生化實驗課件

實驗一

還原糖的測定（3,5-二硝基水楊酸法）

掌握還原糖和總糖的測定原理，學(xué)習(xí)用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖的方法。一、目的單糖和某些寡糖含有游離的醛基或酮基，有還原性，屬於還原糖；而多糖和蔗糖等屬於非還原性糖。利用多糖能被酸水解為單糖的性質(zhì)可以通過測定水解後的單糖含量對總糖進行測定。

二、原理還原糖在鹼性條件下加熱被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在過量的NaOH鹼性溶液中此化合物在540nm處有最大吸收，在一定的濃度範(fàn)圍內(nèi)還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)係，利用比色法可測定樣品中的含糖量和總糖的含量。黃色棕紅色三、實驗器材1.紅薯。2.試管1.5cm×15cm(×8)。3.吸管0.2ml(×2)、0.5ml(×2)、1ml(×5)、10ml(×1)。4.水浴鍋。5.電陶爐。6.722型（或7220型）分光光度計。7.容量瓶100ml(×3)。8.量筒、研缽、三角燒瓶、玻璃漏斗。9.電子分析天平。四、實驗試劑1.標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1.0mg/ml）：準(zhǔn)確稱取乾燥恒重的葡萄糖200mg，溶於蒸餾水並定容至100ml，混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：將2.5gDNS和150ml2mol/LNaOH溶液，加到250ml含有90g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加2.5g結(jié)晶酚和2.5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻後加蒸餾水定容至1000ml，存儲於棕色瓶中備用。五、操作1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的製作取乾淨(jìng)試管6支，按下表進行操作。以吸光度作為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/ml）作為橫坐標(biāo)，作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。（用蒸餾水調(diào)零點）管號試劑012345標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸餾水/ml1.00.80.60.40.20DNS試劑/ml2.02.02.02.02.02.0沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，取出，用自來水冷卻至室溫蒸餾水/ml7.07.07.07.07.07.0葡萄糖濃度/mg/ml00.20.40.60.81.0A540nm用EXCEL作圖2.樣品中還原糖提取和測定準(zhǔn)確稱取2g紅薯，加蒸餾水約3ml，在研缽中磨成勻漿，轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，並用約30ml的蒸餾水沖洗研缽2-3次，洗出液也轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，於50℃水浴中保溫0.5h，不時攪拌，使還原糖浸出。將浸出液（含沉澱）轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，於4000r/min下離心5min，上清轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，沉澱用20ml蒸餾水洗一次，再離心，將兩次離心的上清液合併，用蒸餾水定容至100ml，混勻，作為還原糖待測液。取1ml進行還原糖的測定。A540nm葡萄糖濃度/mg/ml7.0蒸餾水/ml沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，取出，用自來水冷卻至室溫2.0DNS試劑/ml0蒸餾水/ml1.0待測溶液/ml還原糖溶液

試劑（用蒸餾水調(diào)零點）用公式計算還原糖濃度

二甲氨基萘磺醯氯與氨基酸(多肽、蛋白質(zhì)）N末端的氨基反應(yīng)，分別生成有螢光標(biāo)記的DNS-氨基酸（多肽、蛋白質(zhì)），可在紫外光照射下發(fā)出可見的螢光。靈敏度10-10摩爾。DNS－Cl標(biāo)記氨基酸N末端DNS化反應(yīng)胰島素DNS標(biāo)記胰島素N末端用DNS-Cl標(biāo)記胰島素兩條肽鏈的N末端

（A鏈N末端是Gly，B鏈N末端是Phe）DNS-胰島素在6.0mol/L的鹽酸中水解，釋放出帶有DNS螢光標(biāo)記的DNS-Gly和DNS-Phe。（其他的氨基酸殘基不帶DNS螢光標(biāo)記）DNS-胰島素的水解DNS標(biāo)記氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的N末端用DNS-Cl標(biāo)記氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的N末端

（本實驗只標(biāo)記Gly和Phe兩種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品）聚醯胺薄膜層析

分離原理：各種被分離化合物在展層劑中的溶解度及其與聚醯胺形成氫鍵能力的大小的不同，決定它們在展層過程中遷移的速度差異。

聚醯胺：己二酸和己二胺的聚合物（分子中含有大量的醯胺基團）nHOOC(CH2)4COOH+nH2N(CH2)6NH2→-HN-CO-(CH2)4-CO-NH(CH2)6NH-CO-己二酸

己二胺

聚醯胺

聚醯胺聚醯胺薄膜聚醯胺薄膜：將聚醯胺均勻塗在滌綸基片上，乾燥後制得的薄膜。薄膜含有-CO-和-NH-基團，能與被分離的化合物形成氫鍵，可以分離酚類、酸類、醌類、硝基及胺基等化合物。Rf值（相對遷移率）A：樣品起點C：層析終止時樣品的色層中心B：溶劑前沿BC2AC1Rf=AC／AB實驗操作1、取1支小試管（試管一定要清洗乾淨(jìng)?。?/p>

