GBT 43286-2023 一次性采樣管（滅活型）

一次性采樣管(滅活型)2023-11-27發(fā)布國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 2 25.1組成 25.2采樣管 25.3采樣液 35.4技術(shù)要求及參數(shù) 36試驗(yàn)方法 46.1外觀 46.2材質(zhì) 46.3采樣管密封性 46.4采樣液裝量 56.5滅活性能 66.6核酸穩(wěn)定性 67檢驗(yàn)規(guī)則 67.1出廠檢驗(yàn) 67.2型式檢驗(yàn) 6 78.1標(biāo)簽 78.2說明書 78.3包裝 88.4運(yùn)輸 88.5貯存 8附錄A(資料性)采樣管示意圖 9附錄B(資料性)采樣拭子示意圖 附錄C(規(guī)范性)采樣液滅活性能試驗(yàn)方法 C.1方法原理 C.2試驗(yàn)條件 C.3材料與試劑 ⅡC.4儀器與耗材 C.5樣本 C.6試驗(yàn)步驟 C.7結(jié)果判定 附錄D(規(guī)范性)核酸穩(wěn)定性試驗(yàn)方法 D.1試驗(yàn)條件 D.2試劑與儀器 D.3樣本 D.4試驗(yàn)步驟 D.5結(jié)果計(jì)算 D.6結(jié)果判定 參考文獻(xiàn) ⅢGB/T43286—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)生物樣本標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC559)提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司、友康生物科技(北京)股份有限公司、北京元碼醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心、中國(guó)食品藥品檢定研究院。本文件主要起草人：王晶、楊利敏、李曼莉、殷劍鋒、李海峰、朱以萍、紀(jì)鑫、傅博強(qiáng)、閆攀登、宋暢、對(duì)含病原微生物特別是病毒等的生物樣本的有效采集，對(duì)于后期的核酸檢測(cè)非常重要。一次性采樣管(滅活型)是一種重要的采集生物樣本的產(chǎn)品，對(duì)生物樣本中病毒的有效滅活能夠降低樣本處理和檢測(cè)過程中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，采樣管中生物樣本所含核酸在一定時(shí)間內(nèi)保持足夠的穩(wěn)定性和完整性能夠提供滿足核酸檢測(cè)要求的生物樣本。因此，為規(guī)范采樣管產(chǎn)品，本文件對(duì)一次性采樣管(滅活型)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范要求，目的是為生產(chǎn)企業(yè)和質(zhì)量監(jiān)管部門提供標(biāo)準(zhǔn)參考。IN1一次性采樣管(滅活型)1范圍注：采樣管用于保存鼻拭子、咽拭子和環(huán)境拭子等采集的生物樣本，并將生物樣本中的病毒滅活，滿足所采集生物樣本中的病毒核酸檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB/T191包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志GB/T2828.1—2012計(jì)數(shù)抽樣檢驗(yàn)程序第1部分：按接收質(zhì)量限(AQL)檢索的逐批檢驗(yàn)抽樣計(jì)劃GB/T9969工業(yè)產(chǎn)品使用說明書總則GB/T37875核酸提取純化試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范GB41918—2022生物安全柜下列術(shù)語和定義適用于本文件。用于保存所采集生物樣本的管具。采用一定的方法使生物樣本中的微生物失去感染能力和復(fù)制能力。采樣管(3.1)內(nèi)用于保存生物樣本的溶液。標(biāo)示裝量labeledvolume采樣管(3.1)內(nèi)的采樣液充裝的體積。由核苷酸或脫氧核苷酸通過3',5'-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。2注：具有非常重要的生物功能，主要是貯存遺產(chǎn)信息和傳遞遺傳信息。包括核糖核酸和脫氧核糖核酸兩類。脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid;DNA由四種主要的脫氧核苷酸(脫氧單磷酸腺嘌呤、脫氧單磷酸鳥嘌呤、脫氧單磷酸胞嘧啶和脫氧單磷酸胸腺嘧啶)通過3',5'-磷酸二酯鍵連接而成的帶有遺傳信息的生物大分子。由核苷酸通過3',5'-磷酸二酯鍵連接而成的多聚體。注：核酸的一類。不同種類的RNA鏈長(zhǎng)不同行使各式各樣的生物功能，如與蛋白質(zhì)生物合成有關(guān)的RNA有信使RNA(messengerRNA,mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transferRNA,tRNA)和核糖體RNA(ribosomneRNA,rRNA);與轉(zhuǎn)錄后加工有關(guān)的RNA有核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)、核仁小RNA(smallnucleolarRNAs,snoR-NAs);與生物調(diào)控有關(guān)的RNA有微RNA(microRNA,miRNA)、干擾小RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等。核酸穩(wěn)定性nucleicacidsta在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，核酸未發(fā)生降解而保持完整性和可檢測(cè)的狀態(tài)。