第二篇-第2章-抗體制藥456節(jié)

第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程

抗體研究進(jìn)展3個(gè)階段：①1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，特點(diǎn)：多克隆抗體；②1975年Kǒhler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體；③1994年Winter基因工程方法制備抗體。Winter等人建立了噬菌體抗體庫(kù)，克服了人體不能隨意免疫的缺點(diǎn)，用人的外周血制備抗體文庫(kù)，獲得了人源性基因工程抗體。在此之前，基因工程抗體技術(shù)只能對(duì)已有的單體進(jìn)行改造，而抗體庫(kù)技術(shù)的誕生卻可以不通過動(dòng)物免疫和細(xì)胞融合便可以從抗體庫(kù)中篩選得到全新的人源化的抗體，并通過細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物生產(chǎn)出來(lái)。抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展使得抗體工程技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)期?？贵w庫(kù)技術(shù)的生產(chǎn)與發(fā)展基礎(chǔ)在于兩項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)的突破，一是PCR技術(shù)的應(yīng)用使得人們可以利用一組引物擴(kuò)增出全套免疫球蛋白的可變區(qū)的基因；二是從大腸桿菌中直接表達(dá)出有功能活性的抗體分子片段?；蛟硎菍⒛撤N動(dòng)物的所有抗體可變區(qū)的基因克隆在質(zhì)?；蚴删w載體中進(jìn)行表達(dá)，分泌，然后通過特定的固相化抗原便可篩選出高度特異性抗體基因的克隆。該抗體庫(kù)又稱全套抗體庫(kù)或組合抗體庫(kù)。用基因工程的方法可以將抗體基因的克隆和表達(dá)融為一體，同在一種載體上進(jìn)行，將抗體基因表達(dá)在載體的表面，用固相化抗原對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的載體進(jìn)行淘篩，在數(shù)日內(nèi)就可篩選出陽(yáng)性克隆。一、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法⒈獲取目的基因（RT-PCR）⒉抗體庫(kù)技術(shù)的載體（噬菌粒phagemid為載體）具有噬菌體與質(zhì)粒特點(diǎn)、轉(zhuǎn)化效率高、庫(kù)容量大⒊淘篩抗原固相化后，對(duì)噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增。⒋表達(dá)與鑒定（Westernblot）噬菌體抗體庫(kù)的技術(shù)流程采集淋巴細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞株等提取mRNART-PCR獲得VH，VL基因構(gòu)建分別表達(dá)VH，VL的載體擴(kuò)增后克隆至同一噬菌體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌或其他表達(dá)系統(tǒng)篩選特異性抗體并富集抗體的體外親和力成熟二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)

⒈模擬天然全套抗體庫(kù)抗體文庫(kù)可以達(dá)到或超過1011庫(kù)容，所以能包含B細(xì)胞全部克隆

⒉避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)可以調(diào)出任意抗體基因⒊可獲得高親和力的人源化抗體

抗體基因來(lái)自人體三、基因工程抗體表達(dá)⒈原核細(xì)胞表達(dá)（大腸桿菌）⒉真核細(xì)胞表達(dá)（酵母菌）⒊轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)（煙草）⒋轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)（鼠）第五節(jié)抗體診斷試劑一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑血清學(xué)鑒定是指用已知抗體來(lái)鑒定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的診斷和血型鑒定。常用的方法是凝集反應(yīng)。⒈鑒定病原菌的抗體試劑

⑴常用診斷血清的品種和用途

①沙門氏菌屬診斷血清②志賀氏菌屬診斷血清③病原性大腸埃希氏菌診斷血清⑵診斷血清的制備步驟

①制備細(xì)菌抗原②免疫動(dòng)物和制備抗體血清⑶診斷血清診斷方法—直接凝集反應(yīng)⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動(dòng)血凝診斷試劑⒊妊娠診斷試劑⒋抗ABO血型系統(tǒng)血清二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)方法不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，因而大幅度提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性，用于對(duì)微量抗原物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。⒈熒光抗體診斷試劑

⑴熒光抗體的制備⑵免疫熒光測(cè)定方法⒉免疫酶抗體診斷試劑

⑴免疫酶染色法用抗體診斷試劑⑵酶免疫測(cè)定用抗體診斷試劑①HBsAg酶標(biāo)診斷試劑②HBeAg酶標(biāo)診斷試劑③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標(biāo)診斷試劑④測(cè)定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo)抗體診斷試劑⑤甲胎蛋白（AFP）酶標(biāo)抗體診斷試劑⑥癌胚抗原（CEA）的酶標(biāo)抗體診斷試劑⒊放射免疫用抗體診斷試劑

放射免疫技術(shù)是將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)建立的檢測(cè)技術(shù)。

放射性核素標(biāo)記抗體的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法抗原的測(cè)定有：①夾心法②間接法③竟?fàn)幏ǔＳ脴?biāo)記抗體試劑有①HBsAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑②HBeAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑③HIV抗原放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑④AFP放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑⑤CEA放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑三、導(dǎo)向診斷藥物

放射性核素標(biāo)記抗體腫瘤放射免疫顯像

放射免疫顯像優(yōu)點(diǎn)：①在體內(nèi)確切腫瘤定位作用，準(zhǔn)確性達(dá)90%，靈敏度達(dá)100%。②在體內(nèi)可檢出0.5cm大小的病灶，并可檢出肺、腦的轉(zhuǎn)移灶。③小分子抗體易到達(dá)腫瘤部位，可顯著提高T/NT值。④抗體在腫瘤部位可保留6～9日⑤能觀擦抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。

放射免疫顯像定位技術(shù)

將抗腫瘤單克隆抗體（McAb）與二乙基三胺五乙酸（DTPA）在體外偶聯(lián)成McAb-DTPA，再注入體內(nèi)后，就能與體內(nèi)組織相結(jié)合。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DTPA是重金屬離子絡(luò)合劑，所以In-113M可以結(jié)合到DTPA分子上，使腫瘤組織顯像。這一過程在2小時(shí)內(nèi)可完成。

建立預(yù)定位技術(shù)需解決3個(gè)問題：

①抗體在腫瘤組織滯留要7天以上;在腫瘤組織內(nèi)的量要滿足顯像要求。②Ab-DTPA偶聯(lián)物比較穩(wěn)定。③內(nèi)源性金屬離子對(duì)DTPA的封閉作用要小。第六節(jié)抗體治療藥物以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟。治療用的制劑尚未達(dá)到商品化程度。障礙：分子量大，排斥反應(yīng)一、放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡(jiǎn)便、用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物⒈常用的抗癌藥物

氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）、環(huán)磷酰胺（CTX）等。以人血清白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細(xì)胞毒性提高2倍。⒉抗體類藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性

腫瘤細(xì)胞對(duì)抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR）。

MDR是由基因調(diào)控的，其編碼蛋白稱為P糖蛋白，其中P170是與腫瘤耐藥相關(guān)的主要蛋白，由Mdr1基因編碼，1280個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量170~180K的跨膜蛋白。耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理P蛋白是ATP酶依賴性藥泵，藥物進(jìn)入細(xì)胞后與P蛋白結(jié)合，利用ATP水解釋放的能量將藥物泵出胞外，使胞內(nèi)藥物蓄積減少，因而產(chǎn)生耐藥性。三、毒素偶聯(lián)的抗體藥物

⒈免疫毒素及其換代制品

在導(dǎo)向藥物中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈的非特異性結(jié)合，使其僅能在體外應(yīng)用。

第二代免疫毒素是利用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈作用相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用。

第三代免疫毒素是重組免疫毒素，用基因重組技術(shù)改造毒素基因，去除非特異性結(jié)合部位，明顯降低了毒性反應(yīng)。改造的毒素基因與小分子抗體基因重組后進(jìn)行表達(dá)，所以，特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、滲透性佳、免疫原性低。⒉免疫毒素的制備方法⑴毒素的來(lái)源：細(xì)菌毒素植物毒素⑵載體的種類載體主要作用是將毒素?cái)y帶至靶細(xì)胞表面，并與其結(jié)合，使毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)起作用。主要有：①小分子抗體FV或SCFV②細(xì)胞生長(zhǎng)因子③激素④CD4

⑶制備方法先克隆毒素基因，再利用基因重組技術(shù)去除毒素中非特異性細(xì)胞結(jié)合部位基因。經(jīng)改造的毒素基因再與載體基因cDNA重組，轉(zhuǎn)入受體菌中表達(dá)，形成融合蛋白，再經(jīng)過純化就得到重組免疫毒素。⒊免疫毒素的臨床應(yīng)用治療腫瘤、自身免疫病、并能克復(fù)組織移植排斥反應(yīng)。由于重組免疫毒素是在胞漿物質(zhì)代謝中發(fā)揮作用，相對(duì)分子質(zhì)量又小，滲透力強(qiáng)，所以效果好。隨著技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多的抗體走向臨床，成為攻克疾病的有力武器。根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)（http://）的資料統(tǒng)計(jì)（2000年），在369種進(jìn)行臨床研究（pipeline）的生物藥品中，抗體就占了59種，是除疫苗以外種類最多的。抗體可變區(qū)序列的多樣性決定其結(jié)合抗原的特異性，因而比較容易形成自己的專利，比其他產(chǎn)品有更廣闊的開發(fā)余地。第四章抗體制藥思考題（2）1、建立噬