基因治療完整

第十一章基因治療GeneTherapy精品課件本章，我們討論4個(gè)問題。

1.概述

2.基因治療的原理

3.基因治療中外源基因?qū)爰夹g(shù)

4.基因治療的應(yīng)用研究

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第一節(jié)概述精品課件

人類疾病的發(fā)生，往往涉及到內(nèi)源基因的突變（如遺傳?。┖屯庠椿虻娜肭郑ㄈ绺腥拘约膊。?。機(jī)體對(duì)外來侵襲抵御體現(xiàn)在以下4個(gè)層次：

1.整體水平，諸如動(dòng)物的打斗撕咬；

2.細(xì)胞水平，如Mφ對(duì)“異已”吞噬作用；

3.分子水平，如抗原抗體反應(yīng)，人可以產(chǎn)生106抗體分子，對(duì)付外來侵襲；

4.基因水平，對(duì)付外源基因入侵，在原核生物中有一種限制性核酸內(nèi)切酶可將外源基因水解掉。精品課件

對(duì)于內(nèi)源基因突變:至今未找到令人滿意的治療方法?；蛑委焹H僅處于初始階段。

全世界接受基因治療者106人，受試者600人精品課件定義：

廣義地說，基因治療是應(yīng)用基因或基因產(chǎn)物，治療疾病的一種方法。從狹義地說，基因治療是把外界的正?；蚧蛑委熁?，通過載體轉(zhuǎn)移到人體的靶細(xì)胞，進(jìn)行基因修飾和表達(dá)，改善疾病的一種治療手段。

一、基因治療的概念基因治療是治療基因突變性疾病的一項(xiàng)根本性措施，同時(shí)它為非基因突變性疾病提供了一個(gè)新的治療手段。精品課件二、基因治療的策略兩個(gè)基本策略:原位矯正病變基因基因取代或基因干預(yù)精品課件

象外科移植手術(shù)，切除病變部分，換上正常健康基因，這在目前還難以做到(一)原位矯正病變基因(糾正異常堿基)圖11-1鐮形紅細(xì)胞貧血病人的Hb為HbS(由β珠蛋白基因點(diǎn)突變引起)精品課件(二)基因取代或基因干預(yù)基因置換(genereplacement)通過體內(nèi)基因同源重組,原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因基因增補(bǔ)(geneaugmentation)不除去異常基因，向靶細(xì)胞導(dǎo)入外源基因通過非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物，從而彌補(bǔ)缺陷基因的功能基因干預(yù)(geneinterference)在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)。包括反義RNA、核酶、三鏈DNA及干擾RNA技術(shù)精品課件

三、基因治療中的靶細(xì)胞

生殖細(xì)胞:

優(yōu)點(diǎn)——治本困難——①生殖(學(xué))生物學(xué)問題，極其復(fù)雜且不清楚。

②倫理學(xué)問題名人精子庫”，“美女卵子庫”，總是別人的“種”，不好辦，即使這個(gè)問題解決，恐怕未必然，愛因斯坦生了個(gè)弱智女，馬克思后代在開出租車（不是說開出租車不好，特此聲明）精品課件體細(xì)胞——目前常用體細(xì)胞有：①淋巴細(xì)胞②骨髓細(xì)胞③內(nèi)皮細(xì)胞④皮膚纖維細(xì)胞⑤肝細(xì)胞⑥肌細(xì)胞⑦角化細(xì)胞(keratinoyte)⑧多種腫瘤細(xì)胞附:選擇靶細(xì)胞依據(jù)①疾病累及的主要部位。②靶細(xì)胞來源的難易程度。③體外培養(yǎng)的成活率和存活時(shí)間。④接受正?；虻哪芰Α＂菪碌恼；蚰芊裨诎屑?xì)胞能否正常表達(dá)和持續(xù)時(shí)間。精品課件

四、基因治療的途徑

1.間接體內(nèi)療法（exvivo）體外將治療基因→靶細(xì)胞內(nèi),再將經(jīng)基因修飾靶細(xì)胞→病人,使這種外源基因(細(xì)胞)在體內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到基因治療目的.(目前多采用這種療法)。2.體內(nèi)法(invivo)外源基因→直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)組織器官→進(jìn)入相應(yīng)組織器官進(jìn)行表達(dá)→從而達(dá)到基因治療目的。精品課件