4縮略語下列縮略語適用于本文件。Ct:循環(huán)閾值(cyclethreshold)DMEM:達(dá)爾伯克(氏)必需基本培養(yǎng)基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)NP-40:乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40)PBS:磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebufferedsaline)PCR:聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate)TCID?:半數(shù)細(xì)胞感染量(50%tissuecultureinfectiousdose)5要求采樣管由管蓋、管體、采樣液和標(biāo)簽組成，具體結(jié)構(gòu)見附錄A。5.2.1.2采樣管的形狀應(yīng)保證其能夠直立放置，使用時(shí)不會(huì)傾倒；通常采用帶裙邊采樣管，如底部圓錐形帶裙邊采樣管、底部錐形帶裙邊采樣管(見圖A.1)。5.2.1.3采樣管的形狀宜能兼容自動(dòng)化設(shè)備，方便后續(xù)檢測(cè)使用。3采樣管的管蓋和管體應(yīng)滿足一定厚度，防止靜態(tài)擠壓與動(dòng)態(tài)撞擊時(shí)，管體變形或破碎。管體宜透明，便于觀察采樣液及采集的生物樣本。5.2.2.2化學(xué)性能及耐輻射性能采樣管材質(zhì)應(yīng)耐腐蝕、耐伽馬射線輻照，在一80℃～—20℃的低溫環(huán)境或121℃的高溫環(huán)境下不發(fā)生破損、變形等損壞；宜選用符合YY/T0242要求的醫(yī)療級(jí)聚丙烯(PP)等樹脂材料。5.2.3.1采樣管的管蓋應(yīng)具有與管體相匹配的內(nèi)旋或外旋螺口，并應(yīng)配有密封圈，以保證管蓋和管體嚴(yán)格密封，確保采樣管的密封性。5.2.3.2采樣管密封性應(yīng)滿足以下兩種方法的試驗(yàn)要求：——重量分析法：采樣管在模擬12h運(yùn)輸狀態(tài)前后的兩次質(zhì)量差值不大于5mg;——真空負(fù)壓法：在密封測(cè)試儀內(nèi)，壓力達(dá)到一90kPa后的3min內(nèi)，采樣管管帽周圍無連續(xù)氣泡產(chǎn)生，且采樣管內(nèi)部無試驗(yàn)用水滲入。5.3采樣液5.3.2.1采樣液對(duì)所保存的生物樣本應(yīng)具有病毒滅活特性和保持核酸穩(wěn)定的特性，其中應(yīng)至少含有蛋白變性劑(如異硫氰酸胍、鹽酸胍等)、表面活性劑(如曲拉通X-100、脫氧膽酸鹽、SDS、NP-40等)或催化劑等能使病毒失去感染能力和復(fù)制能力的成分；還可配有緩沖劑、平衡鹽、蛋白酶K、聚乙二醇、金屬離子螯合劑等其他成分；采樣液中不宜使用肝素類等影響PCR檢測(cè)的成分。5.3.2.2采樣液的溶劑應(yīng)使用電阻率不小于18MΩ的超純水；不宜使用普通純化水或蒸餾水。5.4技術(shù)要求及參數(shù)5.4.1標(biāo)示裝量5.4.1.1應(yīng)根據(jù)采樣管尺寸、采樣拭子的拭子頭長(zhǎng)度和數(shù)量對(duì)應(yīng)不同的采樣液充裝體積，即標(biāo)示裝量。5.4.1.2采樣管內(nèi)采樣液的標(biāo)示裝量應(yīng)與采樣管尺寸、拭子頭長(zhǎng)度和數(shù)量相匹配。拭子頭應(yīng)全部浸沒在采樣液中，確定采樣液的標(biāo)示裝量。不同尺寸采樣管的標(biāo)示裝量與采樣管尺寸、采樣液液面高度和拭子頭數(shù)量之間關(guān)系的基本要求應(yīng)符合表1的規(guī)定；不同尺寸采樣管示意圖見圖A.2。5.4.1.3采樣管配套使用的采樣拭子的拭子頭長(zhǎng)度應(yīng)在20mm～28mm之間，拭子頭部最大直徑不大于5.5mm。采樣時(shí)放入采樣管中的拭子頭數(shù)量超過5支時(shí)，應(yīng)采用3cm斷點(diǎn)的拭子；附錄B給出了采樣拭子的示意圖。5.4.1.4采樣管中采樣液的實(shí)際充裝量不應(yīng)低于表1中規(guī)定的標(biāo)示裝量最低值。表1之外尺寸采樣管中采樣液的實(shí)際充裝量應(yīng)不低于產(chǎn)品聲稱的標(biāo)示裝量。4表1采樣管內(nèi)采樣液標(biāo)示裝量的基本要求采樣管尺寸(長(zhǎng)度“×外徑)mm×mm標(biāo)示裝量mL/管采樣液液面高度”mm全部浸沒采樣液中的拭子頭數(shù)量支(50±5)×(10士1)1.0±0.220.5士4.51(100±5)×(16±1)2.2±0.215.5±4.514.0±1.025.0士5.056.0士0.544.0士8.0(100士5)×(25±1)11.5±0.533.0±2.020°15.0±0.540.5士3.5(120±1)×(30±1)15.0±2.023.5±2.5長(zhǎng)度為包括管蓋在內(nèi)的采樣管的整體高度。’采樣液液面高度的測(cè)量方法是從采樣管底部錐形的上水平面到采樣液液面的垂直高度，示意圖見圖A.3。拭子頭部最大直徑應(yīng)小于4.0mm。5.4.2采樣液的滅活性能采樣管中的采樣液應(yīng)具備滅活性能，能徹底滅活樣本中的病毒，使病毒喪失感染活性和復(fù)制能力。滅活性能應(yīng)采用具有感染活性和復(fù)制能力的活病毒樣本進(jìn)行試驗(yàn)，以確定采樣液的滅活性能。5.4.3核酸穩(wěn)定性5.4.3.1采樣管所采集的生物樣本，其中的核酸物質(zhì)應(yīng)在采樣液中于4℃的條件下保持穩(wěn)定48h。5.4.3.2對(duì)于采用熒光定量PCR方法進(jìn)行的核酸穩(wěn)定性試驗(yàn)，Ct值變化率應(yīng)不高于5%。