人體益生菌丁酸菌群檢測(cè)方法的開發(fā)

摘要人體腸道微生物對(duì)于人體有著不可或缺的重要意義，而現(xiàn)今主要的檢測(cè)手段有下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）、傳統(tǒng)培養(yǎng)法、熒光原位雜交（FISH）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，但這些研究方法有著操作繁瑣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、精度低、成本高、專業(yè)化程度高等缺點(diǎn)。我們本次研究準(zhǔn)備開發(fā)一種TaqManqPCR方法，該方法有著較高的精確度和靈敏度，可以為丁酸產(chǎn)生菌群的研究提供更可靠的數(shù)據(jù)。我們本次研究檢測(cè)的菌種是產(chǎn)丁酸菌群，為了設(shè)計(jì)出更準(zhǔn)確，特異性更高的引物探針，通過(guò)NCBI的基因數(shù)據(jù)庫(kù)得到產(chǎn)丁酸菌群的16srRNA，通過(guò)IntegratedDNATechnology中的RT-qPCR引物探針設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的上、下游引物和探針組合。由于需要保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確，因此樣本為人體糞便樣本，采用QIAampPowerFecalProDNA的樣本試劑盒。采用糞便微生物DNA提取試劑盒提取微生物基因組全DNA，先用準(zhǔn)備好的引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增檢測(cè)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，再采用qPCR檢測(cè)驗(yàn)證是否符合實(shí)驗(yàn)要求。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)出產(chǎn)丁酸菌群16SrRNA的引物探針組合，檢測(cè)時(shí)間快速，通常在2個(gè)小時(shí)內(nèi)就可完成；而且其操作簡(jiǎn)單，不需要二代測(cè)序文庫(kù)的復(fù)雜構(gòu)建，僅僅需要可靠的測(cè)試人員和檢測(cè)結(jié)果，適用于各個(gè)領(lǐng)域的廣泛微生物檢測(cè)。關(guān)鍵詞:實(shí)時(shí)熒光定量PCR；產(chǎn)丁酸菌群；腸道微生物；引物探針

AbstractHumangutmicroorganismsareofindispensableimportancetothehumanbody,andthemaindetectionmethodstodayincludenext-generationsequencingtechnology(NGS),traditionalculturemethods,fluorescenceinsituhybridization(FISH)andreal-timePCR,buttheseresearchmethodshavethedisadvantagesofcumbersomeoperation,longduration,lowprecision,highcostandhighdegreeofspecialization.Inthisstudy,weintendtodevelopaTaqManqPCRmethodwithhighaccuracyandsensitivity,whichcanprovidemorereliabledataforthestudyofbutyricacidproducingflora.Inordertodesignmoreaccurateandmorespecificprimerprobes,the16srRNAofbutyricacidflorawasobtainedthroughthegeneticdatabaseofNCBI,andthecorrespondingupstreamanddownstreamprimerandprobecombinationsweredesignedthroughtheRT-qPCRprimerprobedesigntoolinIntegratedDNATechnology.Duetotheneedtoensureaccuratetestresults,thesamplewasahumanstoolsampleusingtheQIAampPowerFecalProDNAsamplekit.ThewholeDNAofthemicrobialgenomewasextractedbyfecalmicrobialDNAextractionkit,andthepreparedprimerswerefirstusedforordinaryPCRamplificationdetection,andafterverificationbyagarosegelelectrophoresis,thenqPCRdetectionwasusedtoverifywhetheritmettheexperimentalrequirements.Inthisexperiment,theprimerprobecombinationofbutyricacidflora16SrRNAwasdesigned,andthedetectiontimewasfast,usuallycompletedwithin2hours.Moreover,itissimpletooperate,doesnotrequirethecomplexconstructionofnext-generationsequencinglibraries,requiresreliabletestersandtestresults,andissuitableforawiderangeofmicrobialtestsinvariousfields.Keywords:Real-timePCR;Butyricacid-producingflora;gutmicrobes;Primerprobes目錄引言 1第一章 文獻(xiàn)綜述 21.1立題背景 21.2腸道菌群 21.3厚壁菌門簡(jiǎn)介 31.4厚壁桿菌與人類健康的關(guān)系 41.4.1肥胖與厚壁桿菌的關(guān)系 41.4.2膳食纖維的調(diào)節(jié)作用 41.4.3防治非酒精性脂肪肝(NAFLD) 51.5核酸檢測(cè)技術(shù) 51.5.1qPCR技術(shù) 51.5.2RT-qPCR技術(shù) 61.6研究意義 7第二章 厚壁菌門實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法 82.1實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及試劑 82.1.1儀器設(shè)備 82.1.2主要試劑 82.2方法 82.2.1引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 82.2.2糞便DNA的提取 112.2.3反應(yīng)體系優(yōu)化 132.2.4瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證 132.2.5PCR產(chǎn)物的回收 142.2.6陽(yáng)性質(zhì)粒的制作 142.2.7RT-qPCR定量檢測(cè)DNA 152.2.8RT-qPCR定量檢測(cè)樣本 15第三章 結(jié)果與分析 173.1引物探針設(shè)計(jì)結(jié)果 173.2厚壁菌門16srRNA基因提取結(jié)果 183.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)效果 183.4引物和探針檢測(cè)效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 193.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)樣品中的厚壁菌門 20第四章結(jié)論 22參考文獻(xiàn) 24致謝 27引言“微生物群”的起源可以追溯到1900年代初。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)菌、酵母菌和病毒在內(nèi)的大量微生物共存于人體的各個(gè)部位（腸道、皮膚、肺、口腔）[1]。此外，人類微生物群，也被稱為“隱藏的器官”，貢獻(xiàn)的遺傳信息是整個(gè)人類基因組的150倍以上[2]。雖然“微生物群”和“微生物組”通常是可以互換的，但這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)之間存在一定的差異。微生物群描述了在定義環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的活微生物，例如口腔和腸道微生物群。微生物組是指從環(huán)境中所有微生物中收集基因組，其中不僅包括微生物群落，還包括微生物結(jié)構(gòu)元素、代謝物和環(huán)境條件。在這方面，微生物組包含比微生物群更廣泛的范圍。在本綜述中，我們主要關(guān)注微生物群在人類健康和疾病中的功能。