0.2mL胰島素+0.2mlDNS-Cl2、薄膜封口，40oC水浴反應(yīng)20min3、在酒精燈上將液體蒸幹DNS-Cl標(biāo)記胰島素老師準(zhǔn)備！直接點樣DNS-胰島素的水解1、加0.5mL6.0mol/LHCl，封口2、110oC水解12-18小時3、在電爐上蒸發(fā)幹液體4、加入0.1mL1.0mol/LHCl1、取2支小試管（試管一定要清洗乾淨(jìng)?。?/p>

Phe管：0.2mlPhe＋0.2mlDNS-ClGly管：0.2mlGly＋0.2mlDNS-Cl2、薄膜封口，40oC水浴反應(yīng)20min3、在酒精燈上將液體蒸幹4、各加入0.1mL1.0mol/LHClDNS-Cl標(biāo)記氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品1、將0.1mLDNS-Gly、0.1mLDNS-Phe分別轉(zhuǎn)入做好標(biāo)記的小離心管中。2、各加入0.1mL乙酸乙酯，蓋好蓋子，振盪混合後靜置萃取2分鐘。DNS-氨基酸的萃取取2只0.5mL小塑膠離心管，做好標(biāo)記（Gly、Phe）

點樣注意：1、用鉛筆輕輕標(biāo)記點樣點2、點樣點距薄膜底端1.5cm3、用玻璃毛細管點樣展層及結(jié)果觀察展層劑：甲酸（88%）：水=1.5：100（V/V）

1、展層10-15分鐘，等溶劑前沿到達距薄膜頂端1.0cm時，停止展層2、標(biāo)記溶劑前沿3、乾燥薄膜，在紫外線下觀察結(jié)果預(yù)期展層結(jié)果展層起點展層方向1.5cm123溶劑前沿在培養(yǎng)皿中倒入5mm高的展層劑，將聚醯胺薄膜用透明膠固定好，放入展層劑中。目的瞭解酶的專一性掌握檢查酶專一性的原理和方法學(xué)會排除干擾因素，設(shè)計酶學(xué)實驗實驗內(nèi)容

本實驗以唾液澱粉酶（內(nèi)含澱粉酶及少量麥芽糖酶）、蔗糖酶對澱粉及蔗糖的催化作用，觀察澱粉酶、蔗糖酶的底物專一性。原理

酶的專一性是指一種酶只能對一種底物或一類底物起催化作用，對其他底物無催化作用。酶的專一性程度分為：鍵專一性：只要求作用於一定類型的鍵，對鍵兩端基團無嚴格要求。如脂酶、核酶基團專一性：只對鍵兩端一個基團要求嚴格，如α-、β-葡萄糖苷酶，轉(zhuǎn)移酶絕對專一性：只作用於一種底物，如某些核酸工具酶立體異構(gòu)專一性：旋光異構(gòu)專一性和幾何異構(gòu)專一性酶的專一性澱粉直鏈澱粉:由200-300個α-葡萄糖以α-1，4糖苷鍵相連成一直鏈支鏈澱粉:有α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵，在直鏈澱粉的基礎(chǔ)上形成分支

直鏈澱粉的相對分子品質(zhì)比支鏈澱粉小，直鏈澱粉的分子是由許多α-D-葡萄糖經(jīng)過α-1，4-苷鍵反復(fù)連接而成的線狀聚合物。直鏈澱粉

直鏈澱粉的形狀並不是伸展?fàn)顟B(tài)的直鏈，而是有規(guī)律的捲曲成螺旋狀，每一螺旋圈約有6個葡萄糖結(jié)構(gòu)單位。

直鏈澱粉遇碘液顯藍色，加熱煮沸時顏色消失，冷卻後又重新顯色。這個反應(yīng)很靈敏，常用來檢驗澱粉或碘的存在。

支鏈澱粉比直鏈澱粉由更多的D-葡萄糖組成，其連接方式也有所不同。支鏈澱粉中D-葡萄糖之間以α-1，4苷鍵連接成主鏈，每隔20－25個葡萄糖單位便分枝出1個支鏈，支鏈上還有分枝，而支鏈的連接點即分枝處為α-l，6糖苷鍵。支鏈澱粉支鏈澱粉分枝狀結(jié)構(gòu)

由α-葡萄糖和β-果糖以α-1，2糖苷鍵相連而成的雙糖蔗糖Benedict反應(yīng)

