《鴨疫里默氏桿菌病診斷技術規(guī)范》

鴨疫里默氏桿菌病診斷技術規(guī)范?????范圍本文件規(guī)定了鴨疫里默氏桿菌病診斷的術語和定義、臨床診斷、病原菌的分離培養(yǎng)、病原菌的鑒定與結果判定、生物安全。本文件適用于鴨疫里默氏桿菌病的診斷、檢疫、監(jiān)測及流行病學調查。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質量要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范術語和定義下列術語和定義適用于本文件。鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer）屬黃桿菌科，有莢膜，無芽孢、無鞭毛、不運動的革蘭氏陰性菌。多數菌體呈桿狀或橢圓狀，大小為0.3~0.5μm×0.7~6.5μm，個別菌體呈長絲狀，可達11.0~24.0μm。部分菌體表面有芽狀贅生物。鴨疫里默氏桿菌?。≧iemerellaanatipestiferdisease）是由鴨疫里默氏桿菌引起的一種接觸性\t"/item/%E9%B8%AD%E7%96%AB%E9%87%8C%E9%BB%98%E6%B0%8F%E6%9D%86%E8%8F%8C%E7%97%85/_blank"傳染性疾病，又稱為\t"/item/%E9%B8%AD%E7%96%AB%E9%87%8C%E9%BB%98%E6%B0%8F%E6%9D%86%E8%8F%8C%E7%97%85/_blank"鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨\t"/item/%E9%B8%AD%E7%96%AB%E9%87%8C%E9%BB%98%E6%B0%8F%E6%9D%86%E8%8F%8C%E7%97%85/_blank"敗血癥、鴨疫綜合癥、\t"/item/%E9%B8%AD%E7%96%AB%E9%87%8C%E9%BB%98%E6%B0%8F%E6%9D%86%E8%8F%8C%E7%97%85/_blank"鴨疫巴氏桿菌病等，特征性病理變化為全身漿膜表面覆有廣泛性的纖維素性滲出物，以肝周炎、心包炎、氣囊炎最為常見，還可引起腦膜炎、關節(jié)炎和輸卵管炎。臨床診斷流行病學鴨、鵝、火雞等多種禽類易感，自然條件下2~7周齡雛禽易感，其中以2~3周齡雛禽最易感。種禽和成年禽很少發(fā)病，但可成為傳染源。本病主要經呼吸道或皮膚傷口感染，還可通過種蛋垂直傳播。環(huán)境氣候改變、飼養(yǎng)管理不當、飼料變質或營養(yǎng)不均衡、運輸等應激因素均可誘發(fā)該病。臨床癥狀最急性型發(fā)病急、病程短，死前無明顯癥狀。急性型常見于2~4周齡的雛禽，病程1~3日。病禽表現為精神沉郁，縮頸，嘴拱地，步態(tài)不穩(wěn)，共濟失調，頻頻點頭，食欲衰減，咳嗽、打噴嚏，眼和鼻有分泌物；排黃白色或綠色糞便，病鴨死前頸震顫，角弓反張。慢性型常見于4~7周齡雛禽，病程在一周以上，主要表現為神經癥狀，如斜頸、轉圈、倒退等。耐過禽生長發(fā)育緩慢，生產性能低下。病理學變化纖維素性肝周炎肝臟腫大，質脆，呈棕黃色或土黃色，表面被覆有灰白色或淡黃色的纖維素膜，易剝離。纖維素性心包炎心臟腫大，心包積液，心外膜表面可見黃白色纖維素性分泌物和出血點，與心包膜粘連。纖維素性氣囊炎氣囊壁渾濁、增厚，有灰白色纖維素性滲出物附著，與胸腹壁粘連。纖維素性腦膜炎腦膜充血、水腫、增厚，部分腦膜上覆有纖維素性滲出物，腦實質淤血。關節(jié)炎關節(jié)液增多，乳白黏稠。干酪性輸卵管炎輸卵管膨大，橫切可見內含豆腐渣樣的白色干酪樣物質。結果判定若發(fā)病鴨符合4.1流行病學、4.2臨床癥狀和4.3病理變化，可判定為鴨疫里默氏桿菌病疑似病例。病原菌的分離培養(yǎng)樣品的采集、保存與運輸組織、腦、血樣、積液等病料樣品的采集、保存與運輸按照NY/T541的要求執(zhí)行。細菌分離培養(yǎng)接種無菌條件下進行。用消毒后的剪刀處理組織病料，露出切面，用無菌接種環(huán)自切面處伸入組織內部，劃線接種于普通瓊脂平板、血瓊脂平板和含5%新生牛血清的胰酶大豆瓊脂平板。平板的配制按照GB/T4789.28的規(guī)定操作。液體樣品直接劃線。培養(yǎng)接種后的平板在37℃、厭氧環(huán)境（含5%CO2的厭氧培養(yǎng)箱、燭缸或含厭氧產氣包的厭氧培養(yǎng)缸）中倒置培養(yǎng)24~48h。菌落形態(tài)觀察與結果判定菌落在普通瓊脂平板上不生長，在血瓊脂平板上呈灰白色、不溶血，在胰酶大豆瓊脂平板上呈圓形、透明、邊緣光滑整齊、有淡藍色熒光，可判定為鴨疫里默氏桿菌疑似菌落。病原菌的鑒定與結果判定生化鑒定生化試驗按GB4789.28中規(guī)定的方法配制生化發(fā)酵管。挑取符合5.2.3特征的疑似菌落，接種發(fā)酵管后于37℃恒溫培養(yǎng)24~48h。結果判定記錄生化試驗結果。若疑似菌落的生化特性與表1中一致，可確認該菌為鴨疫里默氏桿菌。鴨疫里默氏桿菌生化反應結果生化試驗項目反應結果生化試驗項目反應結果乳糖－甘露醇－VP－甲基紅－硫化氫－尿素酶+硝酸鹽－氧化酶+靛基質－明膠+PCR檢測方法與結果判定模板制備挑取符合5.2.3特征的疑似菌落，加到含有100μL生理鹽水的1.5mLEP管中，100℃煮沸10min，10000rpm離心2min，取上清作為DNA模板。引物序列檢測基因是鴨疫里默氏桿菌高度保守的熱休克蛋白編碼基因groEL（GenBank登錄號：GU060633）。上游引物序列：5?-GGGAGACGCACTTAAAAGAGGTG-3?；下游引物序列：5?-CCTTCTCTCACGATAGCTTGC-3?。擴增片段大小為271bp。反應體系每個樣品建立25μLPCR反應體系，見表2。鴨疫里默氏桿菌參考菌株（ATCC11845）的基因組作為陽性對照，無菌雙蒸水作為陰性對照。鴨疫里默氏桿菌groEL基因擴增體系配置表試劑名稱加樣體積（μL）2×TaqPCRMasterMix12.5上游引物（10μmol/L）1下游引物（10μmol/L）1DNA模板2滅菌去離子水8.5共計25.0PCR反應條件預變性95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸5min，結束反應，4℃保存。PCR產物電泳配制1.5%的瓊脂糖凝膠，添加工作濃度的核酸染料。取5μLPCR產物進行電泳，同時用DNAMarker作為分子量參考。用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析