微生物群的組成因地點(diǎn)而異。腸道微生物群被認(rèn)為是維持我們健康的最重要的微生物群[4]。腸道細(xì)菌具有多種功能，例如食物發(fā)酵、防止病原體、刺激免疫反應(yīng)和維生素產(chǎn)生[5]。一般來(lái)說(shuō)，腸道菌群由6個(gè)門組成，包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形桿菌門、梭菌門和疣狀菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門是主要類型[6]。研究最多的真菌（腸道菌群）是念珠菌、酵母菌、馬拉色菌和枝孢菌[7]。除了細(xì)菌和真菌，人類腸道微生物群還含有病毒、噬菌體和古細(xì)菌，主要是史密斯分枝桿菌[8]。

在本研究中，我們重點(diǎn)研究腸道中的丁酸菌群。丁酸菌群與我們的健康密不可分，它產(chǎn)生的丁酸鹽物質(zhì)也與我們息息相關(guān)。產(chǎn)丁酸菌主要存在于盲腸和結(jié)腸，主要屬于梭菌屬、真桿菌屬、梭桿菌屬[9]。在人體腸道中含有大量的其他細(xì)菌，從幾種細(xì)菌中檢測(cè)出必需的丁酸菌并不容易，但近年來(lái)，分子生物學(xué)不斷發(fā)展，人們進(jìn)一步提高了檢測(cè)微生物菌群的技術(shù)，特別是RT-PCR技術(shù)的成熟，我們的檢測(cè)方法也得到了改進(jìn)，變得多樣化，其靈敏度和特異性都比傳統(tǒng)的培養(yǎng)物分離檢測(cè)方法高得多，人們可以更好地探索微生物腸道菌群，顯著提高其效率，人們可以更好地分析糞便中的一些細(xì)菌。因此，我們以該方法為參考，通過(guò)科學(xué)的設(shè)計(jì)，開發(fā)出了丁酸菌群實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針。

文獻(xiàn)綜述1.1立題背景在微生物學(xué)中，常常需要對(duì)某種菌株進(jìn)行定量或定性分析。常用的菌株鑒定方法有：形態(tài)學(xué)觀察、遺傳分析、血清分型和生化分析等。目前，當(dāng)我們使用基因序列分析時(shí)，最常見的候選測(cè)序方法通常是16SrRNA和宏基因組測(cè)序。由于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)非常完善，許多基于16SrRNA基因的研究推動(dòng)了微生物鑒定的進(jìn)步。

在過(guò)去的十年中，細(xì)菌16S核糖體RNA基因（16S）序列已成為分析人類腸道微生物群微生物多樣性的有用里程碑。對(duì)三個(gè)人類成體微生物群進(jìn)行了大規(guī)模的16S系統(tǒng)型分析（僅按16S

rRNA序列相似性分組），使用了395%序列同一性（%

ID）的閾值和三個(gè)樣品中的單個(gè)古菌系統(tǒng)型（史密斯美他白桿菌）在菌株水平上鑒定了99個(gè)系統(tǒng)型。擬桿菌屬、真桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和瘤胃球菌屬的成員是在成蟲微生物群中發(fā)現(xiàn)的主要物種。在395種系統(tǒng)型中，約80%代表尚未培育的物種的序列16S分析揭示了人類腸道微生物群中存在大量不可培養(yǎng)的細(xì)菌。僅有高達(dá)20%的16S數(shù)據(jù)能夠分配給過(guò)去四十年中在實(shí)驗(yàn)室成功培養(yǎng)的已知物種。另一方面，16S數(shù)據(jù)沒(méi)有提供有關(guān)微生物群落功能特征的任何信息。

因此，基于培養(yǎng)和基于16S的方法對(duì)于進(jìn)一步的研究，特別是功能分析具有重大局限性。宏基因組測(cè)序使全面探索這些復(fù)雜群落的生物學(xué)性質(zhì)成為可能。這種獨(dú)立于培養(yǎng)的方法包括對(duì)微生物群制備的微生物DNA進(jìn)行鳥槍測(cè)序，微生物群包含直接從環(huán)境中分離的不可培養(yǎng)物種，然后對(duì)獲得的基因組序列進(jìn)行密集的計(jì)算分析。宏基因組學(xué)是收集和分析微生物群落中存在的基因信息的一種相當(dāng)有效和有力的方法，因?yàn)榧?xì)菌基因組中蛋白質(zhì)編碼區(qū)的比例可以高達(dá)80%，因此獲得的大多數(shù)宏基因組序列至少包含與功能直接相關(guān)的部分基因區(qū)域。但是，宏基因組測(cè)序成本較高，準(zhǔn)確性也不高。

因此，我們采用QPCR技術(shù)對(duì)特定的微生物菌株進(jìn)行檢測(cè)。這種方法快速、高效而且準(zhǔn)確，相比其他檢測(cè)方法具有很大優(yōu)勢(shì)。其原理是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，即在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。1.2腸道微生物群腸道微生物平衡與人類疾病和健康密切相關(guān)。與身體的其他區(qū)域相比，人體胃腸道（GI）含有豐富的微生物群落，聚集了100萬(wàn)億個(gè)微生物10。已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，以揭示腸道微生物群與基本人類生物過(guò)程之間的重要關(guān)系。例如，目前的進(jìn)展表明，人類微生物群與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提取、新陳代謝和免疫密切相關(guān)11。微生物群可能通過(guò)多種機(jī)制影響生物過(guò)程。對(duì)于從食物中提取能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微生物群起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)槎喙δ艽x基因提供了獨(dú)立的獨(dú)特酶和生化途徑12。此外，維生素、氨基酸和脂質(zhì)等生物活性分子的生物合成也高度依賴于腸道微生物群13。關(guān)于免疫系統(tǒng)，人體微生物群不僅通過(guò)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來(lái)保護(hù)宿主免受外部病原體的侵害，而且還是腸粘膜和免疫系統(tǒng)發(fā)育的重要組成部分。

在健康條件下，腸道微生物群表現(xiàn)出穩(wěn)定性、彈性和與宿主的共生相互作用。關(guān)于“健康”腸道微生物群的定義及其與宿主生理功能的聯(lián)系，有很多研究。腸道微生物群由細(xì)菌、酵母菌和病毒組成。健康的微生物群落通常表現(xiàn)出高分類多樣性、高微生物基因豐富度和穩(wěn)定的核心微生物群14。由于微生物群在人類福祉中起著重要作用，也積極參與多種生物過(guò)程和疾病發(fā)展，因此對(duì)人類微生物群的研究正在超越成分研究和成員協(xié)會(huì)調(diào)查。具體而言，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注解釋微生物群功能的因果關(guān)系，特別是隨著高通量測(cè)序、微生物群互動(dòng)建模和模擬新技術(shù)的蓬勃發(fā)展?？傮w而言，仍需要進(jìn)一步研究以揭示人類微生物群的作用，以支持基于微生物組的診斷和個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展。