Benedict試劑是鹼性硫酸銅溶液，具有一定的氧化能力，能與還原性糖的半縮醛羥基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成氧化亞銅（Cu2O）磚紅色沉澱。澱粉和蔗糖都不能反應(yīng)，而它們的水解產(chǎn)物葡萄糖能夠發(fā)生Benedict反應(yīng)，所以，用顏色反應(yīng)來觀察澱粉酶、蔗糖酶對澱粉及蔗糖的水解作用。半縮醛羥基在右邊，即與氧環(huán)同側(cè)——α-D-葡萄糖；半縮醛羥基在左邊，即與氧環(huán)異側(cè)——β-D-葡萄糖。

試劑澱粉酶溶液：唾液2mL倒入10mL量筒中（不包括泡沫），用蒸餾水稀釋到5mL，靜置10分鐘後，去掉上層泡沫和下層的沉澱。（自製）蔗糖酶溶液：幹酵母1g置研缽中，加半勺石英沙及蒸餾水少許（約4mL），用力研磨10分鐘，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，另用25mL蒸餾水洗滌研缽，並將洗滌液一起轉(zhuǎn)移到離心管中，搖勻，靜置5分鐘，離心(離心前對稱放置的兩只離心管要等重配平，精確到0.01g)，小心取出上清液（含蔗糖酶）備用。（自製）0.5%澱粉溶液（含0.3%NaCl）（取前搖勻）2%蔗糖溶液Benedict試劑Benedict試劑

在600mL蒸餾水中溶解173g檸檬酸鈉和100g無水碳酸鈉，冷卻後稀釋到850mL。在100mL熱蒸餾水中溶解17.4g無水硫酸銅。冷卻後稀釋到150mL。把硫酸銅溶液緩緩倒入檸檬酸鈉－碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，如產(chǎn)生沉澱。要過濾，班氏試劑配製後能長期使用。如存放較久而產(chǎn)生沉澱時，可取上層清液使用，不必重配。實驗步驟檢查試劑試管1試管2試管30.5%澱粉溶液/mL32%蔗糖溶液/mL3蒸餾水/mL3Benedict試劑/mL222搖勻，沸水煮2分鐘觀察記錄結(jié)果原因澱粉酶的專一性試管4試管5試管6稀釋的唾液澱粉酶/ml1110.5%澱粉溶液/ml32%蔗糖溶液/ml3蒸餾水/ml3搖勻，37℃保溫45分鐘Benedict試劑/ml222

搖勻，沸水煮沸2分鐘觀察記錄結(jié)果原因蔗糖酶的專一性試管7試管8試管9蔗糖酶溶液/ml1110.5%澱粉溶液/ml32%蔗糖溶液/ml3蒸餾水/ml3搖勻，37℃保溫15分鐘Benedict試劑/ml222搖勻，沸水煮2分鐘觀察記錄結(jié)果原因?qū)嶒炘碚婧松锏腄NA與組蛋白結(jié)合，以DNA核蛋白的形式存在於細胞核內(nèi)。在提取DNA時，通過研磨破壞細胞壁和細胞膜，釋放出DNA核蛋白。實驗原理在1.4mol/LNaCl中，DNA核蛋白的溶解度大，RNA核蛋白的溶解度小。在0.14mol/LNaCl中，DNA核蛋白溶解度小，RNA核蛋白溶解度大。①氯仿-異戊醇使蛋白質(zhì)變性，離心除去變性蛋白。②十二烷基硫酸鈉（SDS）使蛋白質(zhì)變性，與核酸分離，從材料中提取出DNA。③苯酚使蛋白變性，離心分層，後者停留在酚層內(nèi)。去除蛋白質(zhì)的方法①化學(xué)因素：pH4.0-11.0穩(wěn)定，否則變性降解。②物理因素：DNA是長鏈線狀分子，機械剪切作用會使分子斷裂。③酶的作用：DNA酶降解DNA分子。破壞DNA完整結(jié)構(gòu)的因素紫外光吸收法鑒定DNA純度和濃度核酸的紫外吸收260nm,蛋白質(zhì)280nmDNA的A260/A280約1.8，RNA的約2.050ug/mLDNA溶液，A260=1.040ug/mLRNA溶液，A260=1.0

實驗步驟10mLCTAB提取緩衝液加入50mL離心管中，65℃水浴中預(yù)熱。50-60g植物葉片，置於預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，充分研磨10分鐘。（全班共用）每組取約2g葉片粉末，加入預(yù)熱的CTAB提取緩衝液中，輕輕混勻，65℃保溫30分鐘。加10mL氯仿-異戊醇，振盪2-3分鐘。5000rpm離心5分鐘。用塑膠滴管將上清吸入另一支50mL離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置3-5分鐘。用玻棒將DNA攪起，置於10mL70％乙醇中浸泡5分鐘。（如果沉澱量很少，5000rpm離心，棄上清，乙醇浸泡沉澱。）將DNA沉澱在室溫乾燥5-8分鐘。將DNA沉澱溶於100mLTE緩衝液中。測定A260和A280計算鑒定DNA的純度和含量試劑CTAB提取液2.0%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）1.4mol/LNaCl20mmol/LEDTA100mmol/LTris-HCL（pH8.0）