基因治療的基本原理第二節(jié)精品課件基因治療的基本程序(基本原理或基本步驟)：治療性基因的選擇基因載體的選擇

病毒載體非病毒載體靶細(xì)胞的選擇

體細(xì)胞生殖細(xì)胞載體與治療基因重組及篩選鑒定將重組DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞,檢測(cè)目的基因和標(biāo)記基因的表達(dá)產(chǎn)物精品課件基因治療的基本程序(基本原理或基本步驟)：基因轉(zhuǎn)移

間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的篩選與鑒定回輸體內(nèi)利用標(biāo)記基因和目的基因的表達(dá)產(chǎn)物利用核酸分子雜交考核療效和安全性精品課件

基因工程基因治療1.目的基因應(yīng)用或研究基因標(biāo)志基因+治療基因2.載體(原核或真核)(真核)3.靶細(xì)胞原、真核真核4.DNA體外重組√√5.重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞√√6.后處理√√基因治療與基因工程的比較精品課件

第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)精品課件

生物學(xué)方法非生物學(xué)方法①逆轉(zhuǎn)錄病毒載體①磷酸鈣共沉淀法②腺病毒載體②質(zhì)粒DNA/脂質(zhì)體法③腺相關(guān)病毒載體③電擊法④單純皰疹病毒載體④受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法⑤注射法以逆轉(zhuǎn)錄病毒法最為常用，以磷酸鈣法最為便宜（經(jīng)濟(jì)），以注射法最為簡(jiǎn)捷，最值得研究和推廣應(yīng)用（笑話，也最危險(xiǎn)。）轉(zhuǎn)移基因方法精品課件精品課件

一.病毒載體——轉(zhuǎn)基因的生物學(xué)方法（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活（命）周期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)(三)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)

(四)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)（五）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備（六）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（七）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的安全性問題精品課件

1.吸附——病毒衣殼糖蛋白與細(xì)胞膜受體特異性結(jié)合，吸附在膜受體上。

2.入胞——病毒核酸進(jìn)入host細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄，整合到hostDNA中去，轉(zhuǎn)錄、復(fù)制

3.病毒顆粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白裝配成成熟病毒顆粒

4.病毒顆粒的釋放——釋放的子病毒又可感染其它細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞可以釋放105子病毒。（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活（命）周期精品課件

圖11-2Rous肉瘤病毒毒粒結(jié)構(gòu)示意圖精品課件1.一般特征(1)正鏈RNA病毒即與mRNA極性相同（5‘→3’），反之為(一)；(2)5‘有m7Gppp帽，3‘有poly（A）尾；(3)病毒進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)本身逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA分子→細(xì)胞核并整合到宿主染色體,這種整合病毒DNA稱為前病毒(provirus)(不管是源于RNA還是DNA)(并非所有逆轉(zhuǎn)錄病毒都致癌)。（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)精品課件

圖11-3逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的基本結(jié)構(gòu)2．基因組結(jié)構(gòu)精品課件

(三)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)保留病毒的LTR,ψ,去除病毒的結(jié)構(gòu)基因,加上一個(gè)抗性標(biāo)記基因LTRLTRψNeoAmproriE精品課件

(四)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)保留病毒的LTR,ψ,用目的基因和抗性標(biāo)記基因置換了病毒的結(jié)構(gòu)基因LTRLTRψNeoAmproriETargetgene精品課件

常用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖

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（五）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備是將缺失了包裝信號(hào)及相關(guān)序列的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（輔助病毒）導(dǎo)入哺乳細(xì)胞內(nèi)而制備成的一種特殊的細(xì)胞系，這種細(xì)胞因攜帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組而大量產(chǎn)生病毒包裝蛋白，而輔助病毒自身缺乏包裝信號(hào)（ψ序列）而不能包裝,不產(chǎn)生病毒顆粒。1．包裝細(xì)胞(1)包裝細(xì)胞定義精品課件

①為了獲得感染能力,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不含病毒的結(jié)構(gòu)基因,不能產(chǎn)生gag、pol、env

②野生型MO-MLV可供這些蛋白質(zhì)，為什么不用野生型MO-MLV？包裝后會(huì)產(chǎn)生大量有復(fù)制能力的野生型病毒顆粒，進(jìn)入體內(nèi)可能大量復(fù)制，具有插入突變危險(xiǎn)，特別是插入激活癌基因，滅活抑癌基因危險(xiǎn)，不利于治療用。