益生菌被定義為“當(dāng)以足夠的量施用時(shí)，會(huì)給宿主帶來(lái)健康益處的活微生物”。作為益生菌菌株來(lái)源的多種發(fā)酵產(chǎn)品，如酸奶、開菲爾、酸菜、豆豉和辛奇，是不同文化中人類飲食的一部分。根據(jù)目前的知識(shí)水平，益生菌包括細(xì)菌（乳酸桿菌、乳球菌、明串珠菌、足球菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌、一些鏈球菌、腸球菌、大腸桿菌）和酵母（酵母菌屬）。

許多因素會(huì)影響益生菌的有效性，包括益生菌與宿主及其微生物組的相互作用。為了產(chǎn)生積極影響，益生菌必須通過(guò)免疫、激素和神經(jīng)元操作，化學(xué)或物理抑制致病菌（例如糞腸球菌、腸道沙門氏菌腸道血清型腸炎沙門氏菌亞種、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）的生長(zhǎng)。

重要的是，它們還要刺激有益微生物的生長(zhǎng)。

越來(lái)越多的研究聲稱益生菌可以緩解許多與免疫系統(tǒng)、心血管健康、癌癥轉(zhuǎn)移、抑郁、焦慮、2型糖尿病和肥胖有關(guān)的疾病。最近，不同益生菌作為不同屬、物種和菌株的功能的安全性，以及它們與不同個(gè)體或高危人群的相關(guān)性，引起了人們的關(guān)注。糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織）2002年的益生菌評(píng)估指南報(bào)告說(shuō)，益生菌理論上可能與患有基礎(chǔ)疾病的患者的特定類型的副作用有關(guān)。高危人群的廣泛特征是免疫系統(tǒng)減弱、腸道生態(tài)失調(diào)和/或腸道屏障受損，因此，仔細(xì)評(píng)估與故意使用益生菌相關(guān)的安全性非常重要，丁酸菌群也為益生菌的一種。1.3丁酸菌群簡(jiǎn)介腸道微生物群由超過(guò)100萬(wàn)億種細(xì)菌組成，包括1000種不同的物種，對(duì)人類健康產(chǎn)生重要影響15。丁酸是一種在腸道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞成熟中起重要作用的物質(zhì)1617，由丁酸產(chǎn)生菌（BAPB）產(chǎn)生，如部分短鏈脂肪酸（SCFA）（擬桿菌目）；梭狀芽胞桿菌、真桿菌和梭狀芽胞桿菌目。報(bào)道稱，在某些疾病患者中，如特發(fā)性腎病綜合征1819、食物過(guò)敏20、腦血管疾病21和2型糖尿病患者中2223，腸道內(nèi)BAPB和糞便丁酸濃度下降。因此，增加腸道微生物群中的BAPB可能有助于預(yù)防和治療各種慢性疾病。盡管益生菌已被廣泛用于糾正腸道微生物群失衡，但其作用有限，因?yàn)榇蠖鄶?shù)益生菌只通過(guò)腸道，而不駐留在和調(diào)節(jié)腸道微生物組成中2425。1.4丁酸菌群與人類健康的關(guān)系1.4.1丁酸菌群與抗炎作用人體的丁酸菌群會(huì)產(chǎn)生大量的丁酸物質(zhì)。大量證據(jù)表明，異常量的脂質(zhì)、高血糖和胰島素敏感性受損都可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和低度慢性炎癥，這與心血管疾病有關(guān)2627。SCFA中的丁酸物質(zhì)也具有非常有效的抗炎作用，可阻斷炎癥介質(zhì)的釋放，從而減少免疫細(xì)胞流入炎癥部位，免疫細(xì)胞遷移，增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡28。通過(guò)這種方式，由GPCRs激活介導(dǎo)的功能可以阻止白細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程29。此外，丁酸鹽和乙酸鹽已被證明通過(guò)增加一氧化氮（NO）的生物利用度并減少氧化應(yīng)激，對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮功能障礙產(chǎn)生有益作用30?？傊∷峋哂锌寡鬃饔?，這是基于以上不同機(jī)制產(chǎn)生的。1.4.2丁酸菌群和食欲和血糖的調(diào)節(jié)已經(jīng)證明，丁酸菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFA）可以與腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞中的GPR41和GPR43結(jié)合，從而增加餐后腸道激素肽YY（PYY）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和胰高血糖素樣肽-2（GLP-2）的釋放31。這有可能改善血糖控制和食欲調(diào)節(jié)，因?yàn)镚LP-1可增加胰腺的胰島素釋放，而GLP-1和PYY都是抑制食欲的激素32。GLP-2對(duì)于保持腸道完整性很重要33,34。動(dòng)物研究表明，丁酸鹽通過(guò)促進(jìn)腸道產(chǎn)生GLP-1和PYY以及保護(hù)腸道屏障來(lái)改善葡萄糖控制35,36。根據(jù)Sakakibara等人37的說(shuō)法，基于體內(nèi)和體外研究，SCFA還可以通過(guò)激活GPR43來(lái)增加食欲抑制激素瘦素的分泌1.4.3丁酸菌群和脂質(zhì)代謝丁酸菌群產(chǎn)生的SCFA物質(zhì)可以作為肝臟脂質(zhì)和膽固醇合成的底物進(jìn)入循環(huán)，但也可以作為脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子。SCFA可以增強(qiáng)脂肪酸氧化和熱量的產(chǎn)生，阻斷脂肪酸合成，減少體內(nèi)脂肪的儲(chǔ)存38。血管生成素樣4（ANGPTL4）是一種具有多種不同功能的信號(hào)蛋白，可在大多數(shù)組織中合成39。研究表明，ANGPTL4是對(duì)腸道微生物環(huán)境有反應(yīng)的關(guān)鍵宿主蛋白。通過(guò)控制組織中脂肪酸的攝取和代謝，ANGPTL4可以改變?nèi)祟惖姆逝?041。特別是丁酸鹽，通過(guò)誘導(dǎo)人結(jié)腸細(xì)胞系中ANGPTL4的分泌來(lái)影響脂質(zhì)代謝，從而刺激過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體γ（PPARγ），從而阻斷脂蛋白脂肪酶（LPL）的活化42。LPL對(duì)于脂肪酸從乳糜微粒和極低密度脂蛋白（VLDL）轉(zhuǎn)移到脂肪細(xì)胞很重要43。此外，ANGPTL4在白色脂肪組織中的過(guò)度表達(dá)會(huì)減少脂肪量。

