固定化酶課件

固定化酶及其應(yīng)用研究固定化酶目錄固定化酶簡(jiǎn)介1固定化酶的制備2固定化酶的應(yīng)用3展望4固定化酶固定化酶的意義游離狀態(tài)的酶對(duì)熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等穩(wěn)定性較差，易失活，并且反應(yīng)后混入催化產(chǎn)物等物質(zhì)，純化困難，不能重復(fù)使用。酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。其催化作用具有高選擇性、高催化活性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)保無(wú)污染等特點(diǎn)。天然酶的優(yōu)缺點(diǎn)固定化酶背景已固定了幾種芽孢桿菌和鏈霉菌中提取的葡萄糖異構(gòu)化酶，并大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。191619691970自1972發(fā)展歷程日本一家制藥公司第一次將固定化的酰化氨基酸水解酶用來(lái)從混合氨基酸中生產(chǎn)L-氨基酸，開辟了固定化酶工業(yè)化的新紀(jì)元。我國(guó)開始了固定化酶的研究工作，許多單位相繼進(jìn)行了固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用。Neleson和Griffin最先發(fā)現(xiàn)了酶的固定化現(xiàn)象?？茖W(xué)家就開始了固定化酶的研究工作。固定化酶物理吸附法、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合及包埋等方法通過(guò)化學(xué)或物理的處理方法，使原來(lái)水不溶的酶與固態(tài)的水不溶性支持物結(jié)合或被載體包埋。將酶固定在生物膜或超濾膜上，制造出來(lái)的生物膜反應(yīng)器固定化酶簡(jiǎn)介定義常用技術(shù)先進(jìn)方法固定化酶固定化酶的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)對(duì)熱、pH等的穩(wěn)定性提高，對(duì)抑制劑的敏感性降低能反復(fù)使用應(yīng)用制成酶電極的固定化酶建成監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)的系統(tǒng)適用于連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單過(guò)濾離心，產(chǎn)品與酶可分離開反應(yīng)空間大大縮小，從而能準(zhǔn)確控制反應(yīng),可以消除側(cè)反應(yīng)固定化酶固定化酶技術(shù)利用性能優(yōu)良的天然載體，或借助現(xiàn)代技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)載體進(jìn)行改性，合成新型載體材料。改善催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)；實(shí)現(xiàn)多酶共固或整個(gè)細(xì)胞的固定化通過(guò)輻射、光、等離子體、電子等方法制備吸附法、交聯(lián)法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法改性載體及新型載體固定化酶酶的定向固定化及多酶共固技術(shù)新型酶固定化方法傳統(tǒng)的酶固定化方法固定化酶?jìng)鹘y(tǒng)的酶固定化方法吸附法物理吸附和離子交換吸附。酶易從載體脫落并污染催化反應(yīng)產(chǎn)物。交聯(lián)法利用雙功能和多功能交聯(lián)試劑，在酶分子和交聯(lián)試劑之間形成共價(jià)鍵。作為其他固定化方法的輔助手段。包埋法載體與酶溶液混合后，借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，通過(guò)物理作用將酶限定在載體的網(wǎng)格中。共價(jià)結(jié)合法酶分子的非必須基團(tuán)與載體表面的活性功能基團(tuán)通過(guò)形成化學(xué)共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)不可逆結(jié)合。固定化酶新型酶固定化方法輻射Mohy等以137Cs為輻射源，通過(guò)γ-射線引發(fā)將甲基丙烯酸甲酯接枝共聚于尼龍膜襲面，經(jīng)進(jìn)一步活化，用于青霉素?；傅墓潭ü馀悸?lián)以光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團(tuán)的載體共價(jià)固定化酶，由于條件溫和，可獲得酶活力較高的固定化酶。等離子體高度激發(fā)的原子、分子、離子以及自由基的聚集體，大量的等離子體常在室溫下存在。載體材料表面可以由等離子體進(jìn)行有用修飾，從而引入活性基團(tuán)。原則：實(shí)現(xiàn)在較為溫和的條件下進(jìn)行酶的固定化，盡量減少或避免酶活力的損失。固定化酶酶的定向固定化及多酶共固技術(shù)定向固定化傳統(tǒng)的酶固定化方法的缺點(diǎn)是酶在任意位點(diǎn)與載體進(jìn)行連接，使酶活性位點(diǎn)不能充分暴露，而且酶的固定化量降低