6試驗(yàn)方法6.1外觀在自然光下肉眼目測(cè)。6.2材質(zhì)按照YY/T0242的方法對(duì)采樣管材質(zhì)的物理機(jī)械性能、化學(xué)性能及耐輻射性能進(jìn)行試驗(yàn)。6.3采樣管密封性天平：分度值為0.001g。搖床：轉(zhuǎn)速不低于60r/min。計(jì)時(shí)器：計(jì)時(shí)范圍0min～720min,最大允許誤差不超過±0.5s/d。按照以下步驟進(jìn)行試驗(yàn)：5a)用天平稱量采樣管的質(zhì)量，記為質(zhì)量M?。b)將采樣管傾斜置于搖床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速為60r/min,模擬運(yùn)輸狀態(tài)。12h后取下采樣管，稱量采樣管的質(zhì)量，記為M?。c)根據(jù)式(1)計(jì)算兩次質(zhì)量之差△M?！鱉=M?-M?……(1)式中：M?——模擬運(yùn)輸前采樣管的質(zhì)量，單位為克(g);M?——模擬運(yùn)輸12h后采樣管的質(zhì)量，單位為克(g)。密封測(cè)試儀：測(cè)量范圍-90kPa～0kPa;精度1kPa。計(jì)時(shí)器：計(jì)時(shí)范圍0min～5min,最大允許誤差不超過±0.5s/d。蒸餾水或超純水。通過對(duì)真空室抽真空，使用檢驗(yàn)合格的密封測(cè)試儀對(duì)采樣管的密封性進(jìn)行試驗(yàn)。使浸在蒸餾水或超純水中的采樣管產(chǎn)生內(nèi)外壓差，觀測(cè)采樣管內(nèi)氣體外逸或水向內(nèi)滲入情況，以此判定采樣管的密封性能。步驟如下：a)向密封測(cè)試儀的真空室內(nèi)注入適量蒸餾水，將采樣管放入真空室內(nèi)，浸入水中，采樣管的頂端與水面距離不應(yīng)低于25mm;b)蓋上真空室的密封蓋，將壓力調(diào)節(jié)至一90kPa,待儀器內(nèi)壓力達(dá)到一90kPa后，打開密封測(cè)試儀開關(guān)，計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)3min;c)觀察抽真空過程中和真空保持期間采樣管的泄露情況。6.4采樣液裝量天平：分度值為0.001g。移液器：量程為1mL～10mL。烘箱：溫度變化范圍為25℃~100℃。按照以下步驟進(jìn)行試驗(yàn)：a)使用密度測(cè)試儀測(cè)量采樣液的密度，記為p;b)用天平稱量裝有采樣液的采樣管的質(zhì)量，記為m?;c)使用移液器取出采樣管內(nèi)的采樣液并烘干，用天平稱取烘干后恒重的采樣管的質(zhì)量，記為m?;d)根據(jù)式(2)和式(3)計(jì)算體積誤差△V;6GB/T43286—2023式中：V?——采樣液的實(shí)際體積，單位為毫升(mL);m?——裝有采樣液的采樣管的質(zhì)量，單位為克(g);mz——去除采樣液烘干后恒重的采樣管的質(zhì)量，單位為克(g);p——采樣液的密度，單位為克每立方厘米(g/cm3);式中：△V——采樣液標(biāo)示裝量的誤差；V?——采樣液標(biāo)注的體積，單位為毫升(mL);V?——采樣液實(shí)際的體積，單位為毫升(mL)。6.5滅活性能按照附錄C對(duì)采樣管內(nèi)的采樣液進(jìn)行病毒滅活性能試驗(yàn)。6.6核酸穩(wěn)定性按照附錄D規(guī)定的方法進(jìn)行核酸穩(wěn)定性試驗(yàn)。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1出廠檢驗(yàn)7.1.1出廠的每一件產(chǎn)品均應(yīng)檢驗(yàn)采樣管外觀。7.1.2出廠前應(yīng)對(duì)采樣管產(chǎn)品的密封性、標(biāo)示裝量和生物樣本核酸穩(wěn)定性項(xiàng)目進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)。抽取樣本量按照GB/T2828.1—2012的規(guī)定執(zhí)行，留存樣本量與抽取樣本量一致。7.1.3判定規(guī)則：出廠檢驗(yàn)采樣管產(chǎn)品的外觀結(jié)果不合格，判定該件產(chǎn)品不合格；出廠檢驗(yàn)采樣管產(chǎn)品的密封性、標(biāo)示裝量和核酸穩(wěn)定性項(xiàng)目結(jié)果中有一個(gè)項(xiàng)目不合格，則判定該批次產(chǎn)品不合格；不合格產(chǎn)品均不應(yīng)出廠。7.2型式檢驗(yàn)7.2.1型式檢驗(yàn)項(xiàng)目為第5章要求中規(guī)定的所有項(xiàng)目。采樣管材質(zhì)和采樣液成分的來源應(yīng)提供有效證明材料7.2.2型式檢驗(yàn)每半年或每年應(yīng)進(jìn)行一次。當(dāng)出現(xiàn)但不限于下列情況之一時(shí)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行型式檢驗(yàn)：a)新產(chǎn)品或者產(chǎn)品轉(zhuǎn)廠生產(chǎn)的試制鑒定時(shí)；b)產(chǎn)品原料來源或生產(chǎn)工藝有較大變化，使產(chǎn)品質(zhì)量和性能可能受到影響時(shí)；c)停產(chǎn)后恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)；d)出廠檢驗(yàn)結(jié)果與上次型式檢驗(yàn)結(jié)果有較大差異時(shí)；e)國(guó)家有關(guān)質(zhì)量監(jiān)督部門提出型式檢驗(yàn)要求的情況時(shí)；f)用戶提出進(jìn)行型式檢驗(yàn)的要求時(shí)。7.2.3抽取樣本量按照GB/T2828.1—2012的規(guī)定執(zhí)行，留存樣本量與抽取樣本量一致。