深低溫凍存肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸質(zhì)量控制研究

深低溫凍存肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸質(zhì)量控制研究[摘要]目的探索上海東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫低溫凍存0～10年肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸的質(zhì)量。方法隨機(jī)抽取2008年至2017年間庫存手術(shù)切除肝細(xì)胞癌標(biāo)本30份。1％瓊脂糖凝膠電泳和RIN值評估法檢測RNA完整性。結(jié)果將組織標(biāo)本按凍存年限分成4組(<2年、3～5年、6～8年和>9年)，各組間的RNA濃度無顯著性差異(P>0.05)，各組之間A260/A280差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，四組之間的RIN值檢測顯示，凍存5年以上組的RIN值有明顯下降(P<0.05)。結(jié)論長期低溫時間超過5年后的肝細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)本RNA存在嚴(yán)重的降解。[關(guān)鍵詞]生物樣本；肝細(xì)胞癌；低溫保存；核糖核酸；質(zhì)量控制；前言腫瘤分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究對高質(zhì)量新鮮腫瘤標(biāo)本的需求日益增長，生物樣本庫建設(shè)是后基因組時代的重要課題。全球范圍內(nèi)各研究機(jī)構(gòu)建立有較為完善的腫瘤生物標(biāo)本庫ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Barry,2003#10"1-5)，不僅為腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究提供重要的標(biāo)本，并在核酸與蛋白質(zhì)的提取、分析和建立腫瘤細(xì)胞系方面取得成果ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Bao,2013#16"6-8)。上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫自2008年起開展肝癌生物樣本庫建設(shè)，在闡明肝癌發(fā)生的分子機(jī)制上提供了大量有價值的生物樣本ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Yu,2018#17"9-15)。目前，有較大比例生物樣本保存時間已經(jīng)長達(dá)10年之久。為分析長期冷凍保存腫瘤樣本是否適合分子生物學(xué)實驗，本文探討了低溫樣本庫的儲存年限與核糖核酸的分子完整性關(guān)系，以期為高質(zhì)量生物樣本庫建設(shè)以及腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供參考。1材料與方法肝細(xì)胞癌樣本隨機(jī)抽取上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫中2008年至2017年間庫存手術(shù)切除肝細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)本30份。所有樣本均為我院肝癌外科資深醫(yī)師行肝癌根治術(shù)切取的肝癌標(biāo)本，標(biāo)本離體后30min內(nèi)取材、分裝在低溫凍存管后投于液氮內(nèi)，然后轉(zhuǎn)入-80℃深低溫冰箱保存。低溫凍存時間在0至10年不等。樣本編號T代表肝細(xì)胞癌組織。所有患者術(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本編號與儲存時間的對應(yīng)關(guān)系見表1。表1：標(biāo)本編號與低溫儲存時間的對應(yīng)關(guān)系儲存年份組織樣本儲存時間(年）T(腫瘤組織)200808-1T﹑08-2T﹑08-3T10200909-1T﹑09-2T﹑09-3T9201010-1T﹑10-2T﹑10-3T8201111-1T﹑11-2T﹑11-3T7201212-1T﹑12-2T﹑12-3T7201313-1T﹑13-2T﹑13-3T5201414-1T﹑14-2T﹑14-3T4201515-1T﹑15-2T﹑15-3T3201616-1T﹑16-2T﹑16-3T2201717-1T﹑17-2T﹑17-3T1樣本中腫瘤細(xì)胞含量評估上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫所有組織均同時留存一份于10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋后制備組織切片，由本院擁有5年以上經(jīng)驗的病理醫(yī)師進(jìn)行腫瘤組織學(xué)分類以及腫瘤細(xì)胞含量評估，本研究所有樣本的腫瘤細(xì)胞含量均大于60％。

核糖核酸抽提與質(zhì)控RNA抽提采用Trizol(寶生,大連,中國)抽提法。分光光度計測定A260/A280比值，1％瓊脂糖凝膠電泳測量28S和18S核糖體RNA條帶。RNA上樣量為4ul，電泳時間30min，于凝膠圖像分析儀觀察電泳條帶；Agilent2100生物分析儀測量RNA完整數(shù)值(RNAintegritynumber，RIN)。統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。RNA的濃度、A260/A280比值、RIN值采用單向ANOVA檢驗。組間構(gòu)成比采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1

