleinobservedtransfectedtransfectedcells．Beta．a(chǎn)ctinWasusedpCMV6一AC-contr01．B：Statisticalbarrepresentedthemean4-S．E．M．ofwerem'esentedastheratioofalpha．synucleinindependentexperiments．謇尸<O．05．comparedtothe結(jié)瑩CApSilencerl．0-U6-pCMV6-AC-b國CpCMV6-AC-pSilencerl．0-U6-圖8干涉IRPl可增加alpha．突觸核蛋白在SK．N．SHIRPIup-regulatedalpha—synucleinexpressionand結(jié)瑩CApSilencerl．0-U6-pCMV6-AC-b國CpCMV6-AC-pSilencerl．0-U6-圖8干涉IRPl可增加alpha．突觸核蛋白在SK．N．SHIRPIup-regulatedalpha—synucleinexpressionandpromotedSK．N．SHwereinducedpSilencer?1．0一U6一Alpha—synucleincontrol(A／a)．NosignificantchangeWaSobservedinpCMV6-AC-group(B／b)compa