流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)規(guī)范

JJF1665—20171流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于基于熒光檢測(cè)原理的分析型流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)。其他類型的流式細(xì)胞儀(以下簡(jiǎn)稱儀器),可參照本規(guī)范執(zhí)行。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件:JJF1071—2010國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則JJF1265生物計(jì)量術(shù)語(yǔ)及定義凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本規(guī)范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。3術(shù)語(yǔ)JJF1265定義的及以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)范。3.1等量可溶性熒光分子moleculesofequivalentsolublefluorochrome,MESF顆粒發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度相當(dāng)?shù)目扇苄詿晒馑胤肿拥奈镔|(zhì)的量濃度。用于表示顆粒發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度。4概述流式細(xì)胞儀由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和分析系統(tǒng)四部分組成(見圖1)。測(cè)量原理為鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束,與水平方向的激光束垂直相交,染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光或產(chǎn)生散射光,這些信號(hào)分別被光電倍增管熒光檢測(cè)器和光電二極管散射光檢測(cè)器接收,經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息,就可得到細(xì)胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。5計(jì)量特性5.1分辨力5.2線性相關(guān)系數(shù)5.3檢出限5.4漂移5.5重復(fù)性5.6示值誤差JJF1665—20172圖1流式細(xì)胞儀組成示意圖6校準(zhǔn)條件6.1環(huán)境條件實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)當(dāng)滿足儀器廠家的安裝要求:環(huán)境溫度(15~30)℃;相對(duì)濕度≤70%。6.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和校準(zhǔn)設(shè)備6.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單一熒光強(qiáng)度的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);計(jì)數(shù)熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.2.有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),相對(duì)擴(kuò)展不確定度不超過20%(k=2)。去離子水(18.2MΩ·cm,0.22μm濾膜過濾);0.1mol/L磷酸鈉緩沖液pH(7.2~7.4)。6.2.3校準(zhǔn)設(shè)備移液器,量程(200~1000)μL,B級(jí)及以上。校準(zhǔn)設(shè)備需經(jīng)檢定合格。37校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法7.1分辨力儀器經(jīng)預(yù)熱,進(jìn)入正常工作狀態(tài)。在裝有0.5mL經(jīng)過0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中,移取0.5mL單一熒光強(qiáng)度的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),充分混勻后上機(jī)實(shí)驗(yàn)。記錄前向角散射光和488nm激發(fā)下兩個(gè)熒光通道,包括綠色熒光(FITC異硫氰酸熒光素)、橙紅色熒光(PE藻紅蛋白)。收集門內(nèi)有效信號(hào)10000個(gè),按式(1)計(jì)算前向角散射光和兩個(gè)熒光通道中校準(zhǔn)微球峰寬的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),以表示分辨力。RSD=×100%(1)式中:RSD—相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,%;δ—顆粒分布的標(biāo)準(zhǔn)差;μ—顆粒分布的平均值。7.2線性相關(guān)系數(shù)在裝有1mL經(jīng)過0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中加入20μL多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),充分混勻后上機(jī)實(shí)驗(yàn),記錄488nm激發(fā)下綠色熒光(FITC)、橙紅色熒光(PE)通道信號(hào)。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直方圖分析,熒光強(qiáng)度從低到高至少5種不同的熒光強(qiáng)度峰(峰的數(shù)量和強(qiáng)度取決于所采用的多重?zé)晒鈴?qiáng)度水平標(biāo)準(zhǔn)微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)),每個(gè)峰收集10000個(gè)門內(nèi)有效信號(hào),得到每個(gè)峰的平均熒光強(qiáng)度。根據(jù)校準(zhǔn)微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的各個(gè)峰的等量可溶性熒光分子(MESF),將各峰的MESF取對(duì)數(shù)lg(MESF),簡(jiǎn)化表示為y,各峰測(cè)量的平均熒光強(qiáng)度取對(duì)數(shù)lg(FITC)或lg(PE),簡(jiǎn)化表示為x,將兩者線性回歸得到方程y=kx+b,按式(2)分別計(jì)算兩個(gè)通道的線性相關(guān)系數(shù)(r)。