7.2.4判定規(guī)則：有任何一個(gè)項(xiàng)目不符合第5章的要求，則判斷該件產(chǎn)品不合格。型式檢驗(yàn)結(jié)果按照GB/T2828.1—2012接收質(zhì)量限(AQL)0.01進(jìn)行判定。78.1標(biāo)簽8.1.1.1采樣管標(biāo)簽標(biāo)注的信息應(yīng)字體清晰、內(nèi)容完整。8.1.1.2采樣管所用標(biāo)簽標(biāo)注的信息應(yīng)包括但不限于以下內(nèi)容：b)生產(chǎn)企業(yè)名稱；c)生產(chǎn)日期，或批(編)號(hào)；d)唯一標(biāo)識(shí)，或用戶自備條碼；e)有效期限；f)貯存條件；g)警示標(biāo)識(shí)。8.1.2.1采樣管上的標(biāo)簽應(yīng)不透明，大小不應(yīng)完全包圍管體。8.1.2.2采樣管上的標(biāo)簽應(yīng)在其有效期內(nèi)保持附著，不脫落。8.1.2.3采樣管上的標(biāo)簽應(yīng)耐高溫、耐低溫、可防潮，防止標(biāo)簽信息褪色或脫落丟失。8.1.2.4采樣管上的標(biāo)簽應(yīng)耐酒精、含氯消毒劑等有機(jī)溶劑，標(biāo)簽信息經(jīng)酒精、含氯消毒劑等有機(jī)溶劑消毒后不褪色。8.2說明書8.2.1采樣管每個(gè)最小銷售單元均應(yīng)附有說明書。8.2.2說明書的編制應(yīng)符合GB/T9969的規(guī)定。8.2.3采樣管說明書應(yīng)使用不小于6號(hào)的字體，中文字體宜為宋體，全文字體格式應(yīng)統(tǒng)一并易于識(shí)別。8.2.4說明書宜包含以下內(nèi)容：b)采樣液的成分組成；c)采樣液的標(biāo)示裝量；d)采樣液的保存穩(wěn)定性、滅活性能；f)生產(chǎn)日期、有效期限或失效日期；h)使用注意事項(xiàng)；i)相關(guān)標(biāo)識(shí)符號(hào)和圖形的說明；j)采樣管使用后的安全處置；k)生產(chǎn)企業(yè)和/或注冊(cè)人的名稱、地址、聯(lián)系方式；1)售后服務(wù)的聯(lián)系方式；m)生產(chǎn)許可證號(hào)、產(chǎn)品準(zhǔn)入的憑證號(hào)和技術(shù)要求編號(hào)；n)說明書的編制日期和修訂日期。88.3.1單支采樣管的包裝是提供使用的最小包裝。8.3.2最小銷售單元包裝內(nèi)應(yīng)附有說明書、質(zhì)量合格標(biāo)識(shí)或產(chǎn)品合格證。8.3.3包裝及封口標(biāo)簽無破損，包裝標(biāo)簽的字跡在有效期內(nèi)應(yīng)清晰。8.3.4最小銷售單元包裝內(nèi)可選擇配置具有生物安全標(biāo)識(shí)的自封袋。8.4.1在運(yùn)輸過程中避免陽光暴曬、重壓、拋擲、雨淋、劇烈震動(dòng)與撞擊。運(yùn)輸包裝件基本試驗(yàn)見GB/T4857(所有部分)。8.4.2應(yīng)保持包裝完好無損，包裝箱應(yīng)按照箭頭標(biāo)志堆放，不倒置。8.4.3產(chǎn)品包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志應(yīng)符合GB/T191的規(guī)定。8.5貯存產(chǎn)品應(yīng)貯存在陰涼、干燥的庫房?jī)?nèi)；不應(yīng)與有毒、易燃、易爆物品同時(shí)貯存。貯存環(huán)境條件應(yīng)滿足說明書的要求。9GB/T43286—2023(資料性)采樣管示意圖采樣管示意圖見圖A.1,不同尺寸的采樣管示意圖見圖A.2,采樣管內(nèi)采樣液液面高度示意圖見圖A.3。a)帶裙邊采樣管b)底部錐形采樣管c)底部圓錐形采樣管標(biāo)引序號(hào)說明：1——管蓋；2——管體；3——標(biāo)簽；4——采樣液；5——裙邊。a錐體上水平面高于裙邊。b錐體上水平面與裙邊齊平。圖A.1采樣管示意圖a)(50±5)mm×(10±1)mm尺寸采樣管示意圖b)(100±5)mm×(16±1)mm尺寸采樣管示意圖c)(100±5)mm×(25±1)mm尺寸采樣管示意圖d)(120±1)mm×(30±1)mm尺寸采樣管示意圖圖A.2不同尺寸的采樣管示意圖a)錐底高于裙邊類采樣管液面高度示意圖b)錐底與裙邊齊平類采樣管液面高度示意圖標(biāo)引序號(hào)說明：1——液面高度；2——液面高度。圖A.3采樣管內(nèi)采樣液液面高度示意圖GB/T43286—2023(資料性)采樣拭子示意圖為便于理解表1中涉及的采樣試子的斷點(diǎn)，采樣拭子的組成示意圖見圖B.1,采樣拭子由拭子桿和拭子頭組成，含斷點(diǎn)。3cm斷點(diǎn)是本文件中所提到的采樣過程中放入采樣管中的采樣拭子數(shù)量大于5支時(shí)，宜采用的斷點(diǎn)。標(biāo)引序號(hào)說明：1——拭子頭；2——拭子桿；3——3cm斷點(diǎn)。圖B.1采樣拭子的組成示意圖(規(guī)范性)采樣液滅活性能試驗(yàn)方法C.1方法原理本方法將病毒樣本加入采樣管，通過采樣液中的滅活劑成分滅活樣本中的病毒，然后用超濾法去除對(duì)細(xì)胞有毒性的滅活劑成分，再用經(jīng)滅活處理的病毒樣本接種細(xì)胞盲傳三代，每代細(xì)胞連續(xù)3d觀察細(xì)胞病變，并取樣進(jìn)行TCID?測(cè)定、噬斑試驗(yàn)或HIV-1病毒抗原p24試驗(yàn)，依據(jù)結(jié)果判定病毒是否被徹底滅活。對(duì)于囊膜病毒樣本的滅活性能測(cè)定，采用甲型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株(WSN)或者人免疫缺陷病毒(HIV)作為試驗(yàn)樣本；對(duì)于非囊膜病毒的滅活性能測(cè)定，采用腸道病毒71型或脊髓灰質(zhì)炎病毒作為試驗(yàn)樣本。