最后，丁酸鹽通過(guò)解偶聯(lián)蛋白（UCP）增加產(chǎn)熱和脂質(zhì)利用率。UCP在脂質(zhì)代謝中起著至關(guān)重要的作用，并通過(guò)激活脂聯(lián)素來(lái)改善脂質(zhì)代謝。因此，可以得出結(jié)論，丁酸菌群產(chǎn)生的丁酸等物質(zhì)對(duì)于人體健康具有重要意義。1.5熒光定量PCR原理及介紹診斷微生物學(xué)正處于一個(gè)新時(shí)代。在分子診斷領(lǐng)域，PCR已經(jīng)廣泛應(yīng)用，現(xiàn)在已被接受為從許多樣品和微生物類型中檢測(cè)核酸的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，傳統(tǒng)的PCR仍然是研究實(shí)驗(yàn)室中必不可少的工具。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不同于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，因?yàn)樗焖?、更靈敏且可實(shí)時(shí)觀測(cè)，同時(shí)將殘留污染的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。越來(lái)越多的化學(xué)品用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物，因?yàn)樗鼈冊(cè)趯?shí)時(shí)熒光定量PCR期間積聚在封閉的反應(yīng)容器內(nèi)。

1.5.1

qPCR技術(shù)

傳統(tǒng)的診斷微生物檢測(cè)包括顯微鏡檢查、微生物培養(yǎng)、抗原血癥和血清學(xué)。這些方法可能受到敏感性差、微生物生長(zhǎng)緩慢或存活不良、檢測(cè)窗口窄、解釋復(fù)雜、免疫抑制、抗菌治療、高水平背景和非特異反應(yīng)的限制。因此，我們嘗試使用qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。與傳統(tǒng)PCR相比，擴(kuò)增子的檢測(cè)可以隨著擴(kuò)增的進(jìn)展而可視化，這是一個(gè)受歡迎的可能性。這將PCR的作用從純粹的研究工具擴(kuò)展到多功能技術(shù)，允許為高通量和低通量臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)常規(guī)診斷應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)中，qPCR具有比普通PCR靈敏度高的特點(diǎn)，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，比普通PCR法高100-1000倍。

在此過(guò)程中，實(shí)時(shí)測(cè)定提供了對(duì)PCR動(dòng)力學(xué)以及不同核酸提取方法的效率以及某些化合物在抑制擴(kuò)增中的作用的見解。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是核酸成功擴(kuò)增的關(guān)鍵因素之一。如今，實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)食品中的核酸、基因治療方案中使用的載體、轉(zhuǎn)基因生物以及人類和獸醫(yī)微生物學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域。熒光定量PCR的原理是在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

其中熒光定量PCR又分為兩種方法且各有利弊：

01

染料法

在國(guó)內(nèi)，染料法一般采用DNA染料SYBRGreenⅠ。染料法使用簡(jiǎn)單，成本也相對(duì)較低，因此會(huì)有很多國(guó)內(nèi)研究者會(huì)選擇使用染料法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在染料法熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，染料能夠與雙鏈結(jié)合，從而發(fā)光，而在游離狀態(tài)下，SYBRGreen

I發(fā)出微弱的熒光。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出線的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。但是染料法檢測(cè)的是體系中的所有雙鏈DNA，因此一些非特異性擴(kuò)增或者引物二聚體的出現(xiàn)，會(huì)極大的影響真實(shí)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

02

TaqMan探針?lè)?/p>

PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)擴(kuò)增引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。Taqman探針為一段線性的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（FAM或Hex等）和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)。當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，這也就是探針?lè)ǘ康脑怼?/p>

相比之下，TaqMan探針比SYBRGreen具有更高的識(shí)別能力，這取決于所使用的引物和探針的特異性。為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精確度的要求，本次實(shí)驗(yàn)中采用的方法是TaqMan探針?lè)?。以上就是qPCR的基本原理以及兩種方法的選擇。1.5.2RT-qPCR技術(shù)RT-PCR將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與基于PCR的擴(kuò)增結(jié)合，從mRNA中生成cDNA。一個(gè)RNA序列作為逆轉(zhuǎn)錄酶的模板。由此得到的單鏈DNA然后作為PCR的模板。針對(duì)已知mRNA編碼區(qū)的引物將優(yōu)化特定轉(zhuǎn)錄本的反應(yīng)，也用于克隆。否則，多聚-dt寡核苷酸將通過(guò)退火到其poly-A尾巴來(lái)啟動(dòng)大多數(shù)mRNA。