0.2%巰基乙醇

CTABCTAB是陽離子去污劑,能使蛋白質(zhì)變性，還能與核酸形成特異的核酸-CTAB複合物。核酸-CTAB複合物可溶於≥0.7mol/LNaCl的高鹽緩衝液。液氮：研磨氯仿-異戊醇：蛋白質(zhì)變性異丙醇：沉澱DNA70%乙醇：脫鹽TE緩衝液10mmol/LTris-HCl（pH7.4）

維持弱鹼性1.0mmol/LEDTA

抑制DNA酶活性限制性內(nèi)切酶EcoRIRestrictionEnzyme識別序列：

G↓AATTC

CTTAA↓GHindIIIRestrictionEnzyme識別序列：

A↓AGCTT

TTCGA↓A

每一種限制性內(nèi)切酶都有特定的反應(yīng)條件

pH範(fàn)圍：7.5~8.0

緩衝液組份:Tris(三羥甲基氨基甲烷）

NaCl、MgCl2、巰基乙醇溫度：37℃瓊脂糖凝膠電泳

是一種簡便、快速的分離純化和鑒定核酸的方法。

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。瓊脂糖粉末加熱到熔點後冷卻凝固,會形成良好的電泳介質(zhì)。電泳

在電場的作用下，在某種支持介質(zhì)上，將一個混合物分離成若干條區(qū)帶的過程。瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離範(fàn)圍瓊脂糖濃度(%)線型DNA分離範(fàn)圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2試劑TBE電泳緩衝液

45mmol/LTris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0加樣緩衝液

0.25%溴酚藍（深藍色，300bp)0.25%xylenecyanloFF（天藍色，2000bp）40%蔗糖EB（溴化乙錠）染色液（有毒）

0.5ug/ml，用水配製溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)是一種扁平分子螢光染料，可嵌入核酸的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色螢光。電泳結(jié)束後，將凝膠浸入0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可見核酸電泳帶，DNA量一般>5ng。操作步驟酶切反應(yīng)反應(yīng)體系

λ－DNA5ul

10xBuffer2ul

HindIII3ulH2O10ul

Total20ul混勻，37度保溫30分鐘

制膠用電極緩衝液（0.5×TBE）配製0.7%的瓊脂糖膠20mL0.14g瓊脂糖，20mL0.5×TBE微波爐加熱至沸騰，確定瓊脂糖完全溶解冷卻至60℃左右準(zhǔn)備好梳子和膠槽，倒入瓊脂糖溶液，冷卻凝固點樣Sample1自提DNA5ul+2ulLoadingDye

Sample2自提DNA酶切液20ul+4ulLoadingDyeSample3λ-DNA5ul+2ulLoadingDye

Sample4λ-DNA酶切液20ul+4ulLoadingDye

點樣：

Sample1和3各7ul

Sample2和4各10ul電泳接通電源，150v電泳0.5小時染色和觀察切斷電源，取出膠模，將凝膠放入EB染色液中，染色10分鐘取出凝膠，紫外燈下觀察DNA電泳帶型警告EB誘變?nèi)旧陀^察時一定要帶手套！

1234

←RNA提示1自提DNA2自提DNA/HindIII

3λ-DNA/HindIII4λ-DNA結(jié)果記錄與分析繪製電泳圖譜λ-DNA/HindIIIMarkerλ-DNA/HindIIIMarker

用HindIII徹底降解λ-DNA貯藏緩衝液：

10mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mol/LNaCl,1mol/LEDTA實驗原理分離純化

用熱變性、有機溶劑沉澱等方法，從酵母中提取一定純度的醇脫氫酶。

CH3CH2OH+NAD+CH3CHO+NADH+H+

乙醇過量時，NAD+被還原成NADH的速度與酶活力成正比，NADH在340nm有較強吸收，可測定單位時間內(nèi)NADH的生成量，確定酶活力。醇脫氫酶醇脫氫酶催化的反應(yīng)醇脫氫酶可催化醇和醛之間的氧化還原反應(yīng)，輔酶是NAD+/NADH。實驗步驟一、提取純化酵母醇脫氫酶（一）粗提稱酵母粉2g，置研缽中，加半勺石英沙和Na2HPO4溶液5mL，用力研磨10分鐘，轉(zhuǎn)入50mL離心管，用20mLNa2HPO4溶液洗研缽，轉(zhuǎn)到離心管中，搖勻，靜置5分鐘，5000rpm離心5min，取上清液，量取體積V1

