13 標記抗體技術(shù)

朽木易折，金石可鏤。千里之行，始于足下。第頁/共頁十三章標記抗體技術(shù)一、名詞解釋標記抗體技術(shù)：將抗原抗體結(jié)合的特異性和標記分子的敏感性結(jié)合在一起建立的一種用以檢測抗原（或抗體）的技術(shù)。包括：熒光免疫技術(shù)（熒光抗體技術(shù)）免疫酶技術(shù)（酶標抗體技術(shù)）發(fā)射免疫標記技術(shù)（同位素標記抗體技術(shù)）免疫熒光技術(shù)：是將抗原抗體反應(yīng)的特異性、熒光素物質(zhì)的高敏感性、以及顯微鏡技術(shù)確實切性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。酶免疫技術(shù)：是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化和生物放大作用相結(jié)合的一種標記免疫技術(shù)。發(fā)射性免疫標記技術(shù)：是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與同位素分析的高靈巧性相結(jié)合，以發(fā)射性同位素作為示蹤物的標記免疫技術(shù)。可用于定量分析和定性分析。二、簡答題1.（了解）免疫熒光抗體技術(shù)的原理、常用的熒光色素、各種熒光抗體染色主意的優(yōu)缺點及其用途？免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性、熒光素物質(zhì)的高敏感性、以及顯微鏡技術(shù)確實切性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。（1）原理：利用熒光素標記抗體，與標本中待測抗原特異性結(jié)合，采用發(fā)光光源使之發(fā)出熒光，得以判斷有無待測抗原。（2）常用的熒光色素：異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明（3）熒光抗體染色主意：①直接法：Ab+熒光色素→Ab*（熒光標記的抗體）Ag+Ab*→Ag-Ab*（特異熒光）優(yōu)點：主意簡便、需時較短、特異性強缺點：不能用已知抗原檢查未知抗體一種標記抗體只能檢測一種抗原，敏感性較差②間接法：Ag+Ab→Ag-AbAg-Ab+GAb*→Ag-Ab-GAb*優(yōu)點：能檢測未知抗原、抗體用一種標記的抗抗體能與所有在種屬上相應(yīng)的抗體結(jié)合敏感性較高缺點：實驗主意繁瑣，需要的對照多，需時長③抗補體染色法：Ag+Ab+C→Ag-Ab-CAg-Ab-C+CＡb*→Ag-Ab-C-CAb*優(yōu)點：只用一種標記的抗抗體就能檢測所有的抗原-抗體系統(tǒng)缺點：參加反應(yīng)成分多，實驗主意繁瑣（4）應(yīng)用：細菌性診斷、病毒學診斷、淋巴細胞的分類和亞型鑒定2.（了解）發(fā)射性免疫分析的基本原理，發(fā)射免疫主意的優(yōu)缺點？發(fā)射性免疫標記技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與同位素分析的高靈巧性相結(jié)合，以發(fā)射性同位素作為示蹤物的標記免疫技術(shù)?？捎糜诙糠治龊投ㄐ苑治?。（1）基本原理：將發(fā)射性同位素標記抗體，與標本中待測抗原特異性結(jié)合，發(fā)射性同位素衰變時會放出不同的射線，可以被儀器探測出來，從而得以判斷有無待測抗原。（2）挑選發(fā)射性同位素的原則：①經(jīng)濟，測定主意容易，便于推廣②易于防護，輻射損傷小③有較高的計數(shù)效率（3）發(fā)射性免疫技術(shù)的優(yōu)缺點：優(yōu)點：靈巧度高、特異性強、重復(fù)性好、試劑用量少缺點：有輻射性、需要異常儀器（4）應(yīng)用：疾病診斷、激素等微量活性物質(zhì)測定、藥物檢測3.（控制）酶免疫技術(shù)的原理，優(yōu)點，用途？（1）原理：酶免疫技術(shù)是三大免疫標記技術(shù)之一，是以酶標記抗原或抗體為主要試劑的一種標記免疫分析技術(shù)。是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化和生物放大作用相結(jié)合的一種標記免疫技術(shù)。（2）優(yōu)點：①檢測靈巧度高，特異性強，確切性好②酶標記試劑能較長時光保持穩(wěn)定③檢測主意簡便安全易行④易與其他技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新主意（3）應(yīng)用：①病原體及其抗體的檢測及傳染病的診斷②疫病大批量樣品的檢測，傳染病的監(jiān)測及流行情況的調(diào)查③各種免疫球蛋白，補體組分，各種血漿蛋白質(zhì)，酶及激素的測定④肉，奶制品中抗生素及激素等殘留物的檢測⑤肉品，飼料中藥物殘留及一些含量極低的有毒有害物質(zhì)的檢測⑥水產(chǎn)品中病原菌，毒素等的檢測⑦食品中真菌毒素，農(nóng)藥殘留的測定4.（控制）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的原理、主要主意及其用途？（1）基本原理：把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面；測定時，將待檢樣品和酶標記物按一定程序反應(yīng)形成復(fù)合物，并參加酶作用的底物；反應(yīng)終止時，按照定性或定量分析有色產(chǎn)物的量來決定待檢樣品中的抗原或抗體的含量。（2）主要主意：直接法、間接法、雙抗體法、競爭法、雙夾心法、阻斷法、酶-抗酶抗體法等（記得搞清晰所有主意的原理步驟）（3）用途：ELISA主意已被廣泛應(yīng)用于多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病等的診斷中已為廣泛采用的標準主意。5.能夠按照要求自行設(shè)計一種ELISA主意，試述其主要步驟及結(jié)果的判定？利用間接ELISA主意測定豬繁殖與呼吸道征【實驗原理】把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面；測定時，將待檢樣品和酶標記物按一定程序反應(yīng)形成復(fù)合物，并參加酶作用的底物；反應(yīng)終止時，按照定性或定量分析有色產(chǎn)物的量來決定待檢樣品中的抗原或抗體的含量。【實驗步驟】⑴包被：用包被緩沖液將PRRS病毒抗原稀釋到5μg/mL，在96孔酶標板上每孔加100μL，4℃過夜⑵洗滌：甩去包被緩沖液，用PBST液洗滌3次，拍干⑶封閉：每孔參加300μL稀釋液，37℃溫水浴孵育30分鐘⑷洗滌：同⑵⑸加樣：設(shè)陰性、陽性對照各2孔，樣品孔4個；陰性、陽性對照孔分離加陰性、陽性對照血清100μL；樣品孔每孔先加樣品稀釋液100μL；37℃溫水浴孵育30分鐘⑹洗滌：同⑵⑺每孔加辣根過氧化物酶標記的抗豬IgG抗體100μL；37℃溫水浴孵育30分鐘⑻洗滌：同⑵⑼顯色：每孔加100μL清新配置的底物溶液；常溫下