所以要設(shè)計(jì)一種細(xì)胞——重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能在其中包裝成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒（確切的說，只有一次感染能力），但能從中釋放出來到靶細(xì)胞，這就是包裝細(xì)胞，不產(chǎn)生復(fù)制能力的野生型包裝結(jié)構(gòu)。(2)為什么要包裝細(xì)胞？精品課件

(3)三代包裝細(xì)胞第一代包裝細(xì)胞ψ2細(xì)胞系:這種細(xì)胞的基因組中整合有僅僅缺失包裝信號(hào)的MLV前病毒基因組。只要與載體（含）之間有一次重組，就可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒。第2代包裝細(xì)胞

PA317細(xì)胞系:含逆轉(zhuǎn)錄病毒PAM3基因組，缺失Ψ信號(hào)及部分5

LTR，3

LTR被SV40的多聚A化信號(hào)取代,與載體至少要經(jīng)過2次獨(dú)立的重組才能形成有復(fù)制能力的野生型病毒第3代包裝細(xì)胞

ΨCRIP:含2種逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組,每種不僅缺失Ψ信號(hào),且僅含病毒的部分結(jié)構(gòu)基因,經(jīng)過多次獨(dú)立重組，才能產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒精品課件2．重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備

Ψ-

LTRLTRψNeoLTRLTRψNeoTargetgeneLTRLTRgag

pol

env形成假病毒,出芽釋放到細(xì)胞外逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞,整合后轉(zhuǎn)錄成RNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA被病毒蛋白包裝包裝細(xì)胞已整合有缺失ψ的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因,可產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白精品課件

（六）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)1．逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的靶組織細(xì)胞

靶細(xì)胞的最基本要求:

細(xì)胞表面具有逆轉(zhuǎn)錄病毒相應(yīng)的受體

最常用作基因治療的靶有：

骨髓干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞，還包括所有的腫瘤細(xì)胞精品課件

2．基因轉(zhuǎn)移的方法與途徑exvivo分離培養(yǎng)宿主細(xì)胞,離體轉(zhuǎn)移基因,效率高，但大多人體組織細(xì)胞原代培養(yǎng)比較困難。

invivo重組逆轉(zhuǎn)病毒載體直接注射的途徑主要有：①采用靜脈注射途徑②直接將產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞注射到組織或腫瘤中③直接將表達(dá)載體，精品課件

3．重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向基因轉(zhuǎn)移

①重組逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒整合位點(diǎn)的靶向性

大多數(shù)前病毒的整合作用是隨機(jī)的，對(duì)DNaseI超敏區(qū)域和轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域的整合是具有優(yōu)先整合的傾向性。在腫瘤中前病毒優(yōu)先與細(xì)胞原癌基因和染色體脆性位點(diǎn)整合。②通過基因轉(zhuǎn)移的方法與途徑限制受感染細(xì)胞exvivo:被感染的靶細(xì)胞被預(yù)先選擇，細(xì)胞靶向性能夠很好地實(shí)現(xiàn)invivo:將重組病毒注射到特定的組織器官或其腔體內(nèi)，以達(dá)到較好的組織細(xì)胞選擇性基因轉(zhuǎn)移的目的，如進(jìn)行腫瘤實(shí)體內(nèi)注射，使重組病毒主要感染腫瘤細(xì)胞。精品課件

③病毒感染水平的限制利用逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)人類細(xì)胞的某些亞群具有限制性的親嗜性。如HIV和HTLV-1④基因轉(zhuǎn)錄水平的限制

在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中導(dǎo)入具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的序列利用α-甲胎蛋白基因的肝組織特定性調(diào)節(jié)成分與TK基因相連精品課件5‘LTRψNeoAmproriE3‘LTR插入外源cDNA5‘LTRψNeoAmproriE3‘LTRcDNAψSLTRSLTR轉(zhuǎn)錄gpemRNAψmRNA病毒蛋白質(zhì)包裝完成假病毒顆包裝，分泌到包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。逆轉(zhuǎn)錄感染靶細(xì)胞前病毒前病毒插入外源基因轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)G418篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的基本過程轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出RNA精品課件

（七）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的安全性問題1．產(chǎn)生野生型病毒

存在有復(fù)制能力的野生型病毒，主要來源于載體ψ和不含ψ序列的輔助病毒重組成野生型病毒2．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入的破壞性

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的基因在受體細(xì)胞染色體上的基因組合是隨機(jī)的。與臨近基因相互作用,可能激活癌基因，滅活抑癌基因或破壞細(xì)胞生長(zhǎng)的必需基因。3．污染問題