，取2個1ml分別於1.5ml離心管中，4℃保存（一管用於測蛋白濃度，一管用於測酶活力），剩餘的上清繼續(xù)下一步純化。（二）熱變性去除雜蛋白

剩餘的上清在55℃保溫15min，間歇攪拌，冰浴冷卻，5000rpm離心5min，取上清，量體積V2，取2個1ml分別於1.5ml離心管中（一管用於測蛋白濃度，一管用於測酶活力）

，4℃保存?zhèn)溆?，剩餘上清置冰浴中。（三）有機溶劑沉澱雜蛋白

將置於冰浴中上清，加上清體積一半的預(yù)冷丙酮，混勻，4℃靜置5min，5000rpm，離心5min，取上清，量體積V3，取2個1ml分別於1.5ml離心管中，4℃保存?zhèn)溆茫ㄒ还苡渺稖y蛋白濃度，一管用於測酶活力），剩餘上清倒入已置於冰浴中的50ml離心管。（四）有機溶劑沉澱酶蛋白

在上清中按100ml加55ml丙酮的比例，加入預(yù)冷丙酮，混勻，靜置5min，4℃，5000rpm離心5min。棄上清，沉澱溶於5.0ml0.01mol/LK2HPO4中，體積為V4，取2個1ml分別於1.5ml離心管中（一管用於測蛋白濃度，一管用於測酶活力）

。

1、將前面保存的上清用0.01mol/LK2HPO4稀釋第一步、第二、三、四步的酶液各稀釋10倍備用2、準(zhǔn)備5只試管，編號1-5，加入以下四種試劑3.0M乙醇0.1ml0.06M焦磷酸鈉0.5ml0.0015MNAD+0.3ml蒸餾水1.6ml酶活力測定方法3.逐管加入0.2mL已稀釋的酶液，混勻後立即測定A340每分鐘A340增加0.001為1個活力單位。樣品編號A340/min1mL酶原液的酶活(U/mL)V1V2V3V4酶液加入體積：0.2mL酶液稀釋倍數(shù)：10倍1mL酶原液的酶活=A340*1000*10/0.2酶活定義：每分鐘A340增加0.001為1個活力單位。

考馬斯亮藍G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，最大吸收波長在595nm，在0～100μg/ml，吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。

蛋白質(zhì)與G-250反應(yīng)在2min內(nèi)達到平衡，且穩(wěn)定，可檢測微克級的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)含量測定（Bradford法）

取6個PA瓶，配製0～100μg/ml蛋白液各1.0ml。加5.0mlG-250試劑，混勻，放置2min，在595nm比色，繪製標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的製作管號123456蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.60.81蒸餾水（ml）1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍染液555555蛋白質(zhì)含量（μg）020406080100A595

將樣品提取液稀釋50倍（參考值），吸取1.0mL放入PA瓶，加5mLG-250試劑，混勻，放置2min，在595nm比色，記錄吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。2、樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定（四）計算（按照測定的數(shù)據(jù)完成下表）

C=A×BE=A×DF=D/B（或E/C）提純步驟總體積mlA蛋白濃度(mg/ml)B蛋白總量mgC1mL酶活力（U）D總活力UE比活力(U/mg)F回收率（%）蛋白質(zhì)G酶總活力H1.粗提22.51.98644.6145032625731.51001002.熱變性除雜19.21.1522.081300249601130.449.5176.53.有機溶劑除雜230.46810.764800184001709.424.156.34.有機溶劑沉澱蛋白50.2591.29585042503281.82.913.0

酶的回收率：×100%總活力＝活力單位數(shù)/ml酶液X總體積（ml）比活力＝活力單位數(shù)/mg蛋白＝總活力/總蛋白mg實驗材料、試劑和器材材料：酵母試劑：3.0mol/L乙醇、

0.06mol/L焦磷酸鈉（pH8.5）、

0.0015mol/LNAD+、

0.01mol/LK2HPO4、丙酮（預(yù)冷）、

0.066mol/LNa2HPO4儀器：離心機、可見光分光光度計、紫外光分光光度計、水浴鍋儀器和試劑儀器和用具可見分光光度計，1.0mL加液器，200μL加液器；10mLPA瓶。試劑（1）牛血清白蛋白100μg/mL（標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）（2）考馬斯亮藍

100mgG-250溶於50mL90%乙醇，加85%（W/V）磷酸100mL，用水定容到1000mL。實驗?zāi)康恼莆誗DS檢測蛋白分子量原理和方法掌握垂直板電泳的操作方法實驗步驟1、洗淨(jìng)玻璃板，蒸餾水沖洗3遍，吹幹並安裝電泳槽。2、製作12%分離膠。按下表中所列順序加試劑，輕輕搖勻，加入兩塊玻璃板間，高度約玻璃板高度的一半。3、用1mL蒸餾水封住分離膠液面，室溫聚合約20min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸幹殘餘的水。4、倒出水並用濾紙吸幹，配好5%濃縮膠，輕輕搖勻，加入濃縮膠，迅速插入樣梳，靜置約25分鐘。