RT-PCR可以作為兩個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)進(jìn)行，也可以作為一個(gè)需要更具體的商業(yè)酶的單一反應(yīng)進(jìn)行。由于其敏感性，RT-PCR具有優(yōu)勢(shì)；它只需要相對(duì)較少的樣本。例如，RT-PCR可以用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)。1.5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作PCR閾值標(biāo)準(zhǔn)曲線基于PCR運(yùn)行的初始階段的指數(shù)模型，其中模板復(fù)制效率是恒定的循環(huán)到循環(huán)。因此，它要求閾值處于不高于復(fù)制效率從其初始值下降的擴(kuò)增模板的水平。第二個(gè)要求是所有擴(kuò)增譜（校準(zhǔn)和測(cè)試）具有相同的初始效率。然而，可能未檢查是否滿足這些要求，并且似乎明顯意識(shí)到閾值可以設(shè)置為高于效率從初始值下降的地方，而不損害結(jié)果有效性。閾值標(biāo)準(zhǔn)曲線法被認(rèn)為是定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn)，其基于PCR運(yùn)行的初始階段的指數(shù)模型。在文章、教程、商業(yè)指南等中提出的閾值標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線模型的推導(dǎo)中，明確要求閾值處于放大指數(shù)的水平，即在運(yùn)行的初始恒定效率階段。1.6研究意義實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)于研究微生物疾病非常有用，像近些年來(lái)的核酸檢測(cè)采用的方法就是熒光定量PCR的方法，它們有助于闡明許多疾病過(guò)程。與非PCR技術(shù)相比，這使得實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)施對(duì)許多人具有吸引力，現(xiàn)在我們要將這種技術(shù)應(yīng)用于菌群檢測(cè)上，在我們?nèi)梭w中，我們與大量細(xì)菌、古生菌、真核生物和病毒共生，它們統(tǒng)稱為微生物群，分布在身體的不同部位。在人體腸道內(nèi)就分布著大量的益生菌對(duì)人體起著不可或缺的作用，產(chǎn)丁酸菌群就是其中的一種，但對(duì)于這種菌群的檢測(cè)方法我們還知之甚少，因此，我們本次課題就是要開發(fā)出對(duì)于丁酸菌群的QPCR探針，并使用這種方法更快更準(zhǔn)確檢測(cè)人體腸道內(nèi)的丁酸菌群。丁酸菌群實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法2.1實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及試劑2.1.1儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器設(shè)備見表2.1：表2.1主要儀器設(shè)備設(shè)備耗材生產(chǎn)廠家超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司金屬浴北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司常溫離心機(jī)Eppendorf低速離心機(jī)北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司渦旋振蕩儀北京托摩根生物科技有限公司電子天平OHAUS核酸電泳儀北京六一生物科技有限公司1.5mL、2mL無(wú)菌離心管上海BBI生命科學(xué)熒光定量PCR8連管\o"/"NEST?BiotechCFXconnect?熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)Bio-Rad凝膠成像儀Bio-Rad切膠儀上海生工生物工程股份有限公司移液槍Eppendorf2.1.2主要試劑表2.2主要試劑主要試劑生產(chǎn)廠家QIAampPowerFecalProDNAKit上海凱杰企業(yè)管理有限公司凝膠回收試劑盒OMEGA瓊脂糖BioFroxxTrisDiamondEDTABioFroxx醋酸上海生工生物工程股份有限公司UracilDNAGlycosylase上海翌圣生物科技有限公司AnimalDetectionU+ProbeMasterMix南京諾唯贊生物科技有限公司4SGreenPlus無(wú)毒核酸染料上海BBI生命科學(xué)2.2方法2.2.1靶標(biāo)篩選通過(guò)人類腸道宏基因組公共數(shù)據(jù)庫(kù)（GMrepo：./home）獲得大量腸道微生物樣本的數(shù)據(jù)，并在出現(xiàn)頻率和相對(duì)豐度的條件下對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，得出所需的流行物種列表，選擇從門到屬與人類健康關(guān)聯(lián)較大的靶標(biāo)分類群選擇到丁酸菌群的靶標(biāo)。2.2.1TaqManqPCR檢測(cè)方法的建立為了識(shí)別針對(duì)特定腸道微生物群的引物和探針，分析基因序列以識(shí)別在給定群體中高度保守的區(qū)域以及足以將該群體與腸道微生物組的其他成員區(qū)分開來(lái)的區(qū)域。首先使用NCBI設(shè)計(jì)引物和探針。在選擇每個(gè)靶標(biāo)的特定保守區(qū)序列后，通過(guò)NCBI-BLAST算法獲得所選基因序列的物種特異性，設(shè)計(jì)參數(shù)（如引物長(zhǎng)度、探針長(zhǎng)度、擴(kuò)增子長(zhǎng)度、熔解溫度、GC含量等）以獲得更高的成功率。使用primer

3.0軟件設(shè)計(jì)了引物和探針，先前選擇了每個(gè)目標(biāo)物種的特定基因。選擇目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)是：通過(guò)NCBI的BLAST算法1研究所選擇基因/序列的物種特異性，每個(gè)目標(biāo)物種中只存在所選擇基因/序列的一個(gè)副本（iii）所選擇序列適合primer

3.0

軟件設(shè)計(jì)引物和探針（例如，序列的GC含量）以達(dá)到更高的設(shè)計(jì)成功率。多重檢測(cè)引物-探針集設(shè)計(jì)的參數(shù)（例如引物、探針和擴(kuò)增子的長(zhǎng)度，熔解溫度和GC含量）是根據(jù)軟件默認(rèn)設(shè)置定義的。為了增加TaqMan探針的穩(wěn)定性、特異性和靈敏性，每個(gè)探針都包含四個(gè)Locked

Nucleic

AcidTM（LNA）堿基。在表2中，總結(jié)了本研究中產(chǎn)生的目標(biāo)菌群引物-探針序列的信息。首先，通過(guò)進(jìn)行NCBI的BLAST驗(yàn)證引物、探針和擴(kuò)增子的特異性。然后，使用BLAST搜索將擴(kuò)增子序列針對(duì)整個(gè)相應(yīng)微生物基因組進(jìn)行檢查。在探針合成之前，通過(guò)在單重或多重PCR反應(yīng)中使用常規(guī)PCR來(lái)檢查所有引物對(duì)的特異性（由Sigma-Aldrich，德國(guó)合成），以研究目標(biāo)物種預(yù)期擴(kuò)增子的產(chǎn)生，以及驗(yàn)證非目標(biāo)物種中沒(méi)有產(chǎn)物的存在。為此，PCR混合物的10μL（最終體積）包含2μL綠色GoTaq反應(yīng)緩沖液、0.05μL

GoTaq

DNA聚合酶（5

U

μL

-1；Promega，德國(guó)）、0.2μL的dNTP混合物（每種10

mM）、每個(gè)引物的適當(dāng)量以達(dá)到單重PCR反應(yīng)中的最終濃度為1.2μM或多重PCR中的0.8μM，以及0.7μL的DNA模板。單重PCR和多重PCR都在Eppendorf