長期低溫時間對樣本抽提RNA濃度影響首先采用檢測了不同低溫保存年限的RNA濃度(ng/μL)。將組織標(biāo)本按照低溫凍存年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年和>9年，四組肝癌組織的RNA濃度分別為724.4±50.9﹑691.4±42.5﹑717.5±35.6﹑和618.5±34.5，各組之間RNA濃度沒有顯著性差異(圖1，F(xiàn)=1.111，P=0.363)?？梢姡L期低溫凍存對腫瘤組織樣本RNA濃度無影響。2.2

長期低溫時間對樣本抽提A260/A280影響將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，統(tǒng)計分析了四組間A260/A280差異，四組腫瘤的A260/A280比值分別為1.91±0.05﹑1.90±0.04﹑1.90±0.03﹑和1.93±0.04187,各組之間沒有顯著性差異(圖2，F(xiàn)=0.143，P=0.933)?？梢姡L期低溫凍存對腫瘤組織樣本A260/A280無影響。2.3長期低溫時間樣本對抽提RNARIN影響接下來比較了四組之間RIN值差異，將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，四組腫瘤的RIN值分別為8.38±0.56﹑7.78±0.36﹑5.78±0.48﹑和4.23±0.34，如圖3所示，<2年和3-5年兩組RIN值無差別(F=0.983，P=0.340)；6-8年組RIN值比較3-5年組RIN值有明顯下降(F=10.860，P=0.005)；>9年RIN值比較6-8年組有明顯下降(F=5.399，P=0.037)。提示凍存時間超過5年的標(biāo)本RNA質(zhì)量成逐年下降趨勢。2.4RNA分子完整性及質(zhì)量分級依照在1％瓊脂糖凝膠電泳圖上28S與18S條帶情況以及RIN值將樣本RNA質(zhì)量與完整性分為A,B,和C3級。在1％瓊脂糖凝膠電泳圖上有清晰的28S與18S兩條主帶且RIN大于7定義為A，若能看到兩條帶但清晰度下降且28S條帶模糊定義為B且RIN值大于4定義為B，若28S與18S兩條帶均消失呈涂抹狀或RIN值小于4則定義為C。本組樣本RNA分子的質(zhì)控檢測與儲存年限關(guān)系見表2。本研究組將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，各個A、B、C級樣本數(shù)目之比為5:1:0、6:3:0、1:6:2和0:3:3，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析提示樣本低溫凍存5年以內(nèi)A、B、C級樣本數(shù)目之比無明顯差異(P=0.604)，A、B、C級樣本數(shù)目比例在低溫凍存>9年組和3-5年組比較存在差異(P=0.013)；樣本低溫凍存6-8年，A、B、C級樣本數(shù)目比例比較3-5年組也存在差異(P=0.037)；但是樣本低溫凍存6-8年與低溫凍存>9年組A、B、C級樣本數(shù)目比例無差異(P=0.435)。提示凍存時間超過5年的標(biāo)本RNA提取高質(zhì)量樣本的數(shù)目銳減。3討論腫瘤生物樣本庫的核心是溫度與質(zhì)量，國際上在樣本核酸質(zhì)量分析中，A260，A280及其比值是判斷RNA樣本純度的指標(biāo)；RNA的完整性可用瓊脂糖凝膠電泳測量28S和18S核糖體RNA(rRNA)條帶法和RIN值檢測法ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Schroeder,2006#8"16)。A260代表核酸(RNA)吸光度，A280代表蛋白質(zhì)吸光度。純凈的RNA其A260/A280比值為1.7～2.0，比值<1.7表明有蛋白質(zhì)或酚類污染，比值>2.0表明可能有異硫氰酸胍殘留。對于RNA完整性的評價目前主要有兩種方法，包括瓊脂糖凝膠電泳測量28S和18S核糖體RNA(rRNA)條帶法和RIN值檢測法。rRNA占整個RNA分子的80％，而mRNA僅占RNA分子的3％，故檢測mRNA并不容易，而檢測含量高的rRNA相對容易。在瓊脂糖凝膠電泳中，當(dāng)28S和18S的rRNA條帶亮度比例為2時便被認(rèn)為RNA完整。RNA是極易降解的生物分子，由于缺血、凋亡及壞死等影響，28S的rRNA比18S的rRNA更易退化，所以28S和18S的比值為2難以實現(xiàn)。RIN的計算采用了“RIN軟件算法”，檢測結(jié)果以1到10數(shù)字表示，完整的RNA為10。根據(jù)現(xiàn)有實驗報道，RIN值>7可視為優(yōu)秀，適用于高質(zhì)量的RNA研究，如基因芯片檢測；RIN值為4～7視為良好，可以用于一般分子生物學(xué)研究，如定量PCR；當(dāng)RNA完全降解時RIN值為1ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Jeffries,2014#6"17,\o"Morrissy,2012#7"18)。自RIN檢測方法開發(fā)以來，被廣泛用來評價RNA完整性。有文獻(xiàn)提出，對于有一定程度RNA降解的樣本，也可以進(jìn)行定量PCR檢測獲得目的基因的相對表達(dá)量，從而提高了一批珍稀樣本利用率。在本研究中，我們依照凍存年限將組織標(biāo)本分成4組(<2年、3～5年、6～8年和>9年)，研究結(jié)果提示各組間的RNA濃度無顯著性差異(P>0.05)，各組之間A260/A280差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，四組之間的RIN值檢測顯示，凍存5年以上組的RIN值有明顯下降(P=0.018)。高質(zhì)量的A級別RNA質(zhì)量在凍存5年以上組所占比例開始降低，由此提示長期低溫時間超過5年后的肝細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)本RNA存在嚴(yán)重的降解。