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由于病毒的感染性和寄生特性，使現(xiàn)在約85%基因治療臨床項(xiàng)目采用病毒載體。但是病毒載體存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小，靶向特異性差，制備復(fù)雜及費(fèi)用較高等不足。所以人們愈來愈重視非病毒法的研究。 非病毒載體的本質(zhì)是將基因治療中基因看作為藥物，然后從藥劑和藥理學(xué)的角度如何把基因?qū)氚屑?xì)胞或組織、器官并進(jìn)行表達(dá)。基因作為藥物發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵問題是導(dǎo)入的靶向性，表達(dá)的有效性和可調(diào)控性。二.非病毒載體轉(zhuǎn)基因的非生物學(xué)方法精品課件非病毒載體優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)1.不需包裝細(xì)胞，制備易、省時(shí)、滴度也不受限制，并且可對(duì)質(zhì)粒或其他形式核酸進(jìn)行快速分析；2.對(duì)基因大小或核酸類型不限；3.免疫原性低，急性毒性小，對(duì)受試者比較安全；4.可具有特異靶向性，并能轉(zhuǎn)移至非分裂期細(xì)胞并有效表達(dá)；5.制備方便且重復(fù)性好，具有完全人工合成和大規(guī)模生產(chǎn)可行性，因此較簡(jiǎn)單和廉價(jià)。1.轉(zhuǎn)移效率較病毒載體低。2.基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間短；3.許多問題仍需求助病毒或病毒成分解決。精品課件1.方法用一定比例的磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸→共溶于氯仿→制備成雙層磷脂的封閉囊泡→超聲波處理→將待轉(zhuǎn)移外源基因DNA包入→制備成脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA復(fù)合物→利用其能與細(xì)胞膜融合的特性，可將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。2.優(yōu)點(diǎn)脂質(zhì)體作為載體可以攜帶各種DNA片段，且在轉(zhuǎn)移途中保護(hù)基因不被核酸酶降解。3.缺點(diǎn)轉(zhuǎn)移效率低、制備麻煩、商品較貴。

（一）脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移方法精品課件

1．陽離子脂質(zhì)體

由帶正電荷的脂類如四胺基去污劑、膽固醇陽離子衍生物、二?；视秃投喟返闹愌苌锖椭行暂o助脂類如二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）或二油?；字Ｄ憠A（DOPC）等摩爾混合組成。通過電荷的相互作用，陽性電荷的脂質(zhì)體和帶陰電荷的DNA之間可以有效地形成復(fù)合物。由于具有多余的正電荷，復(fù)合體可以與細(xì)胞膜帶負(fù)電荷的唾液酸結(jié)合，然后通過內(nèi)吞作用攝取載體復(fù)合體。精品課件

2．陰離子（anionic）脂質(zhì)體

含有磷脂酰絲氨酸或含50%二棕櫚磷脂酰甘油,由于磷脂和寡聚核苷酸均帶負(fù)電荷，必須在脂質(zhì)體中加入鈣離子方可提高包裝效率。由陰離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)的寡聚核苷酸首先定位細(xì)胞核，也延長(zhǎng)了寡聚核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的保留時(shí)間。陰離子脂類可以置換陽離子脂質(zhì)/DNA復(fù)合體的DNA

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3．pH敏感型脂質(zhì)體

可由二油酰膽堿（DOPE）、膽固醇和油酸以4：4：2（摩爾比）組成DOPE決定了脂質(zhì)體在中性pH條件下的穩(wěn)定性和酸性條件下與細(xì)胞融合的能力酸性條件下可導(dǎo)致其脂肪酸羧基的質(zhì)子化而引起六角晶相的形成導(dǎo)致膜融合的發(fā)生精品課件

（二）受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

1.方法利用細(xì)胞表面各種特定受體的配基為“導(dǎo)彈頭”與多價(jià)陽離子聚合物（或能與其它能強(qiáng)烈吸附DNA物質(zhì)相連接），構(gòu)成導(dǎo)向性運(yùn)輸載體，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用，將目的基因靶向性地移至某種特定細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的方法。2.特點(diǎn)：受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用具有：1）細(xì)胞組織器官特異性；2）轉(zhuǎn)移效率高。3.舉例：此法研究較多的是唾液酸糖蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白。如：利用唾液酸糖蛋白（配體）攜帶表達(dá)載體已成功地將目的基因轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞內(nèi)，獲得目的基因表達(dá)。精品課件