MasterCycler下進(jìn)行，具體循環(huán)條件如下：95℃，5分鐘；35個(gè)周期的95℃，30秒，45℃，30秒和72℃，20秒；最后在72℃下延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物在含有GelRedTM染料（Biotium，Inc.，美國(guó)）的2%瓊脂糖凝膠（Roth，德國(guó)）中分析。然后，每對(duì)引物分別在有或無(wú)DNA模板的qPCR運(yùn)行中使用，以研究目標(biāo)微生物中單個(gè)產(chǎn)物的擴(kuò)增和引物二聚體的缺失。接著使用PCR與qPCR擴(kuò)增驗(yàn)證引物、探針的穩(wěn)定性與特異性。通過(guò)BLAST搜索將擴(kuò)增的序列與相應(yīng)的微生物基因組進(jìn)行比較，驗(yàn)證引物和探針靶向微生物的覆蓋度。使用PCR擴(kuò)增驗(yàn)證引物特異性，反應(yīng)體系為50μL（最終體積）的PCR混合物由上游下游各1μL引物（終濃度0.4μM）、25μLMix（2×TaqPCRMix，Vazyme）和1pg~50ngDNA模板組成。得到PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的條帶，再通過(guò)qPCR檢測(cè)多重反應(yīng)中所有引物的穩(wěn)定性。2.2.3糞便DNA的提取使用QIAamp?PowerFecal?ProDNAKit糞便DNA提取試劑盒用于從糞便和腸道樣本中分離微生物基因組DNA，旨在用于含有糞便中常見的抑制物質(zhì)的樣品，如多糖、血紅素化合物和膽鹽。改進(jìn)的IRT與更高效的珠打和裂解化學(xué)相結(jié)合，可以獲得高質(zhì)量的DNA，可立即用于下游應(yīng)用，包括PCR、qPCR和下一代測(cè)序。QIAamp?PowerFecal?ProDNAKit糞便DNA提取試劑盒甚至可以有效地去除最困難的糞便類型中的PCR抑制劑。將樣品加入到珠打管中，以快速和徹底地均勻化。細(xì)胞裂解是通過(guò)機(jī)械和化學(xué)的方法發(fā)生的。總基因組DNA以旋轉(zhuǎn)柱的形式被捕獲在硅膜上。然后將DNA從膜上洗脫，準(zhǔn)備用于NGS、PCR和其他下游應(yīng)用。按照如下的步驟進(jìn)行提?。憾虝旱匦D(zhuǎn)電源珠子Pro管，以確保珠子已經(jīng)固定在底部。加上250毫克的糞便和800μl的CD1溶液。漩渦會(huì)短暫地混合起來(lái)。將PowerBeadPro管水平固定在一個(gè)渦旋適配器上，為1.5-2毫升的管(貓。編號(hào)：13000-V1-24)。漩渦下的最大速度為10min。離心P管15000xg1min。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的2ml微離心管中（提供）。注意：預(yù)計(jì)將為500-600μl。上清液中可能仍含有一些糞便顆粒。加入200μl溶液CD2，渦旋5s.15,000xg離心機(jī)，共離1min。避免將顆?；?，將高達(dá)700μl的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的2ml微離心管中（提供）。注意：預(yù)計(jì)將為500-600μl。加入600μl溶液CD3，渦旋5s.將650μl的裂解液載入MB旋轉(zhuǎn)柱上，以15,000xg離心1min。丟棄流動(dòng)通過(guò)液，并重復(fù)步驟8，以確保所有的裂解液都已經(jīng)通過(guò)了MB旋轉(zhuǎn)柱。小心地將MB旋轉(zhuǎn)柱放入一個(gè)干凈的2ml收集管中（提供）。避免飛濺到MB旋轉(zhuǎn)柱上將500μl的做好的EA添加到MB旋轉(zhuǎn)列中。15,000xg離心機(jī)，共離1min。丟棄流式旋轉(zhuǎn)柱，并將MB旋轉(zhuǎn)柱放回相同的2ml收集管中。.將500μl的溶液C5添加到MB旋轉(zhuǎn)列中。15,000xg離心機(jī)，共離1min。.丟棄流經(jīng)裝置并將MB旋轉(zhuǎn)柱放入新的2ml收集管中。離心機(jī)設(shè)置最高為16000xg，離心2min。小心地將MB旋轉(zhuǎn)柱放入一個(gè)新的1.5ml洗脫管中。在白色濾膜的中心加入50-100μl的溶液C6。設(shè)置15,000xg離心機(jī)，共離1min。丟棄MB自旋列。該DNA現(xiàn)在已經(jīng)準(zhǔn)備好在下游應(yīng)用了，實(shí)驗(yàn)時(shí)，每份糞便樣本稱取0.2g用于提取DNA。提取后測(cè)量DNA濃度，并儲(chǔ)存在-20℃以便進(jìn)一步分析。2.2.4TA質(zhì)粒構(gòu)建使用自殺基因來(lái)判斷樣本是否為重組后的樣本，如果片段成功重組，那么自殺基因?qū)⒉粫?huì)表達(dá)，細(xì)胞正常。但如果所篩選的片段沒(méi)有接入，該基因?qū)?huì)正常表達(dá)，導(dǎo)致此細(xì)胞不能生長(zhǎng)，即為零背景。PCR產(chǎn)物的制備。選用無(wú)磷酸化的引物，使用Taq系列DNA聚合酶，在反應(yīng)后5到10分鐘進(jìn)行延伸，反應(yīng)完成后檢測(cè)。如果擴(kuò)增產(chǎn)物有多條帶，凝膠回收目的片段?？寺》磻?yīng)體系。首先加入PCRProduct 0.5-4微升，pEASY?-TSZeroCloningVector1微升。將上述所取得溶液輕輕混合后，在常溫環(huán)境下等待反應(yīng)300sec完成后低溫放置?？寺》磻?yīng)條件如表4。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物于50微升的Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，稍微搖晃使其混合均勻后，放在低溫處理25分鐘，在42攝氏度激熱半分鐘后放入冰浴120sec。在Luria-Bertani培養(yǎng)基上200轉(zhuǎn)每分鐘，37攝氏度培養(yǎng)60分鐘后培養(yǎng)一晚上。陽(yáng)性克隆檢測(cè)，使用PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆，然后用限制性酶切分析陽(yáng)性克隆，最后進(jìn)行引物測(cè)序和序列分析表2.4克隆反應(yīng)條件表?xiàng)l件用量插入片段DNA量載體與片段摩爾比=1：7按照“1kb20ng”的比例計(jì)算載體使用量1微升反應(yīng)體系3-5微升，體積不足時(shí)補(bǔ)充無(wú)菌水反應(yīng)時(shí)間片段長(zhǎng)度為0.1-1kb5-10min，片段長(zhǎng)度范圍每增加1kb，時(shí)間范圍增加5min，超過(guò)3kb為20-30min反應(yīng)溫度25℃,如片段是高GC含量，以37℃反應(yīng)2.2.5腸道微生物群的TaqManqPCR檢測(cè)使用CFXconnect?熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（BioRad）并在0.1mLPCR八連管（NEST）中進(jìn)行反應(yīng)。引物和TaqMan探針的序列見表3-4。每個(gè)樣品設(shè)置兩組平行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)總體系為20μL（AnimalDetectionU+