r=式中:(xi-x)(yi-y)i=1 (- (-) (x-x)2×yiyii=1i=i=1(2)r—線性相關(guān)系數(shù);xi—第i個(gè)峰的熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值; x—每個(gè)峰的熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值的平均值;yi—多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中各個(gè)水平的熒光微球的MESF的對(duì)數(shù)值;y—多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的熒光微球的MESF的對(duì)數(shù)值的平均值;n—峰的個(gè)數(shù)。JJF1665—201747.3檢出限針對(duì)綠色熒光(FITC)和橙紅色熒光(PE)熒光通道,采用方法7.2中得到的線的MESF即為熒光檢出限(LOD)。性回歸方程y=kx的MESF即為熒光檢出限(LOD)。線性回歸方程的斜率k為:k=(3)截距b為:則檢出限(LOD)的計(jì)算公式為:則檢出限(LOD)的計(jì)算公式為:式中:LOD—檢出限;xi—第i個(gè)峰的熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值; x—每個(gè)峰的熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值的平均值;x0—無熒光標(biāo)記的空白微球的測(cè)得的熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值;yi—多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中各個(gè)水平的熒光微球的MESF的對(duì) 數(shù)值;y—多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的熒光微球的MESF的對(duì)數(shù)值的平均值;n—峰的個(gè)數(shù);k—線性回歸方程的斜率;b—線性回歸方程的截距。lg(LOD)=kx0+b(5)7.4漂移將周圍環(huán)境溫度控制在允許范圍(設(shè)定溫度±3℃)內(nèi),在裝有1mL經(jīng)過0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中,加入數(shù)滴單色熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),充分混勻后上機(jī)試驗(yàn),記錄前向角散射光和488nm激發(fā)下綠色熒光(FITC)、橙紅色熒光(PE)通道的信號(hào),收集10000個(gè)以上門內(nèi)有效信號(hào)。測(cè)試完成后,利用直方圖分析試驗(yàn)結(jié)果,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度值(FL0);連續(xù)開機(jī)2h后,在相同流式細(xì)胞儀設(shè)置和熒光通道電壓值的條件下重復(fù)前述試驗(yàn)步驟,得到標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度值(FL1),按式(6)計(jì)算FL0,FL1的相對(duì)漂移率(D)來表示穩(wěn)定性。D×100%(6)式中:D—相對(duì)漂移率;FL0—初始時(shí)各通道信號(hào)峰的平均強(qiáng)度;JJF1665—20175FL1—2h后各通道信號(hào)峰的平均強(qiáng)度。7.5重復(fù)性將淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(取100μL淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按比例添加抗原決定簇CD4抗體,輕柔渦旋充分混勻,避光存放半小時(shí),使CD4抗體與細(xì)胞充分結(jié)合)標(biāo)記好CD4抗體后上機(jī)測(cè)試,收集10000個(gè)以上門內(nèi)有效信號(hào)。重復(fù)測(cè)量6次,依次記錄每次測(cè)量的CD4陽(yáng)性細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比,按式(7)計(jì)算CD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占總淋巴細(xì)胞的百分比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),作為重復(fù)性的評(píng)價(jià)。 RSD=i-1r)2××100%(7)式中:RSD—相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,%;ri—CD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量單次測(cè)量結(jié)果; r—CD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量n次測(cè)量平均值;n—測(cè)量次數(shù)。7.6示值誤差按照7.5測(cè)量重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中得到的CD4陽(yáng)性細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比,計(jì)算平均值。按式(8)計(jì)算示值誤差。參考附錄C評(píng)估示值誤差校準(zhǔn)不確定度。式中:Δr=r-rs(8)Δr—CD4陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的示值誤差,%;r—CD4陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的測(cè)量平均值;rs—淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CD4陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的標(biāo)準(zhǔn)值。8校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)經(jīng)校準(zhǔn)后的流式細(xì)胞儀應(yīng)填發(fā)校準(zhǔn)證書,校準(zhǔn)證書應(yīng)符合JJF1071—2010中5.12的要求。