（三）注射法1．直接注射

將裸露DNA直接注入肌肉內(nèi)，外源基因在肌肉中的表達(dá)量與注入的外源性基因含量成正比，與溶液體積無關(guān)。2．顯微注射法采用特別的顯微注射器在顯微鏡下把重組DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞顯微注射法:在顯微鏡下將注射器針頭穿過細(xì)胞膜后刺入細(xì)胞核，將重組DNA直接注入受體細(xì)胞核中穿刺法:在顯微鏡下用顯微注射針穿刺細(xì)胞膜及核膜，將重組DNA加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，使細(xì)胞周圍的重組DNA有機(jī)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞中精品課件

（四）電泳沖介導(dǎo)法（電穿孔法）是對(duì)受體細(xì)胞加入高壓電脈沖，使細(xì)胞上形成許多瞬間小孔，從而使不同細(xì)胞之間的原生質(zhì)發(fā)生融合，或使外源DNA通過細(xì)胞膜上出現(xiàn)瞬間小孔而進(jìn)入細(xì)胞。（五）超聲介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法（六）微粒轟擊法(七)磷酸鈣共沉淀法精品課件

三、非病毒載體的優(yōu)化策略

（一）靶向性問題

利用細(xì)胞表面特異性表達(dá)的受體或蛋白來解決靶向性（targeting）問題

例如:唾液酸糖蛋白（asialo-glycoprotein，ASGP）能與肝細(xì)胞上去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合并介導(dǎo)內(nèi)吞的特點(diǎn)，將ASGP與攜帶DNA的多聚陽離子多肽共價(jià)結(jié)合，證明DNA主要進(jìn)入肝細(xì)胞并能高效表達(dá)靶向性配體主要有單克隆抗體、病毒胞膜蛋白、生長(zhǎng)因子或激素等配體和DNA連接的物質(zhì)主要有多聚賴氨酸、精蛋白和陽離子脂質(zhì)體，DNA嵌合劑、DNA抗體等精品課件

（二）內(nèi)吞小泡釋放（endosomereleasing）問題促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡釋放策略：①利用抑制溶酶體的藥物、融合型脂類、pH敏感脂質(zhì)體或有側(cè)鏈的多聚陽離子和星狀樹突體等來破壞內(nèi)吞小泡膜以釋放其中的DNA；②通過耦聯(lián)技術(shù)，利用病毒或病毒蛋白、細(xì)菌蛋白、短肽等。精品課件

（三）轉(zhuǎn)運(yùn)入核問題

SV40的大T抗原的PKKKRKV序列、VP1、肽核酸和聚乙烯亞胺（PEI）可以促進(jìn)DNA的核轉(zhuǎn)運(yùn)。（四）基因及其表達(dá)調(diào)控問題通過優(yōu)化啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止序列及密碼子的使用來提高載體質(zhì)粒上靶基因的表達(dá)和安全性。入核問題也可屬于此范疇。精品課件

第四節(jié)反義RNA、核酶和三鏈DNA在基因治療中的應(yīng)用精品課件

核酸包括DNA和RNA，都是遺傳物質(zhì)，所以反義核酸可稱作反義基因，即能通過互補(bǔ)堿基與DNA或mRNA互補(bǔ)的核酸分子。反義RNA技術(shù)、核酶技術(shù)、三鏈DNA技術(shù)，廣義地說，這3者可以統(tǒng)稱為反義核酸技術(shù)，3者之間有一定聯(lián)系，也有一定的區(qū)別。一.反義核酸的概念精品課件1.反義RNA（antisenseRNA）:與mRNA互補(bǔ)的RNA。結(jié)合時(shí)，可阻止mRNA翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。2.核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA稱為核酶。其與相應(yīng)mRNA結(jié)合后能發(fā)揮酶活性，將mRNA降解。3.三鏈DNA(反義基因)：是人工合成的寡核苷酸（oligodexynucleotide,olgoDT），其進(jìn)入機(jī)體，以胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞，可直接結(jié)合到DNA雙鏈的特定部位，形成三聚體，影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄過程不能啟動(dòng)。二.反義核酸用于基因治療的基本原理精品課件1）抗腫瘤：就是應(yīng)用反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些異常基因的表達(dá)，以期阻斷瘤細(xì)胞內(nèi)異常信號(hào)的傳導(dǎo)，使瘤細(xì)胞進(jìn)入正常分化軌道或引起細(xì)胞凋亡。2）抗病毒：用反義DNA或反義RNA阻斷DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而達(dá)到抗病毒目的。反義核酸在基因治療中的應(yīng)用精品課件反義RNA的應(yīng)用方法有兩種1）體外合成反義RNA直接作用細(xì)胞，細(xì)胞吸收后發(fā)揮作用；2）構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA發(fā)揮作用。