ProbeMasterMix，0.4μM引物，0.2μMTaqMan探針和1μL模板DNA）。所有qPCR反應(yīng)均通過(guò)以下熱循環(huán)程序進(jìn)行：37℃，2分鐘（此步使用UDG酶，建立PCR防污染體系，保證PCR擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性）；95℃30s；95℃10s，60℃30s，40次循環(huán)。通過(guò)qPCR獲得的基因擴(kuò)增水平顯示為與初始DNA濃度成反比的CT值。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)獲得的樣品Ct值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的拷貝數(shù)。CFXconnect?（BioRad）軟件控制程序根據(jù)設(shè)定的校準(zhǔn)曲線值自動(dòng)計(jì)算數(shù)量平均值。在數(shù)據(jù)自動(dòng)處理之后，通過(guò)手動(dòng)校準(zhǔn)來(lái)校正某些曲線自動(dòng)讀取的不準(zhǔn)確性。將定量值導(dǎo)出到電子表格中，進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。2.2.6瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳步驟：電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，準(zhǔn)確的稱取一定量的瓊脂糖干粉，加入到合適體積的錐形瓶中，加入一定量的電泳緩沖液（30ml左右1×TAE）；放入到微波爐內(nèi)加熱融化，冷卻片刻（不燙手即可）后加入1μL的染料；融化后的瓊脂溶液搖晃混勻，倒入電泳槽中，等其凝固；室溫下凝固30-40min左右，小心的拔出梳子，取出凝固好的凝膠放入電泳槽內(nèi)，沒(méi)過(guò)膠面1mm左右，去除膠孔內(nèi)的氣泡，準(zhǔn)備上樣；5μLDNA樣品加入1μL上樣緩沖液（loading

buffer），用槍混勻后加入到凝膠孔內(nèi)；上樣結(jié)束，接通電源，紅色正極，黑色負(fù)極，DNA樣品有負(fù)極往正極運(yùn)動(dòng)，加樣孔側(cè)為負(fù)，電壓100V，恒流400mA，40分鐘；時(shí)間結(jié)束，關(guān)閉電源，凝膠成像儀上觀察樣本位置并比對(duì)marker判斷大小。結(jié)果與分析3.1引物探針設(shè)計(jì)結(jié)果根據(jù)前文所述的分析，從分類單元特定的保守區(qū)中得出一致序列。通過(guò)一致序列的基礎(chǔ)使用NCBI設(shè)計(jì)引物和探針。引物和探針的設(shè)計(jì)需滿足以下要求：引物的熔解溫度（Tm）為58-62℃，探針的熔解溫度為65-75℃，GC含量為40-65%?；赥aqManqPCR的方法每個(gè)分類單元包含一對(duì)引物和一個(gè)寡核苷酸探針。接著以人類糞便DNA為模板，使用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了引物的特異性，結(jié)果顯示了清晰單一的條帶，片段大小與引物設(shè)計(jì)時(shí)一致，沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶圖。表3-4靶標(biāo)的引物與探針Table3-4PrimersandProbesfor10Targets毛螺菌科（Lachnospiraceae）F:GAKCAAACAGGATTAGATACCR:AATTAAACCACATGCTCCP:HEX-TACGTYCGCAAGAATGAAACTC-BHQ2ButyricacidfloraPCR擴(kuò)增驗(yàn)證引物特異性。PCRamplificationtoverifyprimerspecificity.為了得到測(cè)試反應(yīng)條件，我們通過(guò)改變反應(yīng)中的引物濃度與退火溫度，分別設(shè)置了0.25μM~2μM的濃度梯度與50℃~65℃的溫度梯度，通過(guò)擴(kuò)增曲線與CT值的結(jié)果和在成本上的考慮，以及防止出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，將引物終濃度為0.5μM，退火溫度為60℃作為最終反應(yīng)條件（圖3-3）。3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與TaqManqPCR在RT-qPCR中，對(duì)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，根據(jù)反應(yīng)時(shí)間和熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。整條曲線可以分為3個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，由此來(lái)推斷模板最初的含量而進(jìn)行定量分析。圖3-2梯度稀釋圖由圖可以看出隨著樣本濃度梯度稀釋，濃度降低，Ct值等差增加，圖中曲線近似平行基本沒(méi)有相差，各個(gè)濃度下Ct值具有相對(duì)穩(wěn)定的差異變化，由此可以證明，本實(shí)驗(yàn)中我們所設(shè)計(jì)的引物探針檢驗(yàn)效率較好。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中已覆蓋微生物基因組序列選擇一段并合成質(zhì)粒（金唯智）作為標(biāo)準(zhǔn)品。用稀釋10倍的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（具體拷貝數(shù)可根據(jù)濃度計(jì)算）以其作為模板，在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增,以模板對(duì)數(shù)值為x軸，Ct值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.圖3-5?！尽吭趫D3-4中擴(kuò)增效率（E）計(jì)算公式：E=10-1/斜率-1。通過(guò)檢測(cè)效率圖到標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率為-3.788，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線R方大于0.98，擬合度高，因此我們證明檢測(cè)結(jié)果可靠。第四章結(jié)論腸道微生物和人體健康的關(guān)系備受關(guān)注，因?yàn)槟c道微生物不僅參與消化和營(yíng)養(yǎng)吸收，還對(duì)免疫調(diào)節(jié)和疾病預(yù)防起著重要作用。隨著現(xiàn)代生活方式和飲食習(xí)慣的改變，腸道微生物失調(diào)引起的疾病也越來(lái)越多。因此，了解腸道微生物的組成和功能，以及如何檢測(cè)腸道微生物的變化，對(duì)預(yù)防和治療腸道相關(guān)疾病具有重要意義。目前，微生物檢測(cè)技術(shù)不斷提高，如高通量測(cè)序等。但由于時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確度低、費(fèi)用高等問(wèn)題，它們?cè)谂R床應(yīng)用中受到限制。相比之下TaqMan

QPCR檢測(cè)方法是一種快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)腸道微生物的數(shù)量和種類，對(duì)研究腸道微生物和人體健康的關(guān)系具有重要意義。與其他微生物檢測(cè)方法相比，TaqMan

QPCR檢測(cè)具有更高的靈敏度和特異性，能夠檢測(cè)微生物的細(xì)微變化，因此被廣泛應(yīng)用于腸道微生物研究和臨床診斷。實(shí)驗(yàn)開發(fā)了匹配特定TaqMan引物的專用探針?lè)椒ǎ⒗脽晒釶CR技術(shù)進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量TaqMan引物檢測(cè)。用這一技術(shù)已成功檢出從人體腸道中的丁酸菌群，還在糞樣中得到了證實(shí)，表明該系統(tǒng)高效可靠。并將其作為標(biāo)準(zhǔn)模板用于糖凝膠電泳分離和TA克隆獲得的重組質(zhì)粒。結(jié)果表明：所構(gòu)建的快速簡(jiǎn)便的DNA分子標(biāo)記體系在一定程度上可以滿足分子生物學(xué)研究工作的需要。所建立的方法能夠?qū)崿F(xiàn)糞便中丁酸菌群的準(zhǔn)確識(shí)別。參考文獻(xiàn)1.