，因此定向固定化酶技術(shù)將成為今后固定化酶研究的熱點(diǎn)。多酶共固為了充分發(fā)揮不同酶的各自優(yōu)勢(shì)，把不同來(lái)源的酶與整個(gè)細(xì)胞的生物催化性能相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多酶共固或整個(gè)細(xì)胞的固定化，也日益受到研究者的重視。固定化酶改性載體及新型載體固定化酶新型載體高分子復(fù)合物，因其優(yōu)良的傳質(zhì)性能、電解質(zhì)的靈敏介電特性以及良好的生物相容性等特點(diǎn)，也成為固定化酶良好的新型載體，在酶固定化領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景。改性載體固定化酶通過(guò)表面涂層或表面吸附等物理方法以及接枝、聚合等化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)載體表面物理性質(zhì)或化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。異同固定化酶例：以殼聚糖為載體固定化青霉素?；腹潭ɑ傅姆磻?yīng)原理：

醛的羰基和一級(jí)胺、二級(jí)胺能發(fā)生親核加成反應(yīng)生成西佛堿(Schiffbase)，因此利用甲醛和雙功能團(tuán)的醛類化合物如戊二醛等與殼聚糖及蛋白酶的氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，可用來(lái)固定化青霉素?；浮Ｆ滏I合機(jī)理如下：

固定化酶例：以殼聚糖為載體固定化青霉素?；该富畹臏y(cè)定原理青霉素G鈉鹽在青霉素酰化酶的作用下，水解成6一氨基青霉烷酸(6一APA)和苯乙酸，用NaOH溶液中和生成的苯乙酸，使反應(yīng)體系保持恒定的pH值。記下反應(yīng)12min內(nèi)消耗NaOH溶液的體積數(shù)，從NaOH溶液的體積數(shù)求得生成苯乙酸的量。特定條件下，單位時(shí)間內(nèi)單位酶量生成的苯乙酸的微克分子數(shù)為酶活。其中青霉素鈉鹽的水解反應(yīng)如下：固定化酶例：以殼聚糖為載體固定化青霉素?；阜椒ǎ簹ぞ厶禽d體的制備稱2g殼聚糖溶解在100mL的5％的乙酸溶液中，在微火上緩慢加熱，溶解，吸人針管，用針筒注入2％的多聚磷酸鈉溶液中，攪拌，使其凝固成顆粒狀，浸泡1～1.5h，抽濾，水洗至pH值為中性。用活化劑活化殼聚糖載體用不同的醛在不同pH值下，在室溫與上述殼聚糖載體置于轉(zhuǎn)速150r/min搖床上，反應(yīng)1.

5h，以蒸餾水充分洗滌。用活化載體固定化青霉素?；冈谏鲜鲱A(yù)處理的活化殼聚糖載體中加人一定量的酶液，在不同pH值下，置于轉(zhuǎn)速為150r／min搖床上振搖12h，充分洗滌后測(cè)固定化酶活和殘余酶液的酶活。酶活的測(cè)定固定化酶固定化酶的應(yīng)用1工業(yè)生產(chǎn)中：不論是早期從動(dòng)物臟器和植物種子種提取的酶，還是后來(lái)發(fā)現(xiàn)的種類繁多、功能多樣的微生物酶都已被覆蓋在固定化酶的研究領(lǐng)域。2生化制藥中：用來(lái)生產(chǎn)工業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的一些純度要求較高的制劑，其中有最早生產(chǎn)的氨基酸，還有抗生素、核酸、蛋白質(zhì)抗體、高純度的蛋白酶等。3生物傳感器和環(huán)境保護(hù)中：固定化葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?、青霉素電極等。將辣根過(guò)氧化酶大量吸附在磁石上，可以對(duì)水中的氯酚選擇性吸附。固定化酶例：磁性固定化酶處理含酚廢水的研究實(shí)驗(yàn)中所用的酶為辣根過(guò)氧化物酶（HRP），從生物體內(nèi)提取精制而成，具有較高的活性。利用辣根過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生活性氧，并將酚氧化，生成水溶性差的化合物，然后用過(guò)濾或沉淀的方法加以分離。其主要反應(yīng)為：即在HRP的作用下，氧化劑(H202)將酚氧化，產(chǎn)生了活性高的苯氧自由基等中間物，它們從酶的活性中心擴(kuò)散到溶液各處，與酚分子或苯氧自由基本身發(fā)生反應(yīng)，生成了一系列的聚合物。這些聚合物具有高相對(duì)分子質(zhì)量和低水溶性的特性，因而易從溶液中分離。固定化酶例：磁性固定化酶處理含酚廢水的研究實(shí)驗(yàn)方法:在50mL的錐形瓶中，先加入緩沖液，然后依次加入一定量已知酚濃度的水溶液、酶和過(guò)氧化氫溶液，磁力攪拌，控制一定的反應(yīng)條件，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，過(guò)濾，去除沉淀物，取濾液分析酚濃度，計(jì)算酚的去除