SN-T4547-2017商品化試劑盒檢測方法大腸菌群和大腸桿菌方法一

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準代替SN/T1896—2007商品化試劑盒檢測方法大腸菌群和大腸桿菌方法一2017-05-12發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局ISN/T4547—2017本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準代替SN/T1896—2007《食品中大腸菌群和大腸桿菌快速計數(shù)法Petrifilm1M測試片法》。與SN/T1896—2007相比，除編輯性修改外主要技術(shù)變化如下：——修改了標準的中英文名稱；——修改了附錄A;——增加了計算公式；——刪除了第二法PetrifilmTM測試片MPN法。本標準由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標準起草單位：中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局、中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、大連啟元科技發(fā)展有限公司。本標準起草人：劉淑艷、顏懷玉、王剛、丁健、尹琪、蔣丹、孫曉飛、周振亞。本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為：1商品化試劑盒檢測方法大腸菌群和大腸桿菌方法一1范圍本標準規(guī)定了食品中大腸桿菌/大腸菌群檢驗測試片(Petrifilm'ME.coli/ColiformCountPlate)的檢測方法。本標準適用于食品和原料中大腸菌群和大腸桿菌的計數(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求3生物安全措施為了保護實驗室人員的安全和防止污染，應(yīng)由具備資格的工作人員檢測。所有培養(yǎng)物和廢棄物的處理應(yīng)按照GB19489有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。4技術(shù)概要大腸桿菌/大腸菌群檢驗測試片法是用一種預(yù)先制備的含有指示劑及冷水可溶性凝膠的培養(yǎng)基系統(tǒng)進行微生物培養(yǎng)的方法。大腸桿菌/大腸菌群測試片含有VRB(VioletRedBile)培養(yǎng)基和β-葡萄糖苷酸酶指示劑，大腸桿菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酸酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng)，顯示為藍色并帶有氣泡的特征菌落；大腸菌群細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，與pH指示劑反應(yīng)顯示為紅色并帶有氣泡的特征菌落。5設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：5.2電子天平：感量0.1g。5.3均質(zhì)器(旋刀式或拍擊式)或等效的設(shè)備。5.4pH計或精密pH試紙。5.5測試片壓板。5.6放大鏡或/和菌落計數(shù)器。6培養(yǎng)基和試劑6.1無菌生理鹽水：見附錄A的A.1。26.2磷酸鹽緩沖液：見附錄A的A.2。6.5大腸桿菌/大腸菌群測試片。本標準使用的試劑盒由美國3M有限公司生產(chǎn)，參考SN/T2775-2011和SN/T3266—2012,由國家認監(jiān)委商品化食品檢測試劑盒評價專家委員會組織評價。具體評價結(jié)果參見附錄B。測試片儲存于2℃~8℃,有效期18個月。檢測程序見圖1。檢樣檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液10倍梯度稀釋選取2個～3個適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液，各取1mL分別加入大腸桿菌/大腸菌群測試片計數(shù)藍色帶氣泡和紅色帶氣泡的菌落報告大腸桿菌數(shù)報告大腸菌群數(shù)計數(shù)藍色帶氣泡的菌落圖1大腸菌群和大腸桿菌測試片計數(shù)法檢測程序8操作步驟8.1樣品制備8.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min,制成1:10的樣品勻液。8.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。樣品勻液的pH值應(yīng)為6.5～7.5,pH值過低或過高時可分別采用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)或1mol/LHCl予以調(diào)節(jié)。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15min,或2℃~5℃不超過18h解凍。8.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管，使其混合均勻，制成3SN/T4547—20171:100的樣品勻液。8.1.4按8.1.3操作程序，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。8.2樣品勻液的接種和培養(yǎng)根據(jù)對樣品的污染狀況的估計及相關(guān)限量要求，選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種2張測試片。同時，分別吸取1mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水加入兩張測試片內(nèi)作為空白對照。8.3接種將大腸桿菌/大腸菌群測試片置于平坦實驗臺面，揭開上層膜，用吸管吸取1mL樣品勻液垂直滴加在測試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下，把壓板(平面底朝下)放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上。拿起壓板，靜置至少1min以使培養(yǎng)將測試片的透明面朝上，水平置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過20片，培養(yǎng)溫度為36℃±1℃。大腸菌群檢測時培養(yǎng)時間為24h±2h;大腸桿菌檢測時，如果是肉、家禽或水產(chǎn)品培養(yǎng)時間為24h±2h,9結(jié)果計算與報告9.1.1可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的大腸菌群或大腸桿菌菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。9.1.2在大腸桿菌/大腸菌群測試片上，藍色有氣泡的菌落確認為大腸桿菌。藍色有氣泡和紅色有氣泡的菌落數(shù)之和為大腸菌群數(shù)。測試片圓形面積邊緣上及邊緣以外的菌落不做計數(shù)。出現(xiàn)大量氣泡形9.2菌落計數(shù)與報告9.2.1選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的測試片計數(shù)大腸菌群或大腸桿菌菌落總數(shù)。