【Syx】PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))課件-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

第2節(jié)基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序分為哪四個(gè)步驟？2.什么叫目的基因？獲得目的基因的方法有哪些？13.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是什么？14.構(gòu)建好的基因表達(dá)載體主要由哪些部分組成？每個(gè)部分作用是什么？構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程是怎樣的？15.啟動(dòng)子和起始密碼子、終止子和終止密碼子區(qū)別？17.把目的基因?qū)胫参锛?xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌的方法分別是？18.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適合把目的基因?qū)胧裁礃拥闹参锛?xì)胞？19.為什么要把目的基因插入農(nóng)桿菌的T-DNA？20.把目的基因?qū)氪竽c桿菌為什么要先用Ca2+處理大腸桿菌？21.怎樣檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞？是否轉(zhuǎn)錄出mRNA和翻譯出蛋白質(zhì)？22.如何從個(gè)體水平檢測(cè)植物是否出現(xiàn)了抗?。ㄏx）特性？3.PCR的具體含義是什么？使用到的儀器叫什么？4.PCR擴(kuò)增DNA的條件有哪些？5.PCR的每個(gè)循環(huán)可以分為哪三步？每一步的溫度大致為多少？每一步的具體含義是什么？6.PCR時(shí),引物與模板鏈的哪一側(cè)配對(duì)？7.子鏈的合成方向？脫氧核苷酸加在引物的哪一端？8.在DNA聚合酶的作用下，兩個(gè)引物之間的DNA序列以什么形式擴(kuò)增？9.一個(gè)DNA復(fù)制n次需要引物多少種多少個(gè)？10.一個(gè)DNA復(fù)制n次總共可形成多少個(gè)DNA？其中含有引物的DNA有多少個(gè)？只含目的基因片段（不含黏性末端）的DNA有多少個(gè)？11.一個(gè)DNA復(fù)制第n次需要多少種引物？多少個(gè)引物？12.常用什么方法鑒定PCR的產(chǎn)物？DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.PCR擴(kuò)增DNA的原理是什么？2.電泳鑒定DNA的原理是什么？3.PCR擴(kuò)增DNA時(shí)，微量離心管中要加入哪些成分？4.凝膠中DNA分子的遷移速率與什么有關(guān)？5.PCR每個(gè)循環(huán)程序要經(jīng)歷哪三步？溫度、時(shí)間？6.接通電源后，DNA向陰極還是向陽極移動(dòng)?

7.凝膠中留一個(gè)加樣孔加標(biāo)準(zhǔn)參照物的目的是什么？8.PCR所得DNA電泳后出現(xiàn)位置不同的幾條帶，原因可能是什么？第三章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序PCR

(1)概念：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。1.DNA復(fù)制的條件？2.什么是引物？為什么要用引物？引物的作用是什么？1.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))模板：

原料：

能量：

酶：

DNA的兩條母鏈。4種脫氧核糖核苷酸。ATP解旋酶、DNA聚合酶引物作用：為DNA聚合酶提供了游離的3’端，使DNA聚合酶從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3’端延伸DNA。(2)PCR的條件:①DNA（含目的基因）模板；②分別與模板DNA相結(jié)合的兩種引物；③A、T、G、C四種脫氧核苷酸；④耐高溫的DNA聚合酶；⑤穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）；⑥能嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（DNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶（3）擴(kuò)增過程：3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性50℃左右，兩種引物與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸72℃左右，4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶作用下，合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’瓊脂糖凝膠電泳（4）產(chǎn)物鑒定：擴(kuò)增次數(shù)第1次第2次第3次第n次DNA分子數(shù)含引物A(或B)的DNA分子數(shù)同時(shí)含引物A、B的DNA分子數(shù)共消耗的引物數(shù)量22046814262n2n+1-22n-21372n-1利用PCR技術(shù)獲取目的基因，請(qǐng)畫出擴(kuò)增2次的結(jié)果？思考：PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因（等長(zhǎng)的DNA片段）？思考：1個(gè)DNA循環(huán)n次后產(chǎn)生目的基因多少個(gè)？2n-2n通過設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。下圖是獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中在目的基因兩端的引物中分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是A．限制酶a和限制酶b的識(shí)別序列應(yīng)分別增加至引物1和引物2的5'端B．通過兩種限制酶將擴(kuò)增出的含突變位點(diǎn)的目的基因切割下來有利于其定向插入載體C．第3輪PCR結(jié)束后，兩條鏈完全等長(zhǎng)的且含有突變堿基對(duì)的DNA分子有1個(gè)D．在第3輪PCR結(jié)束后，同時(shí)含引物1和引物2的DNA占3/4實(shí)驗(yàn)探究：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.PCR擴(kuò)增DNA的原理是什么？2.電泳鑒定DNA的原理是什么？3.凝膠中DNA分子的遷移速率與什么有關(guān)？4.凝膠中DNA如何檢測(cè)？5.凝膠中留一個(gè)加樣孔加標(biāo)準(zhǔn)參照物的目的是什么？加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物6.PCR所得DNA電泳后出現(xiàn)位置不同的幾條帶，原因可能是什么？如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。PCR引物設(shè)計(jì)原則

兩種引物是對(duì)向的，目的基因在中間；兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的_____端，子鏈延伸時(shí)沿著引物向

端延伸；引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列兩條引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列引物越長(zhǎng)，G+C比例越高，退火溫度越高引物的長(zhǎng)度一般在18~25b（base堿基），太短則特異性不夠強(qiáng)，太長(zhǎng)則退火溫度會(huì)比較高。兩條引物的退火溫度相差不能大于5℃。如果相差太大，操作時(shí)一般選擇較低的那個(gè)退火溫度，那么另一條引物的非特異性結(jié)合就會(huì)增加。⑥需在兩種引物的5’端加上啟動(dòng)子（或終止子）序列和限制酶的酶識(shí)別序列3’3’1.在“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)中，防止DNA被污染的操作有哪？提示(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。(2)在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。(3)在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。拓展

提升科學(xué)思維2.如何來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果？提示觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。DD367(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)需要兩種引物，原因是什么？提示目的基因的兩條反向平行的鏈都作為模板，其堿基序列不同。(4)在PCR擴(kuò)增目的基因之前，需先設(shè)計(jì)引物，對(duì)設(shè)計(jì)的兩種引物之間的堿基序列的要求是什么？提示兩種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì)。(5)為檢測(cè)胚乳細(xì)胞中Wx基因是否表達(dá)，科研人員提取胚乳中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)。CD（6）n輪：(2n＋1－2)個(gè)，第n輪：2n個(gè)。PCR方法步驟用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液離心擴(kuò)增根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。電泳方法步驟將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳、觀察接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。利用