三.反義核酸技術(shù)（一）反義RNA技術(shù)意義:抑制一些有害基因的表達(dá)或失控基因的過度表達(dá)

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解決的首要問題:1．專一性轉(zhuǎn)移問題進(jìn)行基因治療時(shí)，反義RNA必須專一性轉(zhuǎn)移到病變細(xì)胞中2．反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題

反義RNA抗RNase的能力不強(qiáng)受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù)是解決上述兩個(gè)問題的一條十分有希望的途徑。精品課件

受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù)針對(duì)上述2個(gè)問題人們?cè)O(shè)計(jì)一種反義RNA運(yùn)載工具，如：①ASGP-PL（脫唾液酸血清類粘蛋白一多聚賴氨酸)，能將反義RNA運(yùn)至肝細(xì)胞發(fā)揮作用；②利用受體介導(dǎo)反義RNA在抑制c-myc和乙肝病毒基因的表達(dá)方面有所研究，基本上克服了上述弱點(diǎn)。精品課件1）安全性高：反義RNA只針對(duì)特異的mRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)，并且最終在細(xì)胞內(nèi)降解，不留“殘?jiān)薄?）設(shè)計(jì)制備方便：設(shè)計(jì)復(fù)蓋5‘端的反義RNA可以封帽反應(yīng)（mRNA不能進(jìn)入核糖體），即可抑制特定基因表達(dá)和功能。制備也較簡(jiǎn)單：①體外轉(zhuǎn)錄得到，②利用表達(dá)載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)；4）能直接作用某些RNA病毒；5）發(fā)展：設(shè)計(jì)“抗降解”RNA，可以延長(zhǎng)反義RNA壽命；設(shè)計(jì)“反義RNA+核酶”復(fù)合功能體、既有“封閉”又有“切割”作用。3.應(yīng)用前景：精品課件1.核酶設(shè)計(jì)應(yīng)考慮的因素核酶由“兩端引導(dǎo)序列+中間保守序列”組成，①引導(dǎo)序列取決于靶序列的堿基組成,②中間保守序列：是酶活性的結(jié)構(gòu)域,酶活性中心包括結(jié)合部位和催化中心，

（二）核酶（ribozyme）技術(shù)核酶兩端的引導(dǎo)序列與靶RNA分子的序列互補(bǔ)，起著識(shí)別和結(jié)合底物的作用。

設(shè)計(jì)的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域

精品課件人工設(shè)計(jì)的核酶粗線表示合成的核酸分子細(xì)線表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭頭表示切斷點(diǎn)精品課件

①化學(xué)合成：提供序列順序，由廠家合成、很方便。②體外轉(zhuǎn)錄:a據(jù)靶序列先合成DNA雙鏈；b將dsDNA克隆到表達(dá)載體上；c利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄獲得核酶。2.核酶制備：精品課件外源導(dǎo)入：借助脂質(zhì)體包裹導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)源導(dǎo)入：借助逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。導(dǎo)入細(xì)胞的同時(shí)，分別導(dǎo)入報(bào)告基因與反義表達(dá)載體（帶報(bào)告基因）作對(duì)照，用以檢測(cè)載體的表達(dá)能力，以區(qū)別抑制作用是核酶還是反義RNA。3.核酶導(dǎo)入細(xì)胞的兩種方法精品課件1.意義:（三）反義基因(三鏈DNA)技術(shù)通過形成三鏈DNA,完全抑制特定基因的表達(dá)。三鏈DNA被稱為“能夠攻擊病毒和癌細(xì)胞而不損害健康組織”的新型基因藥物。2.作用機(jī)制:合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脫氧寡核苷酸（ODN）在一定條件下也可以與雙螺旋DNA分子中的同聚嘌呤·同聚嘧啶區(qū)段結(jié)合形成局部的分子間三鏈DNA,可干擾核蛋白因子或聚合酶與DNA的這一位點(diǎn)結(jié)合，因此三鏈DNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表達(dá)。精品課件

