選擇性必修3+生物技術(shù)與工程（重點(diǎn)知識梳理）-備戰(zhàn)2024年高考生物知識梳理和熱點(diǎn)歸納

生物技術(shù)與工程選擇性必修3知識整理選修三：發(fā)酵工程發(fā)酵是指人們利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過微生物的代謝轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過程原理：不同的微生物具有產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物的能力傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)指直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發(fā)酵保存下來的面團(tuán)、鹵汁等發(fā)酵物中的微生物進(jìn)行發(fā)酵、制作食品的技術(shù)。固體發(fā)酵（

）半固體發(fā)酵（

）泡菜、糧食白酒、腐乳等豆豉、醬、醬油等

腐乳制作中參與發(fā)酵的微生物：多種微生物，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。腐乳制作發(fā)酵原理：經(jīng)過微生物的發(fā)酵，豆腐中的蛋白質(zhì)被分解成小分子的肽和氨基酸。細(xì)胞代謝知識鏈接同化作用異化作用指生物體把從外界環(huán)境中獲取營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成自身的組成物質(zhì)，并且儲存能量的變化過程。概念：實(shí)例：植物的光合作用概念：實(shí)例：動物的呼吸作用指生物的分解代謝，是生物體將體內(nèi)的大分子轉(zhuǎn)化成小分子并釋放出能量的過程。寄生、腐生、共生同化作用自養(yǎng)異養(yǎng)光能自養(yǎng)型化能自養(yǎng)型同化類型：異化類型：自養(yǎng)、異養(yǎng)需氧、厭氧、兼性厭氧代謝類型泡菜制作流程配制鹽水用清水和食鹽配制質(zhì)量百分比為5%-20%的鹽水，并將鹽水煮沸，冷卻待用；原料處理、蔬菜裝壇將新鮮蔬菜洗凈，切成塊狀或條狀，混合均勻，晾干后裝入泡菜壇內(nèi)；裝至半壇時，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，繼續(xù)裝至八成滿；①鹽的作用：②鹽水濃度要適宜的目的：③鹽水煮沸的目的：④冷卻的目的：調(diào)味；抑制其他微生物生長過高：口味不佳，亞硝酸鹽含量高；過低：雜菌易繁殖，導(dǎo)致泡菜變質(zhì)。殺滅微生物；去除水中的溶解氧⑤為什么泡菜壇只能裝八分滿？泡菜發(fā)酵初期，酵母菌等較為活躍，發(fā)酵產(chǎn)物中有較多CO2，防止發(fā)酵液溢出壇外；防止因裝太滿使鹽水未完全淹沒菜料而導(dǎo)致菜料變質(zhì)腐爛；同時留有一定空間，也更方便拿取泡菜。保證乳酸菌等發(fā)酵微生物的正常生命活動加鹽水將冷卻好的鹽水緩緩倒入壇中，使鹽水沒過菜料，蓋好壇蓋封壇發(fā)酵向壇蓋邊緣的水槽中注滿水，并在發(fā)酵過程中注意經(jīng)常向水槽中補(bǔ)充水；根據(jù)室內(nèi)溫度控制發(fā)酵時間；⑥用水密封泡菜壇的目的：⑦為什么在泡菜制作過程中要保持無氧環(huán)境？給泡菜壇內(nèi)創(chuàng)造無氧環(huán)境，嚴(yán)格控制厭氧條件制作泡菜所用的菌種乳酸菌是一種厭氧菌，只有在無氧環(huán)境中才會進(jìn)行乳酸發(fā)酵。⑧制作泡菜往往要加入一些白酒的作用：抑制泡菜表面雜菌的生長;是一種調(diào)味劑,增加醇香感【總結(jié)】泡菜制作——腌制條件腌制時間：不能過短

溫度：不能過高

食鹽含量：不能過低升高：隨著無氧條件的形成，厭氧型的硝酸鹽還原菌大量繁殖，將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽含量增加。下降：當(dāng)發(fā)酵到一定階段后，硝酸鹽還原菌受到抑制，原有的亞硝酸鹽部分分解，亞硝酸鹽含量下降。發(fā)酵制作泡菜過程中，需要注意控制腌制時間、溫度、食鹽的用量，否則容易造成細(xì)菌大量繁殖，使亞硝酸鹽的含量增加，影響泡菜的品質(zhì)。10天后食用比較合適，因?yàn)橐呀?jīng)降低到較低水平。測定亞硝酸鹽含量方法：比色法原理：鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，能與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合使溶液顏色變?yōu)槊都t色。小結(jié)：泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽的變化發(fā)酵時期

乳酸菌乳酸亞硝酸鹽發(fā)酵前期少（O2抑制乳酸菌活動）少增加（硝酸鹽還原菌的作用）發(fā)酵中期最多（乳酸菌比其他雜菌更耐酸。乳酸積累，抑制其他菌活動）增多達(dá)到最多后開始下降（硝酸鹽還原菌受抑制，部分亞硝酸鹽被分解）發(fā)酵后期減少（乳酸積累，pH下降，抑制乳酸菌活動）繼續(xù)增多，最后保持穩(wěn)定下降至保持相對穩(wěn)定（硝酸鹽還原菌被完全抑制）變化曲線質(zhì)量百分比為0.4%-0.8%時泡菜的口味、品質(zhì)最佳亞硝酸鹽本身并不致癌，在適宜的pH、溫度和一定的微生物作用下會轉(zhuǎn)變成亞硝胺（致癌、致畸和致突變）作用。（異養(yǎng)厭氧型）果酒果醋制作器具消毒將發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒，晾干備用沖洗葡萄取新鮮葡萄，用清水沖洗1-2次，再去除枝梗和腐爛的籽粒，瀝干榨汁裝瓶用榨汁機(jī)榨取葡萄汁，將葡萄汁裝入發(fā)酵瓶（注意：要留有大約1/3的空間），蓋好瓶蓋酒精發(fā)酵溫度控制在18-30℃進(jìn)行發(fā)酵。每隔12h左右將瓶蓋擰松一點(diǎn)（不是打開瓶蓋）,再擰緊瓶蓋。發(fā)酵時間為10-12d.①70%的酒精的作用：②沖洗的目的：③葡萄能否反復(fù)沖洗？④去梗前沖洗:⑤葡萄汁裝入發(fā)酵瓶為何要留有1/3空間？

⑥每隔12h左右將瓶蓋擰松目的：

⑦擰松但不打開的目的：消毒去除表面灰塵、污物不能，防止野生菌種數(shù)量減少，影響發(fā)酵避免葡萄破損,減少被雜菌污染機(jī)會先讓酵母菌進(jìn)行有氧呼吸，快速繁殖，耗盡O2后，再進(jìn)行酒精發(fā)酵；防止發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2造成發(fā)酵液溢出排出氣體防止雜菌污染打開瓶蓋，蓋上紗布葡萄酒制作完成后，打開瓶蓋，蓋上一層紗布，進(jìn)行葡萄醋的發(fā)酵。發(fā)酵溫度為30-35℃，時間為7-8d。果醋檢測果酒檢測可通過從發(fā)酵瓶口取樣來對發(fā)酵的情況進(jìn)行檢測⑧如何檢測果酒發(fā)酵情況（是否產(chǎn)生酒精）？a.聞;b.品嘗;c.用酸性條件下的重鉻酸鉀溶液檢測橙色→灰綠色⑨醋酸菌從何而來？⑩如何檢測果醋的發(fā)酵情況？a.聞；b.品嘗；c.使用pH試紙檢測比較發(fā)酵前后的pH值；d.觀察醋酸菌膜是否形成；空氣中/其他的菌因不適應(yīng)環(huán)境條件（不能利用乙醇）而不能繁殖設(shè)計(jì)果酒發(fā)酵與果醋發(fā)酵裝置結(jié)構(gòu)