C.2試驗(yàn)條件警示——使用本文件的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。流行性感冒病毒A/WS/33滅活性能檢測(cè)的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室(分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)中進(jìn)行；腸道病毒71型和脊髓灰質(zhì)炎病毒I型疫苗株病毒滅活性能檢測(cè)的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行；人免疫缺陷病毒滅活性能檢測(cè)的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度宜在15℃~30℃,相對(duì)濕度≤85%。C.3材料與試劑警示——本文件使用的試驗(yàn)材料采取適當(dāng)?shù)馁A存方式，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件?？蛇x擇使用以下試驗(yàn)材料：a)流行性感冒病毒A/WS/33(ATCCVR-825);b)腸道病毒71型(ATCCVR-1432);c)脊髓灰質(zhì)炎病毒I型，疫苗株(ATCCVR-1562);d)人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染性克隆(pNL4-3,NIH編號(hào)AF324493);e)非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(VERO,ATCCCCL-81);f)犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCCCCL-34);g)TZM-bl細(xì)胞(又稱JC53BL-13,NIHAIDS試劑庫：8129)。應(yīng)使用以下試驗(yàn)試劑：a)采樣液；b)生理鹽水；c)消化液：含0.03%乙二胺四乙酸及0.25%胰蛋白酶的PBS溶液或類似消化液；d)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(高糖):含L-谷氨酸和丙酮酸鈉；e)無血清DMEM培養(yǎng)液：含100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素；h)2×無酚紅DMEM細(xì)胞維持液：含4%胎牛血清、200U/mL青霉素和200μg/mL鏈霉素；i)無酚紅DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基；j)PBS配制的2%低熔點(diǎn)瓊脂；k)4%多聚甲醛溶液；1)結(jié)晶紫：以20%乙醇(體積比)配制成1%的溶液，4℃避光保存，臨用前與雙蒸水(ddH?O)按照1:1稀釋使用；m)配制1mg/mL甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮處理的胰酶(TPCK-Trypsin)儲(chǔ)存液；n)1×PBS緩沖液(不含鈣鎂離子):pH7.4;o)人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(應(yīng)具有國(guó)藥批準(zhǔn)號(hào))。C.4儀器與耗材應(yīng)準(zhǔn)備以下儀器：a)離心機(jī)；b)CO?培養(yǎng)箱；c)倒置顯微鏡；f)水浴鍋；g)酶標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm;C.4.2耗材應(yīng)準(zhǔn)備以下耗材：b)超濾管(截留分子量為100kDa);c)12孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板；d)96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板；e)細(xì)胞培養(yǎng)瓶；g)無菌離心管及管架；C.5樣本警示——處理含病毒材料時(shí)，應(yīng)使用部分或全部排風(fēng)的Ⅱ級(jí)生物安全柜，所使用的生物安全柜應(yīng)經(jīng)過一年一度的常規(guī)檢測(cè)(按照GB41918—2022的要求);每次試驗(yàn)前后應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室及生物安全柜內(nèi)各進(jìn)行1h紫外燈照射處理，物體表面需使用1000mg/L含氯消毒液進(jìn)行消殺，試驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)經(jīng)GB/T43286—2023過高溫高壓滅菌后按照醫(yī)療廢棄物進(jìn)行處理。試驗(yàn)開始前應(yīng)清除試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)無關(guān)物品，防止對(duì)試驗(yàn)或生物安全柜的氣流造成干擾。手套、面屏等。個(gè)人防護(hù)用品應(yīng)符合國(guó)家規(guī)定的有關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。按照相應(yīng)的防護(hù)級(jí)別，使用適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備。