3、技術(shù)關(guān)鍵:①專一性：針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)高度選擇性的反義基因；②穩(wěn)定性：通過化學(xué)修飾，使反義基因能抵抗體內(nèi)核酸酶的進(jìn)攻，延長(zhǎng)反義基因的壽命。③攝取及分布:直接通過擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)還通過細(xì)胞內(nèi)吞作用入胞。ODN的攝取過程是一個(gè)依賴于堿基序列長(zhǎng)度、活性及飽和的內(nèi)循環(huán)過程。精品課件

第五節(jié)基因治療的應(yīng)用研究

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除外傷性疾病外，所有疾病都是遺傳因素（內(nèi)因）與環(huán)境因素（外因）相互作用結(jié)果。①遺傳因素起主要作用疾病如：血友病、白化病、苯酮尿癥等；②環(huán)境因素起主要作用疾病如：傳染病、營(yíng)養(yǎng)性疾病等；③二者都起重要作用疾病如：糖尿病、高血壓、冠心病、腫瘤、精神分裂癥等。目前發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)位虿?000多種，多基因病不少于1000種，染色體病100多種，隨著傳染病與營(yíng)養(yǎng)性疾病的有效控制和科技經(jīng)濟(jì)文化的進(jìn)一步發(fā)展，遺傳病患病率有相對(duì)上升趨勢(shì)。精品課件（一）3個(gè)考慮因素和3個(gè)困難：1.3個(gè)考慮因素：1）對(duì)該病有關(guān)基因應(yīng)詳盡了解，能在實(shí)驗(yàn)中克隆該基因，并能導(dǎo)入真核細(xì)胞中表達(dá)；

2）只需產(chǎn)生較少量原來缺陷基因表達(dá)產(chǎn)物就能矯正疾??；3）即使導(dǎo)入基因過渡表達(dá)，對(duì)機(jī)體也無不良反應(yīng)。一.遺傳病的基因治療精品課件2.3個(gè)困難：1）導(dǎo)入外源基因調(diào)控問題導(dǎo)入外源基因（治療基因）接受體內(nèi)調(diào)控系統(tǒng)的統(tǒng)一調(diào)控，這在目前難以做到，有待進(jìn)一步研究。2）有些遺傳病是某些特殊細(xì)胞損傷造成的，這些細(xì)胞不易取出供體外基因工程操作用3）單基因遺傳病，缺陷只局限于某一個(gè)發(fā)病的基因，但其造成臨床結(jié)果往往廣泛累及多個(gè)臟器目前只有幾種體細(xì)胞適用體外基因治療精品課件1.腺苷脫氨酶（adenosinedeaminse,ADA）催化反應(yīng)腺嘌呤脫氧核苷次黃嘌呤苷→次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸(醇式)(人和猿的終產(chǎn)物)2.ADA缺陷生化代謝障礙及其臨床癥狀A(yù)DA缺陷↓→腺嘌呤核苷酸代謝受阻→dATP↑→T淋巴細(xì)胞DNA鏈不斷崩解，同時(shí)激活DNA依賴的ADP-核糖聚合酶的活性,降低NAD水平，使蛋白質(zhì)合成減少細(xì)胞死亡，同時(shí)也影響B(tài)細(xì)胞功能。ADA缺陷常伴有重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）癥狀。ADA（二）腺苷脫氨酶（ADA）缺陷遺傳病的基因治療精品課件

1）單個(gè)核細(xì)胞的分離：使用淋巴細(xì)胞分層液分離患兒血中單個(gè)核細(xì)胞；2）單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)：以“OKT3抗體+IL2”刺激體外培養(yǎng)T細(xì)胞增殖，分化；3）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞；4）將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給患兒體內(nèi)。

3.ADA基因治療方案：ADA缺陷的基因治療始于1990年9月14日，治療對(duì)象是1個(gè)4歲的美國(guó)女孩，方案是：精品課件ADA缺陷基因治療獲得了成功，但每間隔3～5個(gè)月，同樣的基因治療操作程序必須同樣重新進(jìn)行。治療麻煩給病人也增加了痛苦，這是因?yàn)榱馨图?xì)胞壽命只有幾個(gè)月時(shí)間。研究者正在考慮是否使用壽命較長(zhǎng)的靶細(xì)胞，當(dāng)然以骨髓干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)和回輸為好，人們?cè)诓粩嗯Α?.問題精品課件二.腫瘤的基因治療精品課件1.抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞1）恢復(fù)抑癌基因功能轉(zhuǎn)染正常抑癌基因于腫瘤細(xì)胞，使之表達(dá)正常抑癌基因產(chǎn)物，在一定程度上抑制腫瘤的惡性表型，如轉(zhuǎn)染P53和RB。2）抑制癌基因的表達(dá)①使用抑癌基因關(guān)閉癌基因表達(dá)或使其表達(dá)產(chǎn)物失活；②使用反義核酸抑制癌基因的轉(zhuǎn)錄