作用酒精發(fā)酵時狀態(tài)醋酸發(fā)酵時狀態(tài)充氣口通入空氣關(guān)閉打開，并接入氣泵排氣口排出CO2打開打開出料口便于取樣檢查和放出發(fā)酵液關(guān)閉關(guān)閉1.為什么排氣口膠管長而彎曲？2.該裝置還能繼續(xù)改進(jìn)嗎？防止空氣中微生物的污染可以在充氣口填充棉花或者安裝其他過濾裝置，以防止充入的氣體攜帶外來雜菌污染發(fā)酵液等。項(xiàng)目果酒制作果醋制作發(fā)酵菌種

菌種來源菌種代謝類型

菌種細(xì)胞類型發(fā)酵原理在有氧條件下：在無氧條件下：

氧氣、糖源都充足時：缺少糖源時：發(fā)酵條件溫度

時間氧氣

酵母菌果酒制作與果醋制作的比較醋酸菌主要是附著在葡萄皮上的野生型酵母菌異養(yǎng)兼性厭氧型異養(yǎng)需氧型真核細(xì)胞原核細(xì)胞C6H12O6+6H2O+6O2

6CO2+12H2O+能量酶C6H12O62C2H5OH+2CO2+少量能量酶空氣中的野生型醋酸菌C6H12O6+2O2

2CH3COOH+2H2O+2CO2+能量酶C2H5OH+O2

CH3COOH+H2O+能量酶18-30℃，最適溫度28℃30-35℃10-12d7-8d初期需氧，后期不需氧需要氧氣培養(yǎng)基的配制1.類型：劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)，擴(kuò)大培養(yǎng)半固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂瓊脂:是一種從紅藻中提取的多糖.瓊脂在98℃以上熔化,在44℃以下凝固,在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)固態(tài)觀察微生物的運(yùn)動、分類鑒定固體培養(yǎng)基微生物分離（菌落）、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種化學(xué)成分天然培養(yǎng)基含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基各種成分完全是已知的分類、鑒定用途選擇培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)以抑制不需要的微生物的生長,促進(jìn)所需要的微生物的生長。培養(yǎng)、分離出特定微生物鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物2.營養(yǎng)構(gòu)成:（1）基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽、（特殊營養(yǎng)物質(zhì)(生長因子)）①碳源：無機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-有機(jī)碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物②氮源：無機(jī)氮源：N2、NH4＋、NO3-、NH3等有機(jī)氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等凡是能夠?yàn)槲⑸锾峁┨荚氐臓I養(yǎng)物質(zhì)。a.構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物b.有些能為異養(yǎng)微生物提供能源作用：凡是能夠?yàn)槲⑸锾峁┑氐臓I養(yǎng)物質(zhì)。將無機(jī)氮合成含氮的代謝產(chǎn)物，主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含N的代謝產(chǎn)物。作用：培養(yǎng)基的配制③特殊營養(yǎng)物質(zhì)——生長因子c.常見的特殊營養(yǎng)物質(zhì)：a.概念：b.作用：微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物。酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。注意：并不是所有碳源都能提供能量，有機(jī)碳源才能提供能量(有機(jī)物氧化釋放能量)。對于植物來說：碳源：CO2能源：光能

故碳源≠能源無機(jī)氮源也能提供能量→硝化細(xì)菌硝化細(xì)菌的生命活動→反應(yīng)式：2NH3+3O2→2HNO2+2H2O+158kcal不是所有培養(yǎng)基都含有碳源，氮源，水和無機(jī)鹽生物硝化細(xì)菌藍(lán)細(xì)菌/衣藻根瘤菌酵母菌乳酸菌能源氧化NH3光能糖類的氧化糖類的氧化糖類的氧化碳源CO2CO2糖類糖類糖類氮源NH3NO3-N2NH4+、NO3-NH4+、NO3-代謝自養(yǎng)需氧型自養(yǎng)需氧型異養(yǎng)需氧型異養(yǎng)兼性厭氧型異養(yǎng)厭氧型表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g碳源、磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機(jī)鹽H2O定容至1000ml水例如:培養(yǎng)乳酸菌要添加維生素；培養(yǎng)霉菌要調(diào)酸性；

培養(yǎng)細(xì)菌要調(diào)至中性或弱堿性；培養(yǎng)厭氧菌要提供無氧條件。三、無菌技術(shù)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵：防止外來雜菌的入侵類型適用范圍操作方法消毒煮沸消毒法家庭餐具等生活用品100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體：牛奶、啤酒、果酒和醬油等62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學(xué)藥劑生物活體、水源等，用于皮膚、傷口、動植物組織表面消毒、手術(shù)器械、塑料或玻璃器皿擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線接種室、接種箱，超凈工作臺紫外線照射30min，表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。照30min，可先噴灑石炭酸或煤酚皂溶液加強(qiáng)消毒效果。消毒與滅菌滅菌灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等,生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室常用高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa,溫度121℃,15～30min四、微生物的純培養(yǎng)由單一個體繁殖所獲得的微生物群體為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過程是純培養(yǎng)。1.概念：2.步驟：

配制培養(yǎng)基→調(diào)pH→滅菌（培養(yǎng)基和器具）→倒平板→微生物接種→分離→恒溫箱培養(yǎng)平板劃線法、稀釋涂布平板法待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。

拔出錐形瓶的棉塞↓

將瓶口迅速通過火焰↓用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一

條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基倒入，立即蓋上皿蓋

↓等待培養(yǎng)皿冷卻后，將培養(yǎng)皿倒過來放置灼燒滅菌

目的：避免瓶口微生物污染培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)基目的：平板冷凝后,皿蓋上會凝結(jié)水珠,凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高,將平板倒置,既可以防止培養(yǎng)基表面的水分過快揮發(fā),又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基,造成污染?？梢杂檬钟|摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可怎么確定所倒平板未被雜菌污染？將所倒平板（未接種的培養(yǎng)基）放入恒溫箱中培養(yǎng)一段時間觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。四、微生物的純培養(yǎng)2.步驟：