UrsellLK,etal.Theintestinalmetabolome:anintersectionbetweenmicrobiotaandhost.

Gastroenterology.

2014;146:1470–1476.2.

GriceEA,SegreJA.Thehumanmicrobiome:oursecondgenome.

Annu.Rev.Genom.Hum.Genet.

2012;13:151–170.3.

BergG,etal.Microbiomedefinitionre-visited:oldconceptsandnewchallenges.

Microbiome.

2020;8:103.4.

ShreinerAB,KaoJY,YoungVB.Thegutmicrobiomeinhealthandindisease.

Curr.Opin.Gastroenterol.

2015;31:69–75.5.

HillmanET,LuH,YaoT,NakatsuCH.Microbialecologyalongthegastrointestinaltract.

MicrobesEnviron.

2017;32:300–313.6.

LaterzaL,etal.Thegutmicrobiotaandimmunesystemrelationshipinhumangraft-versus-hostdisease.

MediterraneanJ.Hematol.Infect.Dis.

2016;8:2016025.7.

Auchtung,T.A.etal.Investigatingcolonizationofthehealthyadultgastrointestinaltractbyfungi.

mSphere.

3,e00092–18(2018).

8.

LozuponeCA,etal.Diversity,stabilityandresilienceofthehumangutmicrobiota.

Nature.

2012;489:220–230.

9.

LeyRE,TurnbaughPJ,KleinS,GordonJI.Humangutmicrobesassociatedwithobesity.

Nature.

2006;444:1022–1023.10.

BouskraD,etal.LymphoidtissuegenesisinducedbycommensalsthroughNOD1regulatesintestinalhomeostasis.

Nature.

2008;456:507–510.11.

TurnbaughPJ,etal.Anobesity-associatedgutmicrobiomewithincreasedcapacityforenergyharvest.

Nature.

2006;444:1027–1031.12.

RoberfroidMB,BornetF,BouleyC,CummingsJH.Colonicmicroflora:nutritionandhealth.SummaryandconclusionsofanInternationalLifeSciencesInstitute(ILSI)[Europe]workshopheldinBarcelona,Spain.

Nutr.Rev.

1995;53:127–130.13.

FanY,PedersenO.Gutmicrobiotainhumanmetabolichealthanddisease.

Nat.Rev.Microbiol.

2021;19:55–71.14Sender,R.;Fuchs,S.;Milo,R.AreWeReallyVastlyOutnumbered?RevisitingtheRatioofBacterialtoHostCellsinHumans.Cell2016,164,337–340.15Atarashi,K.;Tanoue,T.;Oshima,K.;Suda,W.;Nagano,Y.;Nishikawa,H.;Fukuda,S.;Saito,T.;Narushima,S.;Hase,K.;etal.TreginductionbyarationallyselectedmixtureofClostridiastrainsfromthehumanmicrobiota.Nature2013,500,232–236.16Furusawa,Y.;Obata,Y.;Fukuda,S.;Endo,T.A.;Nakato,G.;Takahashi,D.;Nakanishi,Y.;Uetake,C.;Kato,K.;Kato,T.;etal.Commensalmicrobe-derivedbutyrateinducesthedifferentiationofcolonicregulatoryTcells.Nature2013,504,446–450.17Tsuji,S.;Akagawa,S.;Akagawa,Y.;Yamaguchi,T.;Kino,J.;Yamanouchi,S.;Kimata,T.;Hashiyada,M.;Akane,A.;Kaneko,K.Idiopathicnephroticsyndromeinchildren:RoleofregulatoryTcellsandgutmicrobiota.Pediatr.Res.2020,89,1185–1191.18Yamaguchi,T.;Tsuji,S.;Akagawa,S.;Akagawa,Y.;Kino,J.;Yamanouchi,S.;Kimata,T.;Hashiyada,M.;Akane,A.;Kaneko,K.ClinicalSignificanceofProbioticsforChildrenwithIdiopathicNephroticSyndrome.Nutrients2021,13,365.19Yamagishi,M.;Akagawa,S.;Akagawa,Y.;Nakai,Y.;Yamanouchi,S.;Kimata,T.;Hashiyada,M.;Akane,A.;Tsuji,S.;Kaneko,K.Decreasedbutyricacid-producingbacteriaingutmicrobiotaofchildrenwitheggallergy.Allergy2021,76,2279–2282.20Zeng,X.;Gao,X.;Peng,Y.;Wu,Q.;Zhu,J.;Tan,C.;Xia,G.;You,C.;Xu,R.;Pan,S.;etal.HigherRiskofStrokeIsCorrelatedwithIncreasedOpportunisticPathogenLoadandReducedLevelsofButyrate-ProducingBacteriaintheGut.Front.CellInfectMicrobiol.2019,9,4.21Qin,J.;Li,Y.;Cai,Z.;Li,S.;Zhu,J.;Zhang,F.;Liang,S.;Zhang,W.;Guan,Y.;Shen,D.;etal.Ametagenome-wideassociationstudyofgutmicrobiotaintype2diabetes.Nature2012,490,55–60.22Sato,J.;Kanazawa,A.;Ikeda,F.;Yoshihara,T.;Goto,H.;Abe,H.;Komiya,K.;Kawaguchi,M.;Shimizu,T.;Ogihara,T.;etal.Gutdysbiosisanddetectionof“l(fā)ivegutbacteria”inbloodofJapanesepatientswithtype2diabetes.DiabetesCare2014,37,2343–2350.23Suez,J.;Zmora,N.;Segal,E.;Elinav,E.Thepros,cons,andmanyunknownsofprobiotics.Nat.Med.2019,25,716–729.24Kristensen,N.B.;Bryrup,T.;Allin,K.H.;Nielsen,T.;Hansen,T.H.;Pedersen,O.Alterationsinfecalmicrobiotacompositionbyprobioticsupplementationinhