重組DNA技術(shù)的工具 高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

一、概念檢測(cè)1.DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是

A.能連接DNA分子雙鏈堿基對(duì)之間的氫鍵

B.能將單個(gè)脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵

C.能連接用同種限制酶切開(kāi)的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵

D.只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端2.在重組DNA技術(shù)中，將外源基因送入受體細(xì)胞的載體可以是

A.大腸桿菌的質(zhì)粒

B.切割DNA分子的酶

C.DNA片段的黏性末端

D.用來(lái)識(shí)別特定基因的DNA探針CA課本P74練習(xí)與應(yīng)用二、拓展應(yīng)用1.想一想，為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子?細(xì)菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因?yàn)楹心撤N限制酶的細(xì)胞的DNA分子不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶，也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA入侵。課本P74練習(xí)與應(yīng)用2.有2個(gè)不同來(lái)源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI進(jìn)行切割。各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下。（1）哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeI切割A(yù)片段產(chǎn)生的DNA片段相連接?為什么?XbaⅠ。因?yàn)閄baI與SpeI切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。課本P75練習(xí)與應(yīng)用2.有2個(gè)不同來(lái)源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI進(jìn)行切割。各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下。（1）哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeI切割A(yù)片段產(chǎn)生的DNA片段相連接?為什么?XbaⅠ。因?yàn)閄baI與SpeI切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。（2）不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義?識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶使構(gòu)建載體時(shí)，切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制酶的識(shí)別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時(shí)，目的基因就很可能被切斷；這時(shí)可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的識(shí)別序列）來(lái)獲取目的基因。限制酶DNA連接酶載體①對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害；②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；③有特殊的標(biāo)記基因；④能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來(lái)源：主要來(lái)源于原核生物特點(diǎn)：作用部位：具有專一性作用結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來(lái)

小結(jié)：基因工程的基本工具

實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理1．提取DNA的原理2．鑒定DNA的原理DNA+二苯胺

藍(lán)色沸水浴二苯胺有毒，現(xiàn)配現(xiàn)用并用棕色瓶存放。利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異。如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。(2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定二、材料用具①材料：新鮮洋蔥（也可以選擇香蕉、菠菜、菜花或豬肝等作為實(shí)驗(yàn)材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。②用具：燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、石棉網(wǎng)、三腳架、火柴、刀片和天平等。作用：析出DNA作用：溶解DNA作用：鑒定DNA作用：破壞細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定三、實(shí)驗(yàn)步驟選材、研磨去除雜質(zhì)DNA的析出DNA的鑒定稱取花菜，切碎，放入研缽，倒入研磨液，充分研磨。在漏斗中墊上紗布過(guò)濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取上清液；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取上清液。在上清液中加入體積相等的預(yù)冷的酒精（95%）溶液,靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。在溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。空白對(duì)照：在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。目的：排除試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。思考·討論（1）用洋蔥做材料，為什么要充分研磨？（2）如果用動(dòng)物細(xì)胞做材料，也需要研磨裂解釋放細(xì)胞中的DNA嗎？（3）豬血和雞血，哪個(gè)適合用作提取DNA的材料？操作時(shí)如何防止血液凝固？雞血；豬血（哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞）無(wú)細(xì)胞核因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA，不適合。雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。充分研磨，可以破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，釋放DNA。加入清水，使細(xì)胞吸水膨脹，裂解釋放DNA。思考·討論（4）在4℃冰箱低溫放置幾分鐘的作用？（5）預(yù)冷的酒精的的作用？（6）如何評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果？抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解。①可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；②抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。---看提取物顏色---看與二苯胺反應(yīng)顏色的深淺DNA純度

DNA的量→純的DNA為白色絲狀