高純度苦瓜素類化合物的制備技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)團體標(biāo)準(zhǔn)

1高純度苦瓜素類化合物的制備技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)本部分規(guī)定了高純度苦瓜素類化合物苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜素L的制備方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于高純度苦瓜素類化合物苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜素L的制備方法。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法HY/T229-2018海洋生物活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)構(gòu)確證方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1高效液相色譜highperformanceliquidchromatography儀器配置包括：色譜泵及控制器、色譜柱、檢測器、進樣器、數(shù)據(jù)處理及控制。以液體為流動相，通過高壓輸液系統(tǒng)，把不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。3.2浸提法extractionmethod用揮發(fā)性有機溶劑將原料中的某些成分轉(zhuǎn)移到溶劑相中，然后通過蒸發(fā)、蒸餾等手段回收有機溶劑，而得到所需的較為純凈的萃取組分。3.3真空抽濾vacuumfiltration抽濾裝置一般由布氏漏斗、抽濾瓶和抽氣泵組成。利用抽氣泵使抽濾瓶中的壓強降低，達到固液分離的目的的方法。3.4液質(zhì)聯(lián)用highperformanceliquidchromatographymassspectrometry以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。23.5核磁共振譜nuclearmagneticresonancespectroscopy研究原子核對射頻輻射(Radio-frequencyRadiation)的吸收，它是對各種有機和無機物的成分、結(jié)構(gòu)進行定性分析的最強有力的工具之一，有時亦可進行定量分析。本方法主要應(yīng)用氫譜和碳譜鑒定分子結(jié)構(gòu)式。4試劑耗材、儀器設(shè)備4.1試劑耗材本方法高效液相色譜系統(tǒng)所使用的試劑均為色譜純，其余試劑均為分析純，實驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。甲醇、二甲基亞砜DMSO為國產(chǎn)分析純。雙圈濾紙、0.22μm微孔濾膜、一次性注射器。4.2儀器設(shè)備高效液相色譜、真空抽濾裝置、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、凍干機。5制備流程5.1樣品前處理新鮮苦瓜莖葉干燥，研磨成粉。5.2浸提用甲醇對苦瓜莖葉干粉進行浸提24h，甲醇與苦瓜莖葉干粉的用量比為1:5（g:mL），對浸提液進行真空抽濾，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸餾濃縮，得到粗提物。5.3高效液相色譜分離5.3.1一級高效液相色譜分離使用甲醇溶解4.2所得到的粗提物，并用0.22μm濾膜進行過濾。對過濾后的粗提物進行一級高效液相色譜分離，分離的的參數(shù)為：流動相為80%甲醇、柱溫度為28℃、流速為2.5mL/min、分離柱為AgilentXB-C18、檢測波長為210nm。分別收集18～26min時間段和30～42min時間段的流出液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸餾濃縮，并通過凍干機進行冷凍干燥，即得一級分離物1和一級分離物2。5.3.2二級高效液相色譜分離使用甲醇溶解4.3.1所得到的一級分離物1和一級分離物2，并用0.22μm濾膜進行過濾。分別對過濾后的一級分離物1和一級分離物2進行二級高效液相色譜分離，分離的參數(shù)與一級高效液相色譜分離參與相同。對于一級分離物1分別收18～22min時間段和24～26min時間段的流出液，蒸餾濃縮，冷凍干燥，得二級分離物1-1和二級分離物1-2，對于一級分離物2收集33～37min時間段的流出液，蒸餾濃縮，冷3凍干燥，得二級分離物2-1。5.3.3三級高效液相色譜分離使用甲醇溶解4.3.2所得到的二級分離物1-1、二級分離物1-2、二級分離物2-1，并用0.22μm濾膜進行過濾。分別對過濾后的二級分離物1-1、二級分離物1-2、二級分離物2-1進行三級高效液相色譜分離，分離的參數(shù)與一級高效液相色譜分離參與相同。分別收集20～23min時間段、23～26min時間段以及34~37min時間段的流出液，蒸餾濃縮，冷凍干燥，分別得到純度為95%以上的苦瓜素Ⅱ、苦瓜素L和苦瓜素Ⅰ。6物質(zhì)鑒定參照HY/T229-2018海洋生物活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)構(gòu)確證方法中的結(jié)構(gòu)確證方法對所得的苦瓜素類化合物進行結(jié)構(gòu)確證。