配制培養(yǎng)基→調(diào)pH→滅菌（培養(yǎng)基和器具）→倒平板→微生物接種→分離→恒溫箱培養(yǎng)平板劃線法、稀釋涂布平板法（1）將接種環(huán)放在火焰上灼燒（防止雜菌污染），直到燒紅（2）在火焰旁冷卻接種環(huán)（以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種），并拔出裝有酵母菌的棉塞（通氣并避免雜菌污染）（3）將試管口通過火焰（防止雜菌污染）（4）在火焰附近，將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，蘸取一環(huán)菌液（5）將試管通過火焰，并塞上棉塞（6）左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。（7）灼燒接種環(huán)，冷卻后，從第一區(qū)域劃線末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。由單一個體繁殖所獲得的微生物群體為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過程是純培養(yǎng)。1.概念：為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時,仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？灼燒時期目的取菌種前殺死接種環(huán)上所有微生物每次劃線前殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個細(xì)胞接種結(jié)束后殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者（至少灼燒三次）

灼燒次數(shù)=劃線區(qū)域數(shù)+1在做第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少（過程上強(qiáng)調(diào)稀釋），最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落（結(jié)果上強(qiáng)調(diào)得到單菌落）。菌種的保存：⑴臨時保藏：固體斜面培養(yǎng)基（增大接種面積）上4℃保存(缺點(diǎn)：菌種易被污染或產(chǎn)生變異)⑵長期保存：－20℃甘油管在冷凍箱中保藏四、微生物的純培養(yǎng)2.步驟：

配制培養(yǎng)基→調(diào)pH→滅菌（培養(yǎng)基和器具）→倒平板→微生物接種→分離→恒溫箱培養(yǎng)平板劃線法、稀釋涂布平板法梯度稀釋鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中（鏟子、信封滅菌）火焰旁稱取土壤10g，10g土樣+90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。1ⅹ1090mL無菌水1071051061031021041mL1mL1mL1mL9mL無菌水1mL取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。吹吸三次（使菌液和水充分混合）

1mL將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。涂布平板實(shí)例：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)原理：CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml培養(yǎng)基一培養(yǎng)基二培養(yǎng)基一的主要碳源為牛肉膏,主要氮源為蛋白胨;培養(yǎng)基二的主要碳源為葡萄糖，唯一氮源為尿素；不具有選擇作用，培養(yǎng)基上生長的菌落多具有選擇作用，培養(yǎng)基上生長的菌落少配制培養(yǎng)基一和二→滅菌→空白培養(yǎng)基培養(yǎng)箱中培養(yǎng)→培養(yǎng)后無菌落方可繼續(xù)實(shí)驗(yàn)→配制等梯度土壤樣液→稀釋涂布→培養(yǎng)箱中培養(yǎng)→觀察菌落生長情況接種菌液的選擇性培養(yǎng)基接種菌液的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基空白選擇性培養(yǎng)基空白牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基判斷培養(yǎng)基是否被雜菌污染證明尿素作為唯一氮源培養(yǎng)基具有選擇作用每個濃度至少設(shè)置4個平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組，三個重復(fù)）實(shí)例：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法→活菌計(jì)數(shù)法：常用：稀釋涂布平板法

計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和細(xì)菌計(jì)數(shù)板比濁法：借助分光光度計(jì)都無法區(qū)分死菌和活菌。選擇30-300個菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)；每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；恰當(dāng)?shù)南♂尪取⑼坎际欠窬鶆蚴浅晒y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。計(jì)數(shù)原則:結(jié)果分析：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少；統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。原因：當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。鑒定：CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3pH升高，酚紅指示劑變紅（1）液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；（2）固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強(qiáng)。細(xì)菌：一般104、105、106放線菌：一般103、104、105真菌：一般102、103、104實(shí)例：纖維素分解菌的篩選原理：纖維素+剛果紅染液紅色復(fù)合物纖維素分解菌（纖維素酶）選擇培養(yǎng)基：以纖維素作為主要碳源。該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無機(jī)鹽KClNa2HPO4·7H2OKH2PO4MgSO4

·7H2O無機(jī)鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酪素0.5g氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水紅色消失，出現(xiàn)透明圈土壤取樣→篩選原則：根據(jù)微生物對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找∴樹葉、秸稈、濾紙條

選擇培養(yǎng)→（培養(yǎng)基特點(diǎn)：無凝固劑（擴(kuò)大培養(yǎng)∴液體培養(yǎng)基），以纖維素粉作為主要碳源

1.增加纖維素分解菌濃度，確保能夠從樣品中分離到所需微生物2.起到選擇作用

梯度稀釋→將樣品涂布在鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→篩選產(chǎn)生透明圈的菌落1.為固定培養(yǎng)基2.加入剛果紅起鑒別作用方法1：先培養(yǎng)微生物得到菌落，加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)方法2：配制培養(yǎng)基時就加入剛果紅實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選，人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度和pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長分解能力強(qiáng)的：大圈直徑/小圈直徑發(fā)酵工程及其應(yīng)用1.基本環(huán)節(jié)（1）選育菌種：目的：獲得性狀優(yōu)良的菌種菌種來源關(guān)鍵點(diǎn)實(shí)例從自然界中篩選誘變育種若生產(chǎn)的是微生物直接合成的產(chǎn)物，如青霉素、谷氨酸等，可從自然界中先分離出相應(yīng)菌種，再用物理或化學(xué)方法誘變育種，從突變個體中篩選出符合生產(chǎn)要求的優(yōu)良菌種。篩選產(chǎn)酸量高的黑曲霉用來生產(chǎn)檸檬酸基因工程育種若生產(chǎn)的是微生物不能合成的產(chǎn)品，可用基因工程、細(xì)胞工程的方法對菌種的遺傳特性進(jìn)行定向改造，以構(gòu)建工程細(xì)胞或工程菌，從而達(dá)到生產(chǎn)相應(yīng)產(chǎn)品的目的。使用基因工程改造的啤酒酵母，加速發(fā)酵、縮短生產(chǎn)周期單細(xì)胞蛋白=微生物菌體選修三：細(xì)胞工程原理和方法細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)操作水平細(xì)胞器水平、細(xì)胞水平或組織水平目的獲得特定的細(xì)胞組織、器官、個體或細(xì)胞產(chǎn)品分類植物細(xì)胞工程和動物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)——植物組織培養(yǎng)1.過程：外植體愈傷組織芽（先）脫分化再分化植物體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：細(xì)胞分裂素≈生長素細(xì)胞分裂素>生長素細(xì)胞分裂素<生長素根（后）胚狀體一般遮光需要光照，因?yàn)檠堪l(fā)育成葉，葉肉細(xì)胞中葉綠素的合成需要光照愈傷組織：排列疏松且無規(guī)則、高度液泡化、高度未分化、呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞團(tuán)。植物激素中生長素和細(xì)胞分裂素是啟動細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵。激素的使用順序、使用量及比例影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向：脫分化讓已經(jīng)分化的細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化細(xì)胞的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化。再分化脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)又可以重新分化成胚狀體或叢芽等器官，這一過程稱為植物細(xì)胞的再分化。實(shí)質(zhì)：使細(xì)胞恢復(fù)

