TSDYYXH 02-2023 基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性快速評價方法

ICS11.120.01CCSC10SDYYXH團 體 標 準T/SDYYXH02—2023基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性快速評價方法Arapidmethodforevaluatingearlynephrotoxicityofdrugsusingzebrafishmodel2023-12-28發(fā)布 2023-12-28實施山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會??發(fā)布T/SDYYXH02T/SDYYXH02—2023PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 3規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 3方法原理 4受試物 4儀器設(shè)備 4試驗準備 4試驗步驟 5保證試驗有效性的條件 6判定標準 6數(shù)據(jù)處理 6試驗報告 6附 錄 A （資料性）斑馬魚典型圖片 8前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會提出并歸口。本文件主要起草單位：山東省科學院生物研究所。山東宏濟堂制藥集團股份有限公司T/SDYYXH02T/SDYYXH02—2023PAGEPAGE3基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性快速評價方法范圍本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性評價。規(guī)范性引用文件（）GB/T39649實驗動物實驗與質(zhì)量控制GB/T21808化學品魚類延長毒性14天試驗GB5749生活飲用水衛(wèi)生標準術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。斑馬魚 zebrafish模式動物的一種，常用于教學和科研。生物分類學上屬于脊索動物門、脊椎動物亞門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、斑馬魚屬、斑馬魚種。AB系斑馬魚 ABstrainzebrafish實驗室常用斑馬魚品系，由單倍體細胞經(jīng)早期加壓法獲得。仔魚 larva性腺發(fā)育尚未成熟的斑馬魚。受精后小時數(shù) hourspost-fertilization（hpf）斑馬魚胚胎體外受精后的小時數(shù)。眼周水腫 periocularedema斑馬魚雙眼內(nèi)部由于水分分布失衡，液體局部堆積使眼外圍輪廓異常膨大。肌酐 creatinine腎小球尿蛋白 proteinuria尿液中的蛋白質(zhì)含量增加而能夠被檢測到，反映腎臟濾過屏障功能情況。10 死度 10 letalcocenrato（L）受試物導(dǎo)致10%受試魚死亡的濃度。15秒內(nèi)沒有心跳判定為死亡。熒光實時定量聚合酶鏈式反應(yīng) Real-timequantitativePCR（RT-qPCR）在DNA擴增反應(yīng)中，應(yīng)用熒光化學物質(zhì)檢測每次聚合酶鏈式反應(yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。方法原理，72hpfnephrinkim1kim1受試物樣品配制水溶性樣品：斑馬魚培養(yǎng)水直接溶解配制成檢測溶液。非水溶性樣品：選用有機溶劑、乳化劑或分散劑等進行助溶，制備成均勻分散的懸濁液或乳濁液。受試物準備量10?mg～50?mg。30?mL～50?mL。受試物相關(guān)信息受試物的名稱、來源、性狀、批號、規(guī)格、生產(chǎn)日期、保存條件、有效期和配制方法。受試物為單體成分時，還需要提供該成分相應(yīng)的化學信息，包括分子量、分子式、分子結(jié)構(gòu)。提供受試物理化性質(zhì)，包含如下信息：在水中或其它溶劑中的溶解性；在水中和光中的穩(wěn)定性；溫度對受試物穩(wěn)定性的影響。儀器設(shè)備0.0001g。量筒。500mL0.5mL40RTqPR6孔半導(dǎo)體控溫PR0.250～99.9℃。恒溫光照培養(yǎng)箱。精度±1斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。配備溫控裝置，水循環(huán)和過濾裝置。水質(zhì)監(jiān)測設(shè)備。pH試驗容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時，應(yīng)選用惰性材料（如玻璃）來減少吸附。低溫高速離心機。配備致冷控溫裝置，轉(zhuǎn)速≥5000rpm。蛋白凝膠電泳儀。配帶垂直蛋白凝膠電泳槽。0.5mL～50mL。96試驗準備受試斑馬魚72hpf健康A(chǔ)BGB/T39649斑馬魚培養(yǎng)水24h（GB57495mmol/LNaCl、0.17mmo/LKC0.4mmo/LCaC2和0.16mmo/LMgS。14625gNal0.64gKC2.20gCal2和1.72gMgS7HO1000mL5020mL的50980mL1pH6.58.以CaC3計為10mg/～250mgL6.0mg/。注：此培養(yǎng)水為斑馬魚提供最適生存水環(huán)境。試驗溶液配制pH6.5～8.0pHpH6.58.0GB/T218086.3.2pH非水溶性受試物，添加有機溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗溶液的均勻度。受100mg/L。試驗步驟試驗分組試驗設(shè)置空白對照組、陽性對照組和受試物組，如使用助溶劑，增設(shè)1個溶劑對照組。空白對照組設(shè)置AB24152mL斑，6505mL溶劑對照組設(shè)置AB24152mL助溶劑溶液，6孔板中每孔含50尾仔魚和5mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的陽性對照組設(shè)置a2mMAB24152mL5μM馬兜a，6505mL5μMa受試物組設(shè)置AB24152mL受6505mL暴露條件28.5124h。注：暴露期間禁止喂食。斑馬魚表型觀察暴露結(jié)束，將仔魚放置載玻片，調(diào)至俯臥位，顯微鏡下觀察仔魚眼部形態(tài)，采集圖像。斑馬魚組織肌酐水平檢測暴露結(jié)束后，收集仔魚，加入適量體積0.9%NaCl溶液，冰浴下充分勻漿。離心后取上清，過柱去蛋白，按試劑盒步驟檢測每組樣品中肌酐含量。斑馬魚尿蛋白檢測SDS基因檢測RT-qPCR保證試驗有效性的條件90水溶性受試物可配制成澄清溶液，非水溶性受試物可選用二甲基亞砜、乙醇、丙酮等有機溶劑進行助溶。斑馬魚圖像采集時，各組間拍照參數(shù)一致。判定標準受試物組與空白對照組相比，斑馬魚組織肌酐水平在統(tǒng)計學上顯著增加結(jié)果可作為受試物具有腎毒性的支持證據(jù)，但不替代人體功能檢測。受試物組與空白對照組相比，斑馬魚腎病蛋白基因和腎損傷分子基因的表達量在統(tǒng)計學上顯著增加數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計分析方法：方差分析（ANOVA）T-test試驗報告試驗報告包含下列內(nèi)容：受試物——物理屬性、物理/化學特性；受試斑馬魚——學名、品系、來源、發(fā)育階段、受精卵收集方法及后續(xù)處理；試驗條件：光照周期；試驗設(shè)計（試驗容器及其平行的數(shù)目，每個平行中的仔魚數(shù)量）；制備儲備液的方法；若使用助溶劑，應(yīng)給出其成分和濃度；斑馬魚培養(yǎng)水特性：pH試驗容器內(nèi)的水質(zhì)：pH喂食情況。試驗結(jié)果：斑馬魚頭部照片（A1）；斑馬