※水封的目的是為了使分離膠上沿平直，並排除氣泡。

※凝膠聚合好的標(biāo)誌是膠與水層之間形成清晰的介面?！鶚邮嵝枰淮纹椒€(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，梳底需水準(zhǔn)。12%分離膠試劑名稱12%分離膠ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速劑）10uL10%APS（催化劑，最後加）75uL總體積7.5mL分離膠的高度為整個凝膠高度的一半試劑名稱5%ddH2O3.4mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1MTris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50uLTEMED20uL10%AP（最後加）50uL總體積5mL5%濃縮膠6、將膠板放入電泳槽，加入1×Tris-Gly電泳緩衝液，拔掉梳子，液面應(yīng)該完全沒過電極。7、制樣：待測蛋白40uL+藍色的樣品緩衝液15uL，在沸水中加熱3分鐘，以除掉亞穩(wěn)態(tài)聚合7、點樣點樣孔分別點30ul、15ul和10ul樣品，每板膠點20ulMarker（老師準(zhǔn)備）。8、80V電泳20-30min，等蛋白進入分離膠後，將電壓調(diào)節(jié)到120V，繼續(xù)電泳。溴酚藍接近膠底部時，關(guān)閉電源。電泳結(jié)束。10、撬開玻璃板，將凝膠做好標(biāo)記，放在塑膠盒內(nèi)，加入染色液，染色30min左右。(染色液需回收，可反復(fù)使用)11、染色後的凝膠用蒸餾水煮沸脫色。（高火微波爐中煮5分鐘）實驗步驟蛋白質(zhì)與SDS按1：1.4比例形成複合物，消除了各種蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的遷移速度只取決於分子大小。在15-200KD之間，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)係：logMW=K-bm實驗原理不連續(xù)系統(tǒng):

緩衝液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性。

電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)。連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩衝液pH值及凝膠濃度相同。電荷、分子篩效應(yīng)。（三個不連續(xù)性）1、凝膠孔徑的不連續(xù)性（2種孔徑的凝膠）2、緩衝液離子成分及pH值的不連續(xù)性（2種緩衝體系，3種pH）：濃縮膠，pH6.8，蛋白質(zhì)分子的遷移率比Cl-

低，比Gly高。3、電位梯度不連續(xù)性：快離子（Cl-

）後面形成高電位梯度區(qū)，慢離子（Gly）前面形成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之間的地方，形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的介面，蛋白質(zhì)分子在介面處濃縮成一個狹小的中間層。濃縮效應(yīng)實驗結(jié)果分析繪製標(biāo)準(zhǔn)曲線：logMW=K-bm

蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至分離膠上沿距離相對遷移率=

溴酚藍至分離膠上沿距離

以每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)作縱坐標(biāo)，相對遷移率作橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然後在計算出待測蛋白的遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。實驗試劑

低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Mark）

兔磷酸化酶BMW=97400

牛血清白蛋白MW=66200

兔肌動蛋白MW=43000

牛碳酸酐酶MW=31000

胰蛋白酶抑制劑MW=20100

雞蛋清溶菌酶MW=1440030%丙烯醯胺（Acr）

10%SDS

1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩衝液

1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩衝液

10%過硫酸銨(AP)（現(xiàn)配現(xiàn)用）

TEMED（四甲基乙二胺）

2

樣品緩衝液

10

電極緩衝液母液（pH8.3）

染色液實驗?zāi)康恼莆誈ST親和層析分離純化目標(biāo)蛋白的原理和實驗方法（第一部分）掌握SDS檢測目標(biāo)蛋白原理和方法（第二部分）第一部分

GST親和層析分離純化目標(biāo)蛋白親和層析原理

生物大分子與配體特異非共價可逆結(jié)合酶-底物酶-底物類似物（酶的競爭性抑制劑）抗體-抗原激素-受體外源凝集素-多糖、糖蛋白、細胞表面受體核酸-互補核苷酸序列（Oligo-dT）親和層析原理GST親合層析穀胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST，26kd）穀胱甘肽（GSH）作為配體，共價結(jié)合在葡聚糖上，（Sepharose4B）葡聚糖上的GSH與GST結(jié)合用還原型GSH洗脫GSTGSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4B實驗步驟一、細胞破碎3600mL誘導(dǎo)後的菌液，離心分裝到12只50mL離心管，-20℃保存。（每個班用2管）每管加30mLPBS緩衝液，混勻；超聲3S，暫停5S，持續(xù)15min；平衡，10000rpm/，5min，離心；取25uL上清，作為分離純化前的樣品；每組分取3-5mL上清液，上柱純化。二、裝GSH-Sepharose4B柱1.清洗和裝好層析柱，封閉出口；2.加入2mLPBS；3.取1-2mlGSH-Sepharose4B，加入柱子中；4.打開柱子出口，使PBS緩慢流出。注意：始終保持柱內(nèi)的液面高於GSH-Sepharose4B

