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文檔簡介

組織培養(yǎng)HeLa細(xì)胞傳代早期的組織培養(yǎng)

1885年,Roux用溫生理鹽水培養(yǎng)雞胚組織,首次采用"Tissueculture"1903年,Jolly用蓋片懸滴法培養(yǎng)蠑螈白細(xì)胞1906年,Beebe蓋片懸滴培養(yǎng)狗淋巴細(xì)胞組織培養(yǎng)的建立

1907年,Harrison培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)成功,創(chuàng)建蓋片凹玻璃懸滴培養(yǎng)法,公認(rèn)為組織培養(yǎng)真正的開始1910年,Carrel完善懸滴培養(yǎng)法,將無菌技術(shù)應(yīng)用到組織培養(yǎng)中組織培養(yǎng)的進(jìn)展

1943年,Earle等創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)法,首建長期傳代的L-細(xì)胞系1948年,Sanford創(chuàng)建單細(xì)胞分離培養(yǎng)法,獲L-細(xì)胞純系1951年,Gey首建人腫瘤細(xì)胞——HeLa細(xì)胞系1961年,Hayflick首建人二倍體細(xì)胞系25種(hayflick界限)組織培養(yǎng)發(fā)展概況我國組織培養(yǎng)的發(fā)展

30年代傳入、50年代建立實(shí)驗(yàn)室60年代我國建立世上第一個肝癌細(xì)胞系(BEL16)1985年成立了中國典型培養(yǎng)物保藏中心1990年中科院建立了細(xì)胞庫附:組織培養(yǎng)在植物學(xué)界

1902年,德國植物學(xué)家Haberlandt就預(yù)言植物細(xì)胞的全能性1934年,荷蘭植物學(xué)家溫特發(fā)現(xiàn)生長素,并證實(shí)了對植物細(xì)胞培養(yǎng)的作用1937年,普林斯頓的White等實(shí)驗(yàn)室獲得植物培養(yǎng)物的愈傷組織并長期培養(yǎng)成功。這是植物細(xì)胞與組織的首次成功1958年,Steward在人工條件下用胡蘿卜根部的細(xì)胞培育出了新植株優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用組織培養(yǎng)發(fā)展概況組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)、傳代細(xì)胞系、細(xì)胞株、克隆懸浮型、貼附型上皮細(xì)胞型細(xì)胞成纖維細(xì)胞型細(xì)胞游走型細(xì)胞不規(guī)則型細(xì)胞生存條件

基本營養(yǎng)物質(zhì)生長刺激因子水溫度氣體和氫離子濃度無菌的環(huán)境(無菌操作)其它(濕度、光等)

無菌操作環(huán)境的滅菌器械、器皿的清洗與滅菌無菌操作操作前要洗手,并用75%酒精噴手。試劑瓶等也要以酒精擦試。點(diǎn)燃酒精燈,操作在火焰附近進(jìn)行,耐熱物品可在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,并冷卻后才能使用,吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。操作動作要準(zhǔn)確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機(jī)會。不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。主要儀器設(shè)備超凈工作臺培養(yǎng)用液的配制、滅菌與保存(一)平衡鹽緩沖液

磷酸鹽緩沖液(PBS液,無Ca2+、Mg2+離子):8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4,溶于800mL去離子水中,用鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至7.4,然后定容至1L。過濾后121oC滅菌20min,4oC保存

培養(yǎng)基

主要成分(天然):血清、血漿、胚胎浸出液、水解乳蛋白等。

主要成分(合成):氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽、輔助物質(zhì)(核酸降解物、氧化還原劑等)。如:RPMI1640、DMEM、HamF12和Mc-Coy5A以超純水配制;過濾除菌、4oC保存。工作液含有10%FBS、1%雙抗抗生素

為防止微生物污染,培養(yǎng)基需加入青霉素、鏈霉素、卡那霉素和慶大霉素等。常用的是青霉素和鏈霉素的混合液。終濃度:青霉素10000U/mL、鏈霉素10000ug/mL培養(yǎng)用液的配制、滅菌與保存(二)消化液胰蛋白酶溶液胰酶溶液在pH8.0,溫度37℃,作用能力最強(qiáng)。注意:鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力。胰酶溶液常用PBS或者無鈣、鎂離子的D-Hanks平衡鹽溶液配制成0.25%溶液。EDTA·Na2溶液化學(xué)螯合劑,對細(xì)胞有一定的離觧作用,而且毒性小。常用工作液濃度為0.02%。

注意:使用EDTA處理細(xì)胞后,一定要用PBS沖洗干凈,殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長。pH調(diào)整液NaHCO3

溶液

常用濃度5.6%。pH值超過后,可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或通入CO2氣體方法調(diào)節(jié)。HEPES(N-2-羥乙基派嗪-N‘-2-乙黃酸)溶液

氫離子緩沖劑,具有較強(qiáng)的緩沖能力,能夠較長時間維持其緩沖作用。培養(yǎng)細(xì)胞的檢測常規(guī)檢查細(xì)胞生長狀況培養(yǎng)液污染生物學(xué)檢測形態(tài):一般形態(tài)觀察、超微結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞骨架觀察生長特性:細(xì)胞生長曲線等細(xì)胞遺傳:DNA染色,DNA含量測定,染色體的核型分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)化及惡性程度

細(xì)胞的密度細(xì)菌污染pH值變化對細(xì)胞的影響原代培養(yǎng)期傳代期衰退期潛伏期(貼附期)對數(shù)生長期平臺期衰退期細(xì)胞培養(yǎng)周期HeLa細(xì)胞傳代材料:HeLa細(xì)胞系美國霍普金斯大學(xué)GeorgeGey、MargaretGey等人,1951年來源:人宮頸癌細(xì)胞貼壁生長(能懸浮生長)形態(tài):上皮細(xì)胞型

PBS

DMEM培養(yǎng)基

雙抗(100X)

消化液:0.25%胰蛋白酶-0.02%

EDTA溶液

試劑鏡檢,觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)吸棄培養(yǎng)基,加入1mlPBS溶液洗去殘余培養(yǎng)基向培養(yǎng)皿內(nèi)滴加200ml消化液,37oC消化2-3min加500ml含10%血清的DMEM培養(yǎng)基(終止消化、懸浮細(xì)胞)

【細(xì)胞計數(shù):取20ml細(xì)胞懸液以PBS稀釋后計數(shù)】按比例分兩盤,進(jìn)行傳代。觀察:細(xì)胞分散均勻;密度:一約30%、一約60%。37oC、5%CO2培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長周期實(shí)驗(yàn)步驟35mm平皿較淺,加液后移動時請拿穩(wěn),避免晃動;加消化液時,請均勻地滴加在皿底;消化時間不宜過久,以免影響細(xì)胞活性;可通過鏡檢確定是否終止消化;除加消化液時,其他加液時避免直接沖擊細(xì)胞;操作時,勿使皿蓋打開過久;勿使細(xì)胞長期處于干燥狀態(tài);分盤后,將皿沿水平方向前后、左右各輕輕晃動幾次,使細(xì)胞分散均勻。注意事項鏡檢,觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)吸棄培養(yǎng)基加入1.5ml新鮮的完全培養(yǎng)基,加入150

l含有H2O2的完全培養(yǎng)基,至終濃度為0.8mm

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