本研究不足之處在于僅對肝癌組織樣本RNA質(zhì)量進(jìn)行評估，缺乏對癌旁組織和正常肝組織樣本RNA質(zhì)量評估，我們將在接下來的研究中進(jìn)一步深入探討。[參考文獻(xiàn)]ADDINEN.REFLIST1. BarryW.NationaltumorbanksetupinUnitedkingdom.JournaloftheNationalCancerInstitute.2003;95(10):706.2. HuilingL,YuanQ,XinZ,XinX,DongjiangL,WeiW,etal.Establishmentofalungcancerbiobankofasouthernchinesepopulation.JournalofThoracicDisease.2009;1(1):17-22.3. MatzkeEA,O'DonoghueS,BarnesRO,DaudtH,CheahS,SuggittA,etal.Certificationforbiobanks:theprogramdevelopedbytheCanadianTumourRepositoryNetwork(CTRNet).Biopreservation&Biobanking.2012;10(5):426.4. RiegmanPHJ,DinjensWNM,OomenMHA,SpatzA,.,RatcliffeC,.,KnoxK,.,etal.TuBaFrost1:UnitinglocalfrozentumourbanksintoaEuropeannetwork:anoverview.EuropeanJournalofCancer.2006;42(16):2678-83.5. VaughtJ,RogersJ,MyersK,LimMD,LockhartN,MooreH,etal.AnNCIPerspectiveonCreatingSustainableBiospecimenResources.JNatlCancerInstMonogr.2011;2011(42):1-7.6. Bao,Wei-Guang,Zhang,Xia,Zhang,Jian-Gang,etal.BiobankingofFresh-frozenHumanColonTissues:ImpactofTissueEx-vivo;IschemiaTimesandStoragePeriodsonRNAQuality.AnnalsofSurgicalOncology.2013;20(5):1737-44.7. TroyerD.Biorepositorystandardsandprotocolsforcollecting,processing,andstoringhumantissues.MethodsinMolecularBiology.2008;441:193.8. ZhuZG,YuYY.Significanceofbiologicalresourcecollectionandtumortissuebankcreation.WorldJGastrointestOncol.2010;2(1):5-8.9. YuJ,XuQG,WangZG,YangY,ZhangL,MaJZ,etal.CircularRNAcSMARCA5inhibitsgrowthandmetastasisinhepatocellularcarcinoma.JournalofHepatology.2018;68(6).10. YuanJH,YangF,WangF,MaJZ,GuoYJ,TaoQF,etal.AlongnoncodingRNAactivatedbyTGF-betapromotestheinvasion-metastasiscascadeinhepatocellularcarcinoma.Cancercell.2014;25(5):666-81.11. YuanSX,WangJ,YangF,TaoQF,ZhangJ,WangLL,etal.LongnoncodingRNADANCRincreasesstemnessfeaturesofhepatocellularcarcinomabyderepressionofCTNNB1.Hepatology.2016;63(2):499-511.12. LiuF,YuanJ,Lt,HuangJ,YangF,WangT,etal.LongnoncodingRNAFTXinhibitshepatocellularcarcinomaproliferationandmetastasisbybindingMCM2andmiR-374a.Oncogene.2016;35(41):5422.13. XuQG,YuanSX,TaoQF,YuJ,CaiJ,YangY,etal.AnovelHBxgenotypeservesasapreoperativepredictorandfailstoactivatetheJAK1/STATspathwayinhepatocellularcarcinoma.JHepatol.2019.14. FangW,Ji-HangY,Shao-BingW,FuY,Sheng-XianY,ChenY,etal.OncofetallongnoncodingRNAPVT1promotesproliferationandstemcell-likepropertyofhepatocellularcarcinomacellsbystabilizingNOP2.Hepatology.2014;60(4):1278–90.15. ZhouCC,YangF,YuanSX,MaJZ,LiuF,YuanJH,etal.SystemicgenomescreeningidentifiestheoutcomeassociatedfocallossoflongnoncodingRNAPRALinhepatocellularcarcinoma.Hepatology.2016;63(3):850-63.16. SchroederA,MuellerO,StockerS,SalowskyR,LeiberM,GassmannM,etal.TheRIN:anRNAintegritynumberforassigningintegrityvaluestoRNAmeasurements.BMCmolecularbiology.2006;7:3.