三、純化目的蛋白1.用5mlPBS緩衝液洗柱床，重複3遍。2.將混合蛋白質(zhì)溶液2-3mL加到柱子中。3.用5mlPBS緩衝液洗柱子，重複3遍。4.加入1.5ml洗脫液。5.用1.5mL離心管收集洗脫液，每管收集0.3ml（約6滴）,共收集5管。6.PBS緩衝液洗柱子3遍，關(guān)閉出口。7.將第3、4管和第5管用於目的蛋白的檢測。四、SDS樣品製備

0號樣：過柱前的蛋白溶液40uL，加10uL5X

上樣緩衝液。

3號樣：洗脫的蛋白溶液（3號管）40uL，加10uL5X上樣緩衝液。

4號樣：洗脫的蛋白溶液（4號管）40uL，加10uL5X上樣緩衝液。5號樣：洗脫的蛋白溶液（5號管）40uL，加10uL5X上樣緩衝液。

混勻後在沸水中加熱3-5min。03450345M每個樣點30微升親和層析試劑PBS（pH7.4）NaCl（58.5）40g；KCl（74.5）1.0g；KH2PO4（136.09）1.2g；Na2HPO4·12H2O（358.14）18.1g；加水定容到5000mL。親和層析試劑50mMTris-HCl（pH8.0）Tris（121.14）6.055g，溶於900mL水，用HCl調(diào)pH到8.0，用水定容至1000mL。洗脫液還原型穀胱甘肽（307.32）0.15366g，溶於50ml50mMTris-HCl（pH8.0）中。第二部分

SDS檢測目標(biāo)蛋白實驗?zāi)康恼莆誗DS檢測蛋白原理和方法掌握垂直板電泳的操作方法實驗步驟1、洗淨(jìng)玻璃板，蒸餾水沖洗3遍，吹幹並安裝電泳槽。2、製作12%分離膠。按下表中所列順序加試劑，輕輕搖勻，加入兩塊玻璃板間，高度約玻璃板高度的一半。3、用1mL蒸餾水封住分離膠液面，室溫聚合約30min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸幹殘餘的水。4、倒出水並用濾紙吸幹，配好5%濃縮膠，輕輕搖勻，加入濃縮膠，迅速插入樣梳，靜置約30分鐘。

※水封的目的是為了使分離膠上沿平直，並排除氣泡。

※凝膠聚合好的標(biāo)誌是膠與水層之間形成清晰的介面?！鶚邮嵝枰淮纹椒€(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，梳底需水準(zhǔn)。12%分離膠試劑名稱12%分離膠ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速劑）10uL10%APS（催化劑，最後加）75uL總體積7.5mL分離膠的高度為整個凝膠高度的一半試劑名稱5%ddH2O3.4mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1MTris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50uLTEMED20uL10%AP（最後加）50uL總體積5mL5%濃縮膠5.將膠板放入電泳槽，加入1×Tris-Gly電泳緩衝液，拔掉梳子，液面應(yīng)該完全沒過電極。6.點樣（Marker和待測蛋白樣，加入樣品緩衝液）每個點樣孔點30uL樣品，每板膠點15uLMarker。

加樣前，樣品在沸水中加熱3分鐘，以除掉亞穩(wěn)態(tài)聚合7.80V電泳約30min，等蛋白進入分離膠後，將電壓調(diào)節(jié)到120V，繼續(xù)電泳。溴酚藍接近膠底部時，關(guān)閉電源。電泳結(jié)束。實驗步驟8、撬開玻璃板，將凝膠做好標(biāo)記，切除多餘的膠，放在塑膠盒內(nèi)，加入染色液，染色30min左右。(染色液需回收，可反復(fù)使用)9、染色後的凝膠用蒸餾水煮沸脫色。（高火微波爐中煮5分鐘）10、觀察實驗步驟純化前純化後mark實驗試劑

低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白

兔磷酸化酶B97400

牛血清白蛋白66200

兔肌動蛋白43000

牛碳酸酐酶31000

胰蛋白酶抑制劑20100

雞蛋清溶菌酶14400實驗結(jié)果分析繪製標(biāo)準(zhǔn)曲線：logMW=K-bm

蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至分離膠上沿距離相對遷移率=

溴酚藍至分離膠上沿距離

以每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)作縱坐標(biāo)，相對遷移率作橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然後在計算出待測蛋白的遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。蛋白質(zhì)與SDS按1：1.4比例形成複合物，消除了各種蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的遷移速度只取決於分子大小。在15-200KD之間，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)係：logMW=K-bm實驗原理不連續(xù)系統(tǒng):