校準(zhǔn)證書至少包括以下信息:a)標(biāo)題,如“校準(zhǔn)證書”或“b)實(shí)驗(yàn)室名稱和地址;c)進(jìn)行校準(zhǔn)的地點(diǎn)(如果不在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行校準(zhǔn));d)證書或報(bào)告的唯一性標(biāo)識(shí)(如編號(hào)),每頁(yè)及總頁(yè)數(shù)的標(biāo)識(shí);e)送校單位的名稱和地址;f)被校對(duì)象的描述和明確標(biāo)識(shí);g)進(jìn)行校準(zhǔn)的日期,如果與被校結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí),應(yīng)說明被校對(duì)象的接受日期;h)如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí),應(yīng)對(duì)抽樣程序進(jìn)行說明;i)對(duì)校準(zhǔn)所依據(jù)的技術(shù)規(guī)范的標(biāo)識(shí),包括名稱及代號(hào);JJF1665—20176j)本次校準(zhǔn)所用測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的溯源性及有效性說明;k)校準(zhǔn)環(huán)境的描述;l)校準(zhǔn)結(jié)果及測(cè)量不確定度的說明;m)校準(zhǔn)證書或校準(zhǔn)報(bào)告簽發(fā)人的簽名、職務(wù)或等效標(biāo)識(shí)以及簽發(fā)日期;n)校準(zhǔn)結(jié)果僅對(duì)被校對(duì)象有效地聲明;o)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室書面批準(zhǔn),不得部分復(fù)制證書或報(bào)告的聲明。9復(fù)校時(shí)間間隔流式細(xì)胞儀復(fù)校間隔建議一般不超過1年。由于復(fù)校時(shí)間間隔的長(zhǎng)短是由儀器的使用情況、使用者、儀器本身質(zhì)量等諸因素所決定的,因此,送校單位可根據(jù)實(shí)際使用情況自主決定復(fù)校時(shí)間間隔。如果對(duì)儀器的檢測(cè)數(shù)據(jù)有懷疑或儀器更換主要部件及修理后應(yīng)對(duì)儀器重新校準(zhǔn)。JJF1665—20177附錄A校準(zhǔn)原始記錄參考格式儀器名稱型號(hào)制造廠商出廠編號(hào)委托單位名稱聯(lián)系人地址電話實(shí)驗(yàn)室溫度實(shí)驗(yàn)室濕度校準(zhǔn)日期證書編號(hào)記錄編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)校準(zhǔn)人核驗(yàn)人A.1分辨力(RSD)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)FSCFITC單一熒光強(qiáng)度微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)A.2線性相關(guān)系數(shù)(r)與檢出限(LOD)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)FITC熒光強(qiáng)度值FITC等量熒光分子MESF相關(guān)系數(shù)r%檢出限LODMESF多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)PE熒光強(qiáng)度值PE等量熒光分子MESF相關(guān)系數(shù)r%檢出限LODMESF多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)8A.3重復(fù)性(RSD)與示值誤差(Δr)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總淋巴細(xì)胞數(shù)的百分比平均值重復(fù)性RSD%示值誤差Δr%淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)A.4漂移(D)檢測(cè)項(xiàng)目FSCFITC起始信號(hào)強(qiáng)度2h后信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)漂移率D%9附錄B校準(zhǔn)證書內(nèi)頁(yè)推薦格式序號(hào)校準(zhǔn)項(xiàng)目校準(zhǔn)結(jié)果1分辨力測(cè)量值:2線性相關(guān)系數(shù)測(cè)量值:3檢出限測(cè)量值:4漂移測(cè)量值:5重復(fù)性測(cè)量值:6示值誤差測(cè)量值:不確定度:(k=2)JJF1665—201710附錄C示值誤差校準(zhǔn)不確定度評(píng)定示例C.1測(cè)量方法細(xì)胞表面標(biāo)志物測(cè)量的示值誤差是用淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過抗體染料標(biāo)記后直接測(cè)量而得,測(cè)量得到的CD4陽(yáng)性細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比,多次測(cè)量取平均值,再減去標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值得到示值誤差。C.2測(cè)量模型細(xì)胞表面標(biāo)志物測(cè)量的示值誤差Δr:式中:Δr=r-rs(C.1)Δr—CD4陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的示值誤差,%;r—CD4陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的測(cè)量平均值;rs—淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CD4陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的標(biāo)準(zhǔn)值。C.3不確定度來源和標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定根據(jù)校準(zhǔn)方法,相對(duì)示值誤差的不確定度來源分別為示值重復(fù)性引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。C.3.1重復(fù)性引入的不確定度 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)連續(xù)測(cè)量6次的測(cè)量值為:51.2%,53.1%,49.4%,48.1%,52.9%,