分裂能力實(shí)質(zhì)：細(xì)胞分化和

有絲分裂脫分化、再分化、細(xì)胞分化都會改變細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能。一定的營養(yǎng)：蔗糖植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)——植物組織培養(yǎng)1.過程：外植體愈傷組織芽脫分化再分化植物體細(xì)胞分裂素≈生長素細(xì)胞分裂素>生長素細(xì)胞分裂素<生長素根胚狀體外植體消毒：流水沖洗→體積分?jǐn)?shù)70%酒精消毒30s→無菌水清洗2~3次→質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%次

氯酸鈉溶液處理30min→無菌水清洗2~3次外植體切段：0.5~1cm長的小段（莖尖等分生組織：取材原因：分化程度低，分裂能力強(qiáng)，更容易表達(dá)出全能性）接種外植體：形態(tài)學(xué)下端插在培養(yǎng)基2.原理：植物細(xì)胞具有全能性，原因：高度分化的細(xì)胞仍含有該物種的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個體所需要的全套基因。具有全能性≠體現(xiàn)（表現(xiàn)）全能性具有全能性：理論上細(xì)胞都具有全能性體現(xiàn)全能性：發(fā)育為完整的個體或其他各種細(xì)胞種子（器官）發(fā)育成為完整植株不能體現(xiàn)全能性體內(nèi)細(xì)胞沒有表現(xiàn)出全能性，而是分化成為不同的組織、器官的原因：在特定的時間和空間條件下，細(xì)胞中的基因選擇性表達(dá)各種蛋白質(zhì)，從而構(gòu)成生物體不同的組織和器官。植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)——植物組織培養(yǎng)1.過程：外植體愈傷組織芽（先）脫分化再分化植物體根（后）胚狀體細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)突變體的利用：誘變育種人工種子無性繁殖，保持優(yōu)良品種的遺傳特性作物脫毒原因：馬鈴薯、草莓和香蕉用無性繁殖的方式進(jìn)行繁殖，它們感染的病毒很容易傳給后代，病毒在作物體內(nèi)逐年積累，就會導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)變差

→解決方案：取一定大小的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，培育脫毒苗。原因：植物頂端分生區(qū)附近（如莖尖）病毒極少，甚至無病毒→脫毒苗≠抗毒苗初生代謝：生物生長生存所必需的代謝活動。產(chǎn)物：如糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等。次生代謝：非生物生長所必需，在特定條件下進(jìn)行作用：在植物抗病、抗蟲等方面發(fā)揮作用，也是很多藥物、香料和色素等的重要來源植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)——植物組織培養(yǎng)1.過程：外植體愈傷組織芽（先）脫分化再分化植物體根（后）胚狀體細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)突變體的利用：誘變育種人工種子無性繁殖，保持優(yōu)良品種的遺傳特性選擇花粉培養(yǎng)單倍體植株純合體染色體數(shù)目加倍花藥離體培養(yǎng)即植物組織培養(yǎng)

單倍體育種：二倍體可得到穩(wěn)定遺傳的純合子≠單倍體育種一定會得到純合子（考慮四倍體）AAaa配子AA：Aa：aa=1：4：1Aaaa，AAa，Aaa配子的種類和比例→標(biāo)號法再生出細(xì)胞壁植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B原生質(zhì)體B原生質(zhì)體A人工誘導(dǎo)融合，并篩選融合原生質(zhì)體雜合細(xì)胞A+B脫分化愈傷組織再分化雜合植株去壁去壁植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)——植物體細(xì)胞雜交技術(shù)1.過程原理：細(xì)胞膜具有一定的流動性原理：植物細(xì)胞的全能性。再生出細(xì)胞壁植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B原生質(zhì)體B原生質(zhì)體A人工誘導(dǎo)融合，并篩選融合原生質(zhì)體雜合細(xì)胞A+B脫分化愈傷組織再分化雜合植株去壁去壁植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)——植物體細(xì)胞雜交技術(shù)1.過程酶解法：纖維素酶和果膠酶一般加入一定濃度的無機(jī)鹽離子和甘露醇，原因:使溶液具有一定的滲透壓，防止原生質(zhì)體吸水過多而漲破，保持原生質(zhì)體正常融合方法：物理法：電融合法，離心法化學(xué)法：聚乙二醇(PEG)，高Ca2+-高pH植物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志*可遺傳變異類型：染色體數(shù)目變異求組數(shù)：用加法意義：打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種思考：3.(P38拓展題)雜種植株包含兩個物種的全部遺傳物質(zhì)，各種基因都包含在內(nèi)，卻未按照人們的要求表現(xiàn)出親本所有的性狀，例如“番茄-馬鈴薯”并沒有地上結(jié)番茄，地下長馬鈴薯，這是為什么？生物體內(nèi)基因的表達(dá)不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的。動物細(xì)胞工程—動物細(xì)胞培養(yǎng)取動物組織塊分散成單個細(xì)胞剪碎或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理制成細(xì)胞懸液加培養(yǎng)液→原代培養(yǎng)分瓶早期胚胎或幼齡動物的組織、器官（細(xì)胞分化程度低，增殖能力強(qiáng)，容易培養(yǎng)）原代培養(yǎng)①懸浮生長類：能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖，會因細(xì)胞密度過大、有害代謝物積累和培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素而分裂受阻。②貼壁生長類：大多數(shù)需要貼附于某些基質(zhì)表面才能生長增殖（細(xì)胞貼壁）（要求培養(yǎng)皿表面光滑）；除受密度、有害代謝物、營養(yǎng)物質(zhì)影響外，還會發(fā)生接觸抑制→接觸抑制：即當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞通常會停止分裂增殖。傳代培養(yǎng)→用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)分瓶前/10代以內(nèi)分瓶后/10代以外第一次

作用對象：動物組織塊

作用：使組織細(xì)胞彼此分散開來第二次

作用對象：貼壁的單層細(xì)胞作用：使貼壁生長的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來兩次使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶作用對象和作用營養(yǎng)條件糖類（葡萄糖）、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素等原理：細(xì)胞增殖（有絲分裂）地位：動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)動物細(xì)胞工程——動物細(xì)胞培養(yǎng)取動物組織塊分散成單個細(xì)胞剪碎或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理制成細(xì)胞懸液加培養(yǎng)液→原代培養(yǎng)分瓶早期胚胎或幼齡動物的組織、器官（細(xì)胞分化程度低，增殖能力強(qiáng)，容易培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)營養(yǎng)條件：糖類（葡萄糖）、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素等其他條件無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行滅菌處理在無菌環(huán)境下進(jìn)行操作還需要定期更換培養(yǎng)液溫度：哺乳動物：36.5+0.5℃pH：7.2~7.4滲透壓：維持細(xì)胞正常的形態(tài)和功能含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱CO2的主要作用維持培養(yǎng)液的pH原代、傳代分界線目前使用的或冷凍保存的正常細(xì)胞通常為10代以內(nèi)，以保持細(xì)胞正常的二倍體核型。傳代培養(yǎng)時（50代以上時），少部分細(xì)胞會克服細(xì)胞壽命的自然極限，獲得不死性，這些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了突變，正在朝著等同于癌細(xì)胞的方向（細(xì)胞轉(zhuǎn)化）發(fā)展由于細(xì)胞之間有接觸抑制的特性，一般的正常細(xì)胞并不重疊于其他細(xì)胞之上生長，而是單層生長。癌細(xì)胞由于無接觸抑制而能夠繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，發(fā)生堆積。是否接觸抑制可作為區(qū)別正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一。真牛肉，支架作用：模擬體內(nèi)肌肉生長環(huán)境，輔助形成細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用1.概念：動物和人體內(nèi)仍保留著少數(shù)具有分裂和分化能力的細(xì)胞，這些細(xì)胞叫作干細(xì)胞。2.分布：干細(xì)胞存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。3.類型和特點(diǎn)：①胚胎干細(xì)胞②成體干細(xì)胞干細(xì)胞①全能干細(xì)胞②多能干細(xì)胞干細(xì)胞③專能干細(xì)胞造血干細(xì)胞——神經(jīng)干細(xì)胞—————————胚胎干細(xì)胞具有分化為成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個體的潛能。成體干細(xì)胞具有組織特異性，只能分化成特定的細(xì)胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)通過體外誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞→避免免疫排斥反應(yīng)動物細(xì)胞工程——動物細(xì)胞融合1.原理：細(xì)胞膜具有一定的流動性