4附錄A（資料性附錄）苦瓜素Ⅱ、苦瓜素L和苦瓜素Ⅰ的結(jié)構(gòu)信息A.1苦瓜素ⅡA.1.1理化性質(zhì)白色粉末，易溶于甲醇、丙酮，難溶于水。A.1.2液相色譜結(jié)果見圖A.1。圖A.1苦瓜素ⅡHPLC色譜圖A.1.3質(zhì)譜ESI-MS:[M+Na]+為m/z657[M+Na]+，分子量為634，分子式C36H58O9。A.1.4核磁共振譜1HNMR(400MHz,C5D5N)δ:10.65(1H,s,H-19),6.27(1H,d,J=4.4Hz,H-6),5.61(1H,d,J=7.8Hz,H-24),4.96(1H,d,J=7.8Hz,Glc-1),4.96(1H,d,J=7.6Hz,H-23),4.46(1H,d,J=10.8Hz,Glc-6b),4.35(1H,d,J=10.8Hz,Glc-6a),4.35(1H,d,J=5.2Hz,H-7),4.21(2H,brd,J=6.0Hz,Glc-3,4),4.01(1H,brs,Glc-2),3.88(1H,brs,Glc-5),3.81(1H,brs,H-3),2.71(1H,m,H-10),2.37(1H,s,H-8),2.07(1H,m,H-20),1.75,1.71(each3H,s,H-265andH-27),1.19(3H,d,J=6.4Hz,H-21),1.48,1.12,0.90,0.87(each3H,s)。13CNMR(100MHz,C5D5N):結(jié)果見表A.1。表A.1苦瓜素Ⅱ的13CNMR譜數(shù)據(jù)列表C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C1221.929.875.641.765.750.550.636.822.729.6C13C14C15C16C17C18C19C20C21C22C23C2445.948.234.927.851.2207.732.643.775.3C25C26C27C28C29C3023-glc23-glc23-glc23-glc23-glc23-glc26.225.827.375.678.971.978.263.0A.1.5分子結(jié)構(gòu)圖結(jié)果見圖A.2。23-O-β-D-glucopyranosyl-3,7-dihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al圖A.2苦瓜素Ⅱ分子結(jié)構(gòu)圖A.2苦瓜素LA.2.1理化性質(zhì)白色片晶，易溶于甲醇、丙酮，難溶于水。A.2.2液相色譜結(jié)果見圖A.3。6圖A.3苦瓜素LHPLC色譜圖A.2.3質(zhì)譜ESI-MS:[M+Na]+為m/z495[M+Na]+，分子量為472，分子式C30H48O4。A.2.4核磁共振譜1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:0.81,0.86,1.07,1.24(each3H,s,CH3-18,28,29,30),1.25(6H,s,CH3-26,27),0.94(3H,d,J=5.6Hz,CH3-21),3.54(1H,brs,H-3),3.99(1H,brd,J=5.6Hz,H-7),5.57(2H,brs,H-23,24),9.87(1H,s,H-19)。13CNMR(100MHz,MetoD):結(jié)果見表A.2。表A.2苦瓜素L的13CNMR譜數(shù)據(jù)列表C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C1221.929.877.042.366.930.251.337.635.737.6C13C14C15C16C17C18C19C20C21C22C23C2446.650.828.629.951.1209.430.140.3C25C26C27C28C29C3071.126.023.327.822.3A.2.5分子結(jié)構(gòu)圖結(jié)果見圖A.4。73β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al圖A.4苦瓜素L分子結(jié)構(gòu)圖A.3苦瓜素ⅠA.3.1理化性質(zhì)白色粉末，易溶于甲醇、丙酮，難溶于水。A.3.2液相色譜結(jié)果見圖A.5。圖A.5苦瓜素ⅠHPLC色譜圖A.3.3質(zhì)譜ESI-MS:[M+Na]+為m/z495[M+Na]+，分子量為472，分子式C30H48O4。8A.3.4核磁共振譜1HNMR(400MHz,MeOD)δ:9.88(1H,s,H-19),5.91(1H,d,J=4.0Hz),5.16(1H,d,J=8.8Hz,H-24),4.41(1H,dt,J1=J2=8.8Hz,J3=3.2,H-23),4.00(1H,d,J=5.2Hz,H-7),3.55(1H,brs,H-3),2.58(1H,m,H-10),2.40(1H,m,H-8),1.98(1H,m,H-20),1.70,1.67(each3H,s,H-26,27),1.00(3H,d,J=6.4Hz,H-21),1.25,1.08,0.93,0.82(each3H,s)。13CNMR(100MHz,MetoD):結(jié)果見表A.3。表A.3苦瓜素Ⅰ的13CNMR譜數(shù)據(jù)列表C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C1