緩衝液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性。

電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)。連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩衝液pH值及凝膠濃度相同。電荷、分子篩效應(yīng)。（三個不連續(xù)性）1、凝膠孔徑的不連續(xù)性（2種孔徑的凝膠）2、緩衝液離子成分及pH值的不連續(xù)性（2種緩衝體系，3種pH）：濃縮膠，pH6.8，蛋白質(zhì)分子的遷移率比Cl-

低，比Gly高。3、電位梯度不連續(xù)性：快離子（Cl-

）後面形成高電位梯度區(qū)，慢離子（Gly）前面形成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之間的地方，形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的介面，蛋白質(zhì)分子在介面處濃縮成一個狹小的中間層。濃縮效應(yīng)SDS試劑1.30%（W/V）凝膠：丙烯醯胺（Acr）29.0g，亞甲基雙丙烯醯胺（Bis）1.0g，加水到100mL。2.分離膠緩衝液（pH8.8，1.0mol/LTris-HCl）：三羥甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，加約80mL蒸餾水，用1.0mol/LHCl調(diào)節(jié)pH到8.8，用蒸餾水稀釋到100mL。3.濃縮膠緩衝液（1.0mol/LTris-HCl，pH6.8）

Tris12.1g，加約60mL蒸餾水，用1.0mol/LHCl調(diào)節(jié)pH到6.8，加蒸餾水到100mL。4.10.0%（W/V）SDS5.10.0%（W/V）過硫酸銨（現(xiàn)用現(xiàn)配）6.10X電極緩衝液（pH8.3）：Tris30.3g，Gly144.2g，SDS10.0g，加水到1000mL。（用時稀釋10倍）7.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，加200uL水溶解，加50uL上樣緩衝液。實驗原理SDS轉(zhuǎn)膜結(jié)合一抗和二抗顯色蛋白質(zhì)與SDS按1：1.4比例形成複合物，消除了各種蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的遷移速度只取決於分子大小。在15-200KD之間，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)係：logMW=K-bmSDS實驗原理170kd130kd95kd72kd55kd43kd34kd26kd17kd10kd預(yù)染markerWesternBlottingWesternBlotting顯色原理二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是過氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物。樣品和抗體大腸桿菌可溶蛋白（含GST蛋白）一抗鼠抗GST抗體二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體實驗步驟SDS（每班做8版膠，用4個電泳槽）1、洗淨(jìng)玻璃板，蒸餾水沖洗3遍，吹幹並安裝電泳槽。3、製作12%分離膠。按下表中所列順序加試劑，輕輕搖勻，加入兩塊玻璃板間。4、用1mL蒸餾水封住分離膠液面，室溫聚合約15min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸幹殘餘的水。5、倒出水並用濾紙吸幹，配好濃縮膠（10ml），輕輕搖勻，加入濃縮膠，迅速插入樣梳，靜置約20分鐘。

※水封的目的是為了使分離膠上沿平直，並排除氣泡。

※凝膠聚合好的標(biāo)誌是膠與水層之間形成清晰的介面。※樣梳需一次平穩(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，梳底需水準(zhǔn)。12%分離膠試劑名稱12%分離膠ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速劑）10uL10%APS（催化劑，最後加）75uL總體積7.5mL試劑名稱5%ddH2O3.4mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1MTris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50uLTEMED20uL10%AP（最後加）50uL總體積5mL5%濃縮膠6、將膠板放入電泳槽，加入1×Tris-Gly電泳緩衝液，拔掉梳子，液面應(yīng)該完全沒過電極。7、點樣（待測蛋白樣，加入樣品緩衝液）每個點樣孔點15ul樣品，每板膠點5ul預(yù)染Marker（預(yù)染Marker是有顏色的，可以作為電泳和轉(zhuǎn)膜的指示）。

加樣前，樣品在沸水中加熱3分鐘，以除掉亞穩(wěn)態(tài)聚合8、80V電泳20min，等蛋白進入分離膠後，將電壓調(diào)節(jié)到120V，電泳2h。9、溴酚藍接近膠底部時，關(guān)閉電源。電泳結(jié)束10、撬開玻璃板，根據(jù)預(yù)染Marker和溴酚藍的位置切去濃縮膠和多餘的分離膠，（不要染色）SDSSDS樣品製備

0號樣：未純化的蛋白溶液20uL，加5uL5×上樣緩衝液。

1號樣：純化的蛋白溶液20uL，加5uL5×上樣緩衝液?；靹蜥嵩诜兴屑訜?-5min。12345678910預(yù)染marker未純化15uL純化15uL未純化10uL純化10uL1、用尺量出膠的長度和寬度

2、用裁紙刀裁出12張與膠大小一樣的濾紙和1張同樣大小硝酸纖維素膜（NC膜）