2.融合方法：

物理方法：電融合法

化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）融合法生物方法：滅活的病毒誘導(dǎo)法

（原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白

發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。）3.動物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志：可以進(jìn)行有絲分裂4.結(jié)果：形成單核細(xì)胞，具有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息，可表現(xiàn)出兩個或多個親本的特點(diǎn)。5.意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能/為制備單克隆抗體提供基礎(chǔ)。動物細(xì)胞工程——單克隆抗體注射特定抗原免疫小鼠↓培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞↓已免疫的B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞多種細(xì)胞多種雜交瘤細(xì)胞（特點(diǎn)：既能大量增殖，又能分泌專一抗體）能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞第一次篩選：HAT選擇培養(yǎng)基篩選（加入氨基蝶呤）目的：獲得雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖體外培養(yǎng)單克隆抗體（特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并能大量制備）融合（融合率<100%）第二次篩選：專一抗體檢測、克隆化培養(yǎng)目的：篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)用：1.作為診斷試劑——最廣泛應(yīng)用

（早早孕診斷試劑盒）2.用于疾病檢測

3.用于治療疾病和運(yùn)載藥物

生物導(dǎo)彈：單克隆抗體＋抗癌藥物若要獲得大量漿細(xì)胞，用相同抗原對小鼠進(jìn)行多次注射重構(gòu)胚是指人工重新構(gòu)建的胚胎，具有發(fā)育成完整個體的能力。重構(gòu)胚早期胚胎通過電融合法

使兩細(xì)胞融合，供體核進(jìn)入卵母細(xì)胞用物理或化學(xué)方法激活重構(gòu)胚，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過程將胚胎移入受體（代孕）母牛體內(nèi)采集牛卵巢中的卵母細(xì)胞，在體外培養(yǎng)到MⅡ中期去核的卵母細(xì)胞供體細(xì)胞培養(yǎng)將供體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞高產(chǎn)奶牛（供體）生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛通過顯微操作去核從供體身體的某一部位上取體細(xì)胞供體細(xì)胞：從具有優(yōu)良性狀的動物體上獲取的細(xì)胞去核方法：顯微操作去核法P54：梯度離心法

紫外線短時間照射

化學(xué)物質(zhì)處理激活重構(gòu)胚方法：物理法：電刺激法化學(xué)法：Ca2+載體

乙醇

蛋白酶合成抑制劑等胚胎移植技術(shù)用到了哪些技術(shù)？動物細(xì)胞培養(yǎng)，核移植，早期胚胎培養(yǎng)，胚胎移植早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞工程——動物體細(xì)胞核移植克隆動物動物細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植1.分類：動物胚胎細(xì)胞分化程度低，表現(xiàn)全能性相對容易動物體細(xì)胞分化程度高，表現(xiàn)全能性十分困難∴動物體細(xì)胞核移植難度明顯高于胚胎細(xì)胞核移植動物細(xì)胞工程——動物細(xì)胞核移植技術(shù)在體細(xì)胞核移植中，非人靈長類動物的體細(xì)胞核移植非常困難。主要原因：①供體細(xì)胞的細(xì)胞核在去核卵母細(xì)胞中不能完全恢復(fù)其分化前的功能狀態(tài)，這導(dǎo)致了胚胎發(fā)育率低；②對非人靈長類動物胚胎操作的技術(shù)尚不完善。受體細(xì)胞選材原因：

A.卵母細(xì)胞體積大，易操作（但物質(zhì)運(yùn)輸效率低，∵細(xì)胞體積大，相對表面積?。?。

B.細(xì)胞質(zhì)中存在激活動物細(xì)胞核全能性表達(dá)的因子。在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？為使核移植的胚胎或動物的核遺傳物質(zhì)全部來供體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐?。你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植技術(shù)培育的克隆動物，是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？克隆動物絕大部分DNA來自體細(xì)胞供體（核供體）動物的細(xì)胞核，但其細(xì)胞核外的DNA，即細(xì)胞質(zhì)基因（線粒體中的DNA）來自核供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞，并且生物性狀的表現(xiàn)同時受到基因和環(huán)境的影響。動物體細(xì)胞核移植技術(shù)的原理是什么？動物細(xì)胞核的全能性為什么用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞？培養(yǎng)的動物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至10～50代左右時，部分細(xì)胞核型可能會發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。胚胎工程理論基礎(chǔ)操作對象：生殖細(xì)胞、受精卵或早期胚胎細(xì)胞技術(shù)手段：體外受精、胚胎移植、胚胎分割等理論基礎(chǔ)：哺乳動物體內(nèi)受精和早期胚胎發(fā)育的規(guī)律工程實(shí)質(zhì)：在體外條件下,對動物自然受精和早期胚胎發(fā)育條件進(jìn)行的模擬操作精原細(xì)胞第一階段第二階段第三階段精原細(xì)胞初級精母細(xì)胞初級精母細(xì)胞次級精母細(xì)胞N精細(xì)胞N精細(xì)胞N精子有絲分裂染色體復(fù)制MI分裂

MII分裂變形一、精子的發(fā)生1、場所:睪丸的曲細(xì)精管2、過程：*不同種動物精子的形態(tài)相似，大小略有不同，與動物的體型大小無關(guān)二、卵子的發(fā)生1、場所:卵巢2、過程:豬、羊排卵：排次級卵母細(xì)胞馬、犬排卵：排初級卵母細(xì)胞排出的卵子不是成熟的卵細(xì)胞排卵指卵子從卵泡中排出胚胎工程理論基礎(chǔ)1.概念：指精子和卵子結(jié)合形成合子（即受精卵）的過程。準(zhǔn)備階段受精階段準(zhǔn)備階段1：精子獲能準(zhǔn)備階段2：卵子的準(zhǔn)備細(xì)胞膜的功能：進(jìn)行細(xì)胞間信息交流細(xì)胞膜具有一定的流動性2.場所：輸卵管

3.過程：三.受精作用準(zhǔn)備階段1：精子獲能剛剛排出的精子不能立即與卵子受精，必須在雌性動物生殖道發(fā)生相應(yīng)的生理變化后，才能獲得受精能力，這一生理現(xiàn)象稱為精子獲能”。*獲能液的成分因動物種類不同而有所差異；*獲能液常見有效成分有肝素、Ca2+載體等；直接利用雌性動物生殖道使精子獲能；將精子培養(yǎng)在人工配制的獲能液中使其獲能；準(zhǔn)備階段2：卵子的準(zhǔn)備(1)卵子一般在排出2-3h后才能被精子穿入。(2)動物排出的卵子成熟程度不同：

有的可能是初級卵母細(xì)胞，如馬、犬等

有的可能是次級卵母細(xì)胞，如豬、羊等(3)卵子成熟的場所：排出的卵子都要在輸卵管內(nèi)進(jìn)一步成熟。(4)卵子具備與精子受精能力的時期：MⅡ期胚胎工程理論基礎(chǔ)

精子穿越透明帶

精子接觸卵細(xì)胞膜透明帶反應(yīng)透明帶發(fā)生的阻止精子進(jìn)入的生理反應(yīng)

精子進(jìn)入卵細(xì)胞卵細(xì)胞膜反應(yīng)卵細(xì)胞膜發(fā)生的阻止精子進(jìn)入的生理反應(yīng)防止多精入卵雄原核第一極體雌原核第二極體精子釋放多種酶溶解膜外結(jié)構(gòu)

雌、雌原核形成

雌、雄原核靠近

核膜消失卵裂開始雄原核精子脫尾，核膜重構(gòu)雌原核卵子完成減數(shù)分裂釋放第二極體∨雄原核第一極體雌原核第二極體是否受精的標(biāo)志：觀察到兩個極體或者雌雄原核受精完成的標(biāo)志：雌雄原核形成合子受精階段開始│

卵裂期

││

孵化

四.胚胎發(fā)育胚胎工程理論基礎(chǔ)胚胎早期發(fā)育——卵裂（1）場所：透明帶內(nèi)（2）分裂方式：有絲分裂（3）特點(diǎn)：細(xì)胞數(shù)量不斷增加，胚胎總體積并不增加，每個細(xì)胞體積不斷減小DNA總數(shù)目不斷增加,每個細(xì)胞的核DNA數(shù)目不變有機(jī)物總量減少，有機(jī)物種類增加卵裂期受精卵2細(xì)胞胚4細(xì)胞胚8細(xì)胞胚桑葚胚囊胚原腸胚（1）結(jié)構(gòu)內(nèi)細(xì)胞團(tuán):將來發(fā)育成胎兒的各種組織

*內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞具有全能性

：滋養(yǎng)層：沿透明帶內(nèi)壁擴(kuò)展和排列，將來發(fā)育成胎膜和胎盤囊胚腔胚胎早期發(fā)育——囊胚(2)特點(diǎn)：細(xì)胞開始出現(xiàn)分化(3)孵化：囊胚進(jìn)一步擴(kuò)大,導(dǎo)致透明帶破裂,胚胎從透明帶中伸展出來胚胎早期發(fā)育——原腸胚囊胚孵化后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)表層的細(xì)胞形成外胚層，下方的細(xì)胞形成內(nèi)胚層，出現(xiàn)由內(nèi)胚層包圍的空腔叫做原腸腔。由原腸胚的三個胚層進(jìn)一步發(fā)育為不同的組織、器官、系統(tǒng)胚胎工程理論基礎(chǔ)胚胎工程技術(shù)及其應(yīng)用受體母牛(代孕)受精卵早期胚胎試管牛體外受精早期胚胎發(fā)育精子卵子胚胎移植通過人工操作使卵子在體外受精,經(jīng)培養(yǎng)發(fā)育為早期胚胎后,再進(jìn)行移植產(chǎn)生的個體。試管動物:

無性生殖核移植體外受精克隆牛重組細(xì)胞受精卵早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植試管牛有性生殖比較項(xiàng)目試管動物(嬰兒)克隆動物技術(shù)基礎(chǔ)體外受精,胚胎早期培養(yǎng)胚胎移植動物細(xì)胞培養(yǎng),動物體細(xì)胞核移植胚胎移植生殖類型有性生殖無性生殖后代性狀繼承特點(diǎn)繼承雙親的的特性與核供體親本基本一樣是否遵循孟德爾遺傳定律是否胚胎工程技術(shù)及其應(yīng)用受體母牛(代孕)受精卵早期胚胎試管牛體外受精早期胚胎發(fā)育精子卵子胚胎移植1.卵母細(xì)胞的采集和培養(yǎng)2.精子的采集和獲能3.受精一、體外受精體外受精的原理:人工模擬體內(nèi)環(huán)境(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，使卵母細(xì)胞成熟、精子獲能，最終完成受精和胚胎保存。采集方法采集過程培養(yǎng)超數(shù)排卵技術(shù)利用促性腺激素促使雌性動物排出更多的卵子，從輸卵管中沖取卵子?？芍苯优c獲能的精子在體外受精。卵巢采卵/卵巢中卵母細(xì)胞為初級卵母細(xì)胞，需體外培養(yǎng)至MII中期，才能進(jìn)行體外受精。超數(shù)排卵處理中為什么使用促性腺激素而不是性激素？性激素由性腺產(chǎn)生并釋放，長期使用外源性激素會導(dǎo)致性腺萎縮。促性腺激素由垂體產(chǎn)生并釋放，作用于性腺，可以促進(jìn)排卵，并且不會使性腺萎縮。胚胎工程技術(shù)及其應(yīng)用受體母牛(代孕)受精卵早期胚胎試管牛體外受精早期胚胎發(fā)育精子卵子胚胎移植1.卵母細(xì)胞的采集和培養(yǎng)2.精子的采集和獲能3.受精一、體外受精體外受精的原理:人工模擬體內(nèi)環(huán)境(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，使卵母細(xì)胞成熟、精子獲能，最終完成受精和胚胎保存。精子獲能前要離心處理(1)直接利用雌性動物的生殖道使精子獲能；(2)將精子培養(yǎng)在人工配制的獲能液中使其獲能，獲能液的成分因動物種類不同而有所差異，常見的有效成分有肝素、Ca2＋載體等。精子獲能方法精液由精子和精清兩部分組成。精清中含有一種能抑制精子獲能的物質(zhì)，因此在一般情況下，精液中的精子無法獲能。精子獲能處理前進(jìn)行離心處理，目的是除去精清以利于精子獲能。胚胎工程技術(shù)及其應(yīng)用受體母牛(代孕)受精卵早期胚胎試管牛體外受精早期胚胎發(fā)育精子卵子胚胎移植1.卵母細(xì)胞的采集和培養(yǎng)2.精子的采集和獲能3.受精一、體外受精體外受精的原理:人工模擬體內(nèi)環(huán)境(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，使卵母細(xì)胞成熟、精子獲能，最終完成受精和胚胎保存。（早期胚胎培養(yǎng)：以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育能力）獲能液或?qū)Ｓ玫氖芫芤阂饬x：提高動物繁殖能力的有效措施；還可以為胚胎移植提供可用的胚胎。胚胎工程技術(shù)及其應(yīng)用受體母牛(代孕)受精卵早期胚胎試管牛體外受精早期胚胎發(fā)育精子卵子胚胎移植

是指將體外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的雌性動物的體內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。體內(nèi)受精、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、動物細(xì)胞核移植技術(shù)、胚胎分割等（不一定是有性生殖）1.胚胎來源：體外受精及其他方式得到的胚胎2.實(shí)質(zhì)：早期胚胎在相同生理環(huán)境條件下空間位置的轉(zhuǎn)移,而胚胎本身的遺傳物質(zhì)并不發(fā)生改變，因此能保持其原來的遺傳特性。3.地位：胚胎工程的最終技術(shù)環(huán)節(jié)。二、胚胎移植：4.供體和受體供體：提供胚胎的個體選擇標(biāo)準(zhǔn)：遺傳性狀優(yōu)良，生產(chǎn)能力強(qiáng)職能：產(chǎn)生具有優(yōu)良遺傳特性的胚胎受體：接受胚胎的個體選擇標(biāo)準(zhǔn)：有健康體質(zhì)和正常繁殖能力；同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動物，沒有生殖隔離、生存環(huán)境相同職能：承擔(dān)繁重而漫長的妊娠和育仔任務(wù)地位：獲得的胚胎都必須移植給受體才能獲得后代。胚胎工程技術(shù)及其應(yīng)用受體母牛(代孕)受精卵早期胚胎試管牛體外受精早期胚胎發(fā)育精子卵子胚胎移植

是指將體外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的雌性動物的體內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。二、胚胎移植：

胚胎移植主要包括供體、受體的選擇和處理，配種或人工授精，胚胎的檢查、收集、培養(yǎng)和保存，胚胎的移植，以及移植后的檢查等步驟。5.過程：遺傳性狀優(yōu)良、生產(chǎn)能力強(qiáng)供體母牛健康的體質(zhì)、正常的繁殖能力受體母牛多種激素同期發(fā)情處理促性腺激素超數(shù)排卵供體公牛發(fā)情配種或人工授精收集胚胎并檢查胚胎移植妊娠檢查分娩（胚胎移植犢牛）(1)該過程中兩次使用激素：第一次:對受、供體進(jìn)行同期發(fā)情處理；第二次:用于供體的超數(shù)排卵。(2)該過程中的兩次檢查：第一次:對收集的胚胎進(jìn)行檢查；第二次:對受體母牛是否妊娠進(jìn)行檢查(3)胚胎移植成功與否要有兩個條件：①胚胎移植一般應(yīng)在同種的雌性供體和受體之間進(jìn)行。②進(jìn)行胚胎移植的供體和受體的生理狀態(tài)要相同。胚胎工程技術(shù)及其應(yīng)用受體母牛(代孕)受精卵早期胚胎試管牛體外受精早期胚胎發(fā)育精子卵子胚胎移植6.意義：①可以充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁殖潛力，大大縮短了供體本身的繁殖周期。對供體施行超數(shù)排卵處理后，可獲得多枚胚胎，經(jīng)移植可得到多個后代，使供體生產(chǎn)下的后代數(shù)量是自然繁殖的十幾倍到幾十倍。②胚胎移植作為胚胎工程的最終技術(shù)環(huán)節(jié)，還將推動胚胎工程其他技術(shù)的研究和應(yīng)用。

是指將體外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的雌性動物的體內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。二、胚胎移植：7.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)(1)受體會不會對來自供體的胚胎發(fā)生免疫排斥反應(yīng)?受體子宮對外來胚胎基本上不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)(2)胚胎移植后，經(jīng)受體孕育的后代，其遺傳特性與供體還是受體保持一致?為什么?胚胎移植后，經(jīng)受體孕育的后代的遺傳特性與供體保持一致，供體胚胎與受體子宮建立的僅是生理和組織上的聯(lián)系，其遺傳物質(zhì)在孕育過程中不發(fā)生任何變化項(xiàng)目自然受精人工授精體外受精不同點(diǎn)過程不同雌雄動物交配完成用人工的方法將公畜的精液注入母畜生殖道內(nèi)，完成受精人工獲取精子、卵子，在體外培養(yǎng)液中完成受精過程場所不同雌性動物輸卵管中雌性動物輸卵管中體外培養(yǎng)液中相同點(diǎn)

(1)精子獲能、卵子成熟后方能完成受精過程;

(2)都是有性生殖

比較自然受精、人工授精和體外受精動物種類受精卵發(fā)育的時間/h進(jìn)入子宮時受精卵的發(fā)育天數(shù)和發(fā)育階段/胚胎移植可選擇的發(fā)育階段2細(xì)胞4細(xì)胞8細(xì)胞16細(xì)胞桑裝胚天發(fā)育階段小鼠24~3838?5050?6060?7068?803桑葚胚綿羊36~38424867?72963~416細(xì)胞豬21?5151-6666~7290-110110-1142~2.54~6細(xì)胞馬2430?3650?607298-1066囊胚牛27~4244?6546?9096-120120-1444?58~16細(xì)胞不同種類生物胚胎移植時選擇的胚胎發(fā)育階段不同胚胎工程技術(shù)及其應(yīng)用三、胚胎分割1.概念：采用機(jī)械方法將早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，經(jīng)移植獲得同卵雙胎或多胎的技術(shù)。2.特點(diǎn)：后代具有相同的遺傳物質(zhì)∴胚胎分割可以看做動物無性繁殖或克隆的方法之一。3.理論基礎(chǔ)：動物胚胎細(xì)胞的全能性。4.物質(zhì)基礎(chǔ)：每個細(xì)胞核內(nèi)具有相同的遺傳物質(zhì)5.選擇的胚胎：發(fā)育良好的，形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚。6.注意事項(xiàng)：分割囊胚時，要將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割（若分割不均，會出現(xiàn)含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多的部分正常發(fā)育的能力強(qiáng)，少的部分發(fā)育受阻或發(fā)育不良，甚至不能發(fā)育等問題。）

（不同發(fā)育階段的胚胎，具體操作不完全相同）

為什么胚胎分割的份數(shù)越多，操作的難度會越大，移植的成功率也越低？早期胚胎的體積很小，只有在顯微鏡下才能看到；再者，細(xì)胞數(shù)目是有限的。分割的份數(shù)越多，不但難以做到均等分割，每一份的細(xì)胞數(shù)會越少，而且作為囊胚期的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞所受的影響會更大。因此，分割的份數(shù)越多，技術(shù)的難度會越大，移植后的恢復(fù)和發(fā)育的難度會越大，移植成功率自然會降低。7.應(yīng)用：可以促進(jìn)優(yōu)良動物品種的繁殖；在胚胎移植前，進(jìn)行性別鑒定、遺傳病篩查等，對于人工控制動物性別、動物繁育健康后代有重要意義取滋養(yǎng)層細(xì)胞:做DNA分析，鑒定性別→還可采用細(xì)胞水平鑒定方法:分析胚胎細(xì)胞染色體組成基因工程：又叫

重組DNA技術(shù)/轉(zhuǎn)基因技術(shù)1.操作環(huán)境：體外環(huán)境2.原理：基因重組3.操作對象：基因4.操作水平：DNA分子水平5.結(jié)果：賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品

（賦予新形狀的轉(zhuǎn)基因生物與原生物仍為同一物種）6.意義：定向改造生物性狀；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙不同生物的DNA分子能夠拼接在一起，原因是？(1)基因的基本組成單位、空間結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對方式相同(2)具有相同的黏性末端為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？

生物界共同一套遺傳密碼同一種基因在不同生物體內(nèi)表達(dá)出來的蛋白質(zhì)相同，因?yàn)?？生物界共同一套遺傳密碼工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶載體工具是三種，工具酶是兩種基因工程——工具1.來源：從微生物（主要是原核生物）體內(nèi)分離出來2.功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。3.切割部位：“切割”的是磷酸二酯鍵4.切割結(jié)果：切口有兩種：黏性末端和平末端一、限制酶（大部分限制酶切割結(jié)果為黏性末端）EcoRⅠ識別的序列切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶載體工具是三種，工具酶是兩種基因工程——工具1.來源：從微生物（主要是原核生物）體內(nèi)分離出來2.功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。3.切割部位：“切割”的是磷酸二酯鍵4.切割結(jié)果：切口有兩種：黏性末端和平末端一、限制酶大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量（如奇數(shù)）的核苷酸組成①無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，這就是回文序列。②能被限制酶特異性識別的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶載體工具是三種，工具酶是兩種基因工程——工具一、限制酶（1）不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同（2）判斷兩個末端是否為同一種限制酶切割產(chǎn)生的方法：將其中一個末端旋轉(zhuǎn)180度，若與另一個完全相同，則說明兩個末端是用同一種限制酶切割（3）同一個DNA分子用不同限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配對連接成鏈）（4）不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互補(bǔ)則可以相互重新配對連接（5）兩種同尾酶切割的DNA片段連接后，原來的酶切位點(diǎn)將不存在，不能再被原來的限制酶識別（6）一個限制酶切割一次，斷2個磷酸二酯鍵，形成2個黏性末端，產(chǎn)生2個游離的磷酸基團(tuán)→將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切2處，斷4個磷酸二酯鍵同時產(chǎn)生4個黏性末端，產(chǎn)生4個游離的磷酸基團(tuán)【思考】用限制酶切割時需注意的事項(xiàng)1.獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是為了產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接（目的基因與啟動子相接的一端為轉(zhuǎn)錄的開始端，如果反向連接，與正向連接相比，轉(zhuǎn)錄得到的mRNA序列會不同）。為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體。2.選擇限制酶切割位點(diǎn)的基本原則：

①切割目的基因時：能切下目的基因且不破壞目的基因。②切割質(zhì)粒時：至少保留一個完整的標(biāo)記基因，便于篩選限制酶存在于原核生物中的作用是什么?原核生物容易受到外源DNA入侵，限制酶可以切割外源DNA,使之失效，保證自身的安全限制酶為什么不會剪切原核生物本身的DNA?DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者DNA分子被修飾（甲基化），使限制酶不能將其切開工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶載體工具是三種，工具酶是兩種基因工程——工具二、DNA連接酶(1)作用:將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。(2)分類種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體功能特性只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對較低）相同點(diǎn)恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶載體工具是三種，工具酶是兩種基因工程——工具三、載體1.作用:①將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去

②利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制2.作為運(yùn)載體需具備的條件:①能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定保存

②有1個至多個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

③具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選

④對受體細(xì)胞無害等．3.種類：質(zhì)粒（常用），噬菌體，動植物病毒4.λ噬菌體的衍生物或某些動植物病毒作為運(yùn)載體利用的原理是利用病毒對宿主細(xì)胞的侵染性。病毒對宿主細(xì)胞的侵染具有一定的物種（組織）特異性?！纠咳粲眉倚Q作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用噬菌體作為載體，其原因是噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶。霍亂弧菌中含有質(zhì)粒，但不能（填“能”、“不能”）用來做載體，因?yàn)檫x擇的載體應(yīng)該對受體細(xì)胞無害。作用底物作用部位形成產(chǎn)物限制酶DNA分子磷酸二酯鍵黏性末端或平末端DNA連接酶DNA片段磷酸二酯鍵重組DNA分子DNA聚合酶脫氧核苷酸磷酸二酯鍵子代DNA解旋酶DNA分子堿基對間的氫鍵形成脫氧核苷酸單鏈DNA(水解)酶DNA分子磷酸二酯鍵游離的脫氧核苷酸基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取

1.目的基因：主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，還可以是一些具有調(diào)控作用的因子2.獲取方法：PCR技術(shù)一、目的基因的篩選與獲取

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）

三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

四、目的基因的檢測和鑒定

全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理：DNA半保留復(fù)制

操作環(huán)境：體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）目的：對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制

優(yōu)點(diǎn)：可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸(dNTP)合成DNA子鏈的原料耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）催化合成DNA子鏈引物（2種）使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶（1）PCR反應(yīng)過程變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈（2）引物的要求：①引物自身不能環(huán)化②兩種引物之間不能互補(bǔ)配對③引物長度不宜過短，防止引物隨機(jī)結(jié)合（3）用PCR不可以擴(kuò)增mRNA，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。②在細(xì)胞質(zhì)中將mRNA分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶③合成第二條DNA鏈外顯子內(nèi)含子外顯子外顯子內(nèi)含子真核細(xì)胞的基因①在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA②在核內(nèi)內(nèi)含子被切去，外顯子彼此連接③在細(xì)胞質(zhì)中將mRNA分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶④合成第二條DNA鏈原核細(xì)胞的基因①在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)單鏈DNA單鏈DNA成熟mRNA成熟mRNAcDNAcDNAPCR進(jìn)行到第三輪才出現(xiàn)想要的目的基因循環(huán)n輪，目的基因個數(shù)為2n-2n只含有其中一種引物循環(huán)n輪，需要的引物數(shù)為2n+1-2PCR技術(shù)的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列（用于引物合成）基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

四、目的基因的檢測和鑒定目的基因：插入到啟動子與終止子之間的部位啟動子：位于基因的上游,RNA聚合酶識別和結(jié)合位點(diǎn)，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。終止子：位于基因的下游,終止目的基因轉(zhuǎn)錄的脫氧核苷酸序列。標(biāo)記基因：檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等1.轉(zhuǎn)化：指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；

同時使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）

基因工程的基本操作程序1.轉(zhuǎn)化：指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。當(dāng)植物體受到損傷時，傷口處的細(xì)胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，這時農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞染色體的DNA上。Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體(即重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入(侵染)植物細(xì)胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA中表達(dá)新性狀受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法:大多數(shù)雙子葉和裸子植物該過程經(jīng)過兩次拼接、兩次導(dǎo)入(1)第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上(2)第二次拼接插入目的基因的T-DNA（不是Ti質(zhì)粒）拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上（非人工操作）(3)