低于15CFU的測試片記錄具體菌落數(shù)，大于150CFU的記錄為多不可計。每個稀釋度的大腸菌群或大腸桿菌菌落數(shù)應(yīng)采用兩個測試片的平均數(shù)。9.2.2若只有一個稀釋度的測試片的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個測試片大腸菌群或大腸桿菌菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克(或每毫升)樣品中大腸菌群或大腸桿菌菌落總數(shù)結(jié)果。9.2.3若有兩個連續(xù)稀釋度的測試片菌落數(shù)在適宜N——樣品中大腸菌群/大腸桿菌總數(shù)；Za——測試片(含適宜范圍菌落數(shù)的測試片)大腸菌群或大腸桿菌菌落數(shù)之和；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))測試片個數(shù)；4n?-—第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))測試片個數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。9.2.4若所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)都小于15CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。9.2.5若所有稀釋度(包括液體樣品原液)的測試片上均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。9.2.6若所有稀釋度的測試片菌落數(shù)均不在15CFU～150CFU之間，其中一部分小于15CFU或大于150CFU時，則以最接近15CFU或150CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。計數(shù)菌落數(shù)大于150CFU的測試片時，可計數(shù)一個或兩個具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以20即為測試片上估算的菌落數(shù)(圓形生長面積為20cm2)。2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。9.3.4稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。5(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑A.1無菌生理鹽水A.1.1成分氯化鈉蒸餾水稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。A.2磷酸鹽緩沖液A.2.1成分蒸餾水500mLpH7.2A.2.2制法貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱中。稀釋液：取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至100mL,分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。NaOH蒸餾水A.3.2制法稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。A.4.1成分蒸餾水6A.4.2制法移取濃鹽酸90mL,用蒸餾水稀釋至1000mL,121℃高壓滅菌15min。7SN/T4547—2017食品種類食品基質(zhì)檢測項目log值范圍T檢驗值參考方法*測試片法肉制品豬肉餡大腸菌群1.00～2.041.00～2.230.096大腸桿菌1.00～1.38<1.000.816牛肉餡大腸菌群1.58～2.822.08～2.890.546大腸桿菌1.00～1.340.816家禽類雞心大腸菌群2.72～3.112.51～3.000.659大腸桿菌2.46～2.702.26～2.620.590烤鴨大腸菌群1.00～3.461.00～3.320.033大腸桿菌<1.00<1.00結(jié)果一致魚與海產(chǎn)制品多春魚大腸菌群<1.00<1.00結(jié)果一致大腸桿菌<1.00<1.00結(jié)果一致墨斗魚大腸菌群1.00～1.401.00～1.150.478大腸桿菌<1.00<1.00結(jié)果一致乳制品酸奶大腸菌群<1.00<1.00結(jié)果一致大腸桿菌<1.00<1.00結(jié)果一致酪乳粉大腸菌群<1.00<1.00結(jié)果一致大腸桿菌<1.00<1.00結(jié)果一致雜品花椒大腸菌群2.63～3.652.00～3.610.665大腸桿菌1.00～2.231.00～2.280.023小米面大腸菌群3.15～3.523.38～3.74大腸桿菌<1.00<1.00結(jié)果一致·大腸菌群參考方法為GB4789.3—2010的第二法，大腸桿菌參考方法為GB4789.38—2012的第二法。表B.2給出了5種食品線性方程和相關(guān)系數(shù)。1)本評價結(jié)果僅適用于3M公司生產(chǎn)的3MPetrifilm1“大腸桿菌/大腸菌群檢驗測試片(3MPetrifilmMAerobicCountPlate)。8表B.25種食品線性方程和相關(guān)系數(shù)食品種類(代表基體)類別log值范圍線性方程相關(guān)系數(shù)(R2)雜品(麥片)大腸菌群y=0.9121x+0.29780.9775大腸桿菌y=0.7873x+0.29850.8042乳制品(奶粉)大腸菌群y=0.9879x-0.03680.9210大腸桿菌y=0.8715x+0.740.7400魚類和海產(chǎn)品(多春魚)大腸菌群y=0.8676x+0.40190.9571大腸桿菌y=1.0949x-0.12930.9329家禽類(雞肉)大腸菌群y=1.0073x-0.01960.9719大腸桿菌y==0.9959x+0.12060.9543肉制品(火腿)大腸菌群y=1.0635x-0.26790.9912大腸桿菌y=0.952x+0.34010.9123所有食品大腸菌群y=0.969x+0.07050.9525大腸桿菌y=0.9421x+0.32840.8209y——測試片法菌落數(shù)的對數(shù)值；x——參考法菌落數(shù)的對數(shù)值。B.2耐變性選用兩個污染水平的大腸埃希氏菌(ATCC-25922)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種(CGMCC1.1736)和阪崎腸桿菌(ATCC29544),分別進行培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間兩個變量的耐變性實驗，經(jīng)驗證培養(yǎng)溫度選擇35℃和37℃,培養(yǎng)時間選擇18h和24h條件下對檢測結(jié)果的標準偏差與在重復(fù)性條件下得到的標準偏差沒有明顯差別，表明說明書中對培養(yǎng)溫度36℃±1℃和培養(yǎng)時間24h±2h。統(tǒng)計分析結(jié)果見表B.3耐變性統(tǒng)計分析結(jié)果實驗條件菌株添加水平測試結(jié)果平均值標準偏差肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種大腸桿菌阪崎腸桿菌21212高濃度低濃度高濃度低