（一）腫瘤基因治療策略精品課件依據(jù):HSV-tk基因編碼的胸腺嘧啶激酶可將開環(huán)鳥苷的衍生物GCV（Gancilevir）轉(zhuǎn)變成有毒性的代謝產(chǎn)物，后者能殺死正在分裂的（腫瘤）細(xì)胞。方案:用“HSV-tk基因”重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染tk基因。特點(diǎn):①插入的HSV-tk基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能整合至惡性腫瘤細(xì)胞染色體,對(duì)正常細(xì)胞不整合;②GCV只能殺死表達(dá)HSV-tk激酶的腦瘤細(xì)胞,不殺死正常細(xì)胞,因?yàn)椴溉閯?dòng)物內(nèi)源tk激酶對(duì)GCV不敏感；③腦組織對(duì)異體細(xì)胞排斥能力低，異體細(xì)胞在其中可以存活較長(zhǎng)時(shí)間，3）自殺療法精品課件2.腫瘤細(xì)胞的基因修飾外源基因的導(dǎo)入可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性1）導(dǎo)入細(xì)胞因子基因（如IL-2，IL-1等）

導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，引起抗瘤效應(yīng)。2）導(dǎo)入MHC基因和共刺激分子基因腫瘤細(xì)胞可通過MHC和共刺激分子表達(dá)減弱或缺失逃逸免疫攻擊，誘導(dǎo)表達(dá)或者直接轉(zhuǎn)染MHC基因和共刺激分子基因可能提高腫瘤的免疫原性精品課件1）細(xì)胞因子基因?qū)朊庖呒?xì)胞

Rosenberg教授以細(xì)胞因子（如TNF、IL2）基因轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL細(xì)胞治療晚期惡性黑色素瘤病人。依據(jù):1）TIL對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。2）TIL細(xì)胞在體外殺傷腫瘤細(xì)胞效率較LAK強(qiáng)50～100倍。3.調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能精品課件2）基因修飾的樹突狀細(xì)胞

用腫瘤抗原基因聯(lián)合腫瘤抗原肽修飾的樹突狀細(xì)胞效果更好。3）分泌免疫毒素的T淋巴細(xì)胞

將免疫毒素基因?qū)隩淋巴細(xì)胞，使其表達(dá)和分泌免疫毒素，殺傷腫瘤細(xì)胞，殺傷作用不受MHC限制。4）腫瘤DNA疫苗將腫瘤抗原基因克隆到真核表達(dá)載體，采用肌肉注射的方法導(dǎo)入體內(nèi)3.調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能精品課件

一些嚴(yán)重危害人類健康的病毒性感染，如病毒性肝炎，AIDS病，I型T淋巴細(xì)胞病毒感染引起的T淋巴瘤，可采用特異的反義RNA或反義DNA來封閉病毒結(jié)構(gòu)蛋白mRNA，以特異抑制或阻止病毒的表達(dá)。HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，和靶細(xì)胞膜上CD4分子（受體）結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后整合到宿主染色體。在HIV生命周期中，HIV基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)是可以調(diào)節(jié)的、利用反義RNA核酸技術(shù)用以破壞HIV表達(dá)的調(diào)控以達(dá)到基因治療的目的。三、感染性疾病的基因治療精品課件HIV的基因及其功能基因（以前的名稱）功能結(jié)構(gòu)基因gag核心蛋白（P17、P24、P9、P7）Pol酶（逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶）env外膜蛋白（gp120gp41）調(diào)節(jié)基因Tat（tat-3,ta）正調(diào)節(jié)Rev（art,trs）分化調(diào)節(jié)Nef（3‘orf,BE‘F）負(fù)調(diào)節(jié)Vif（sor,A,p’,Q）感染因子Vpr(R)不清楚Vpll不清楚精品課件調(diào)節(jié)基因中以tat（正調(diào)節(jié)），rev（分化調(diào)節(jié)），nef（負(fù)調(diào)節(jié)）最重