C.5.1滅活病毒樣本制備將保存的甲型流感病毒、腸道病毒71型、人免疫缺陷病毒I型感染性克隆或脊髓灰質(zhì)炎病毒工型疫苗株按照表C.1的操作方法添加至采樣管中，設(shè)立試驗(yàn)組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，置室溫放置表C.1滅活病毒樣本制備方法組別操作方法試驗(yàn)組1mL病毒(10°TCIDso/mL～102TCIDso/mL)加入到含3mL采樣液的滅活采樣管中陽性對(duì)照組1mL病毒(10?TCIDo/mL～107TCID/mL)加入到3mL生理鹽水中(體積與采樣液一致)陰性對(duì)照組1mL生理鹽水加入到滅活采樣管中C.5.2去除滅活成分(超濾法)按照以下步驟進(jìn)行：a)將采樣液用0.22μm濾器進(jìn)行除菌過濾處理；b)將按照C.5.1要求制備的0.5mL含病毒采樣液加入到截留分子量為100kDa的超濾管中；c)添加4.5mL的生理鹽水，在4℃、3000g離心超濾，至超濾管內(nèi)上層液體體積約為0.5mL時(shí)停止離心；d)再次加入4.5mL的生理鹽水，4℃,3000g離心超濾，重復(fù)5次；e)加入0.5mL無血清DMEM培養(yǎng)基混勻；f)陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組按照a)～e)的方法進(jìn)行操作。C.5.3病毒滅活驗(yàn)證C.5.3.1準(zhǔn)備工作染毒前一天T75培養(yǎng)瓶中的MDCK、Vero細(xì)胞或TZM-bl細(xì)胞進(jìn)行1:4傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度，在12孔板每孔加入1×10?細(xì)胞鋪板，置CO。孵箱培養(yǎng)至單層細(xì)胞。C.5.3.2樣本接種細(xì)胞按照以下步驟進(jìn)行：a)棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞1次；b)取100μL已去除滅活成分的滅活病毒液，與無血清DMEM培養(yǎng)液按照1:2的比例稀釋，將300μL病毒稀釋液感染12孔板的1個(gè)細(xì)胞孔，補(bǔ)加無血清DMEM培養(yǎng)液至1mL(感染流感病毒時(shí)感染液中TPCK-Trypsin終濃度為1μg/mL);c)按照b)操作，共處理3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO?條件下孵育1h,棄去孔中液體后，補(bǔ)加1mL含2%血清的DMEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72h;d)取培養(yǎng)基上清，4℃、3000r/min離心5min,收集上清，標(biāo)記為第一代。C.5.3.2.2第二代和第三代感染按照以下步驟進(jìn)行：a)分別從3個(gè)一代病毒液中取300μL感染12孔板的1個(gè)細(xì)胞孔，補(bǔ)加無血清DMEM培養(yǎng)液至1mL(感染流感病毒時(shí)感染液中TPCK-Trypsin終濃度為1μg/mL);b)置于37℃、5%CO?條件下孵育1h,棄去孔中液體，補(bǔ)加1mL含2%血清的DMEM維持液，對(duì)于TZM-bl細(xì)胞，則需補(bǔ)加1mL含10%血清的DMEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72h;c)取培養(yǎng)基上清，4℃、3000r/min離心5min,收集上清，標(biāo)記為第二代；d)重復(fù)二代操作，收獲第三代病毒液。C.6.1細(xì)胞病變觀察每代病毒培養(yǎng)時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察Vero細(xì)胞或MDCK細(xì)胞的病變情況。觀察細(xì)胞圓縮、脫落、細(xì)胞膜邊緣不整齊、胞漿中出現(xiàn)顆粒樣凋亡小體，以及病毒合胞體的形成等現(xiàn)象，并記錄。C.6.2.1取每代病毒培養(yǎng)液，按照以下步驟進(jìn)行TCID測(cè)定：a)用無血清DMEM培養(yǎng)基(感染流感病毒時(shí)稀釋液中TPCK-Trypsin終濃度為1μg/mL)對(duì)待滴定病毒樣本做10倍梯度稀釋；b)將稀釋后的病毒液加入已鋪有細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔加100μL,每個(gè)稀釋度8個(gè)重復(fù)，在37℃條件下，放置1h～2h,以確保病毒吸附在細(xì)胞上，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(NC);c)取出培養(yǎng)板，用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2次～3次，更換為DMEM維持液；d)放入CO?培養(yǎng)箱中(37℃,5%CO?)培養(yǎng)，每隔12h在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察3d,逐孔觀察并記錄細(xì)胞病變情況。C.6.2.2終點(diǎn)稀釋法病毒感染滴度計(jì)算用TCID?表示，根據(jù)Reed-Muench氏法計(jì)算。例如，當(dāng)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞病變情況如表C.2所示時(shí)，按照Reed-Muench氏法計(jì)算TCID如表C.3所示。相應(yīng)距離比=(高于50%的病變百分?jǐn)?shù)一50)/(高于50%的病變百分?jǐn)?shù)一低于50%的病變百分?jǐn)?shù))=0.5;1gTCID。=高于50%感染率的病毒稀釋度對(duì)數(shù)+相應(yīng)距離比×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)=6.5;TCID=10^5/100μL。表C.2細(xì)胞病變統(tǒng)計(jì)情況示意圖表重復(fù)試驗(yàn)編號(hào)A十十十十十十—— —B十十+十十十一一 一 C十十十十十十—一一—D十十+十十十—一—一E十十+十十十一一—一—表C.2細(xì)胞病變統(tǒng)計(jì)情況示意圖表(續(xù))編號(hào)NCF+十十十十十一一一—一G十十十十十十—一 ——H十十十十十十—一 — 表C.3各病毒濃度下的細(xì)胞感染比例情況列表稀釋倍數(shù)病變數(shù)未病變數(shù)累計(jì)比率病變良好合計(jì)80080080080080080808080880080008000800C.6.3噬斑試驗(yàn)取每代培養(yǎng)病毒液，按照以下步驟進(jìn)行噬斑試驗(yàn)：a)用無血清DMEM培養(yǎng)液(感染流感病毒時(shí)稀釋液中TPCK-Trypsin終濃度為1μg/mL)對(duì)待滴定病毒做10倍梯度稀釋；b)以1×10?細(xì)胞接種12孔板，置于CO?培養(yǎng)箱過夜，使細(xì)胞長(zhǎng)成單層，待單層細(xì)胞匯合度達(dá)到90%后，將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液傾出；c)加入1mL不同梯度稀釋病毒溶液，置于37℃孵育1h;d)吸棄病毒液，用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3次，去除殘余液體；e)將加熱融化的2%低熔點(diǎn)瓊脂冷卻至50℃時(shí)，與37℃預(yù)熱的2×無酚紅DMEM細(xì)胞維持液等體積混合，迅速加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每孔加入1mL;f)將培養(yǎng)板4℃冷卻10min,待瓊脂凝固后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h～72h;g)試驗(yàn)終點(diǎn)后，向每個(gè)孔中加入1mL4%多聚甲醛溶液固定30min,用自來水沖洗后加結(jié)晶紫染色20min,沖洗干凈后計(jì)數(shù)，細(xì)胞孔內(nèi)圓形不著色的透明區(qū)即為一個(gè)噬斑單位。采用人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒進(jìn)行HIV-1病毒抗原p24的試驗(yàn)，具體操作按照所選擇的試劑盒說明書進(jìn)行。C.7結(jié)果判定C.7.1根據(jù)所選擇的試驗(yàn)對(duì)象和試驗(yàn)方案，依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行滅活性能的結(jié)果判定。C.7.2當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)滿足以下a)和b),或者a)和c),或者a)和d)時(shí)，可判定病毒被徹底滅活。a)陽性對(duì)照組的每代病毒培養(yǎng)物在顯微鏡下觀察到細(xì)胞病變；陰性對(duì)照組的每代病毒培養(yǎng)物在顯微鏡下未觀察到細(xì)胞病變；試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組一致。針對(duì)HIV-1病毒，陽性對(duì)照組的每代病毒培養(yǎng)物中觀察到病毒合胞體；陰性對(duì)照組的每代病毒培養(yǎng)物中未觀察到病毒合胞體；試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組一致。b)陽性對(duì)照組的每代病毒液TCID測(cè)定值大于10°87TCID?/mL;陰性對(duì)照組的每代病毒液TCID??測(cè)定值小于10°87TCIDs/mL;試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組一致。c)陽性對(duì)照組的每代病毒液空斑滴定在10-1滴度時(shí)有明確空斑形成；陰性對(duì)照組的每代病毒液空斑滴定在10-1滴度時(shí)未見明確空斑形成；試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組一致。d)針對(duì)HIV-1病毒，陽性對(duì)照組的每代病毒液HIV病毒抗原p24的試驗(yàn)結(jié)果為陽性；陰性對(duì)照組的每代病毒液HIV病毒抗原p24的試驗(yàn)結(jié)果為陰性；試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組一致。(規(guī)范性)核酸穩(wěn)定性試驗(yàn)方法D.1試驗(yàn)條件警示——使用本文件的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。采用DNA、RNA病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或質(zhì)控品進(jìn)行核酸穩(wěn)定性檢測(cè)的試驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)在不低于生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室(分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)中進(jìn)行；在進(jìn)行流行性感冒病毒A/WS/33的滅活、核酸提取和穩(wěn)定性檢測(cè)的試驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)在不低于生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度宜在15℃~30℃,相對(duì)濕度≤85%。D.2試劑與儀器D.2.1材料應(yīng)準(zhǔn)備以下材料：a)RNA核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如新型冠狀病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、新型冠狀病毒核酸基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；b)DNA核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如乙肝病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、非洲豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或核酸質(zhì)控品；c)病毒，如流行性感冒病毒A/WS/33(ATCCVR-825)。D.2.2試劑應(yīng)準(zhǔn)備以下試劑：a)符合GB/T37875要求的核酸提取試劑盒；b)熒光定量PCR試劑盒，檢出限不高于500copies/mL。D.2.3儀器熒光定量PCR儀。警示——當(dāng)處理病毒材料時(shí)，應(yīng)使用部分或全部排風(fēng)的Ⅱ級(jí)生物安全柜，所使用的生物安全柜需經(jīng)過一年一度的常規(guī)檢測(cè)(按照GB41918—2022的要求);每次試驗(yàn)前后需對(duì)實(shí)驗(yàn)室及生物安全柜內(nèi)各進(jìn)行1h紫外燈照射處理，物體表面需使用1000mg/L含氯消毒液進(jìn)行消殺，試驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)經(jīng)過高溫高壓滅菌后按照醫(yī)療廢棄物進(jìn)行處理。試驗(yàn)開始前清除試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)無關(guān)物品，防止對(duì)試驗(yàn)或生物安全柜的氣流造成干擾。人防護(hù)用品應(yīng)符合國(guó)家規(guī)定的有關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。按照相應(yīng)的防護(hù)級(jí)別，使用適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備。D.3.1樣本處理應(yīng)按照以下步驟處理病毒材料：a)將標(biāo)定濃度≥107copies/mL的已熱滅活的病毒(如流感病毒)用無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.4)進(jìn)行梯度稀釋，制備成不同濃度梯度的病毒樣本；b)分別取100μL樣本溶液，添加至采樣管中(1:3稀釋);c)混合均勻，制備成終濃度分別為(1×10?~1×10?)copies/mL和(5×102~1×103)copies/mL的兩種樣本。D.3.2核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)D.3.2.1RNA核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)處理用無RNA酶水對(duì)RNA病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行梯度稀釋，制備成不同濃度梯度的新型冠狀病毒核樣本溶液，添加至采樣管中(1:3稀釋),混合均勻，制備成終濃度分別為1×10*copies/mL～1×10?copies/mL和5×102copies/mL～1×103copies/mL的兩種樣本。D.3.2.2DNA核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)處理用無DNA酶水對(duì)DNA病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或質(zhì)控品進(jìn)行梯度稀釋，制備成不同濃度梯度的核酸樣樣本溶液，添加至采樣管中(1:3稀釋),混合均勻，制備成終濃度分別為1×10'copies/mL～1×10?copies/mL和5×102copies/mL～1×103copies/mL的兩種樣本。D.3.3樣本保存處理將樣本分成兩組，一組立即進(jìn)行病毒核酸的提取，另一組在4℃放置48h后進(jìn)行病毒核酸的提取。每種濃度下每組設(shè)置3個(gè)復(fù)管。D.4試驗(yàn)步驟D.4.1核酸提取使用核酸提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，提取步驟參照核酸提取試劑盒說明書的要求。D.4.2.2也可采用以下引物探針自行配制體系進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)按照表D.1的要求。D.4.2.3建立熒光定量PCR反應(yīng)體系。RNA病毒(如新型冠狀病毒、流行性感冒病毒)的熒光定量PCR反應(yīng)體系應(yīng)按照表D.2進(jìn)行；DNA病毒(如非洲豬瘟病毒)的熒光定量PCR反應(yīng)體系應(yīng)按照表D.3進(jìn)行。D.4.2.4熒光定量PCR條件按照表D.4(適用于RNA病毒)或表D.5(適用于DNA病毒)的反應(yīng)條件進(jìn)行設(shè)置。引物和探針序列(5'→3')工作濃度新型冠狀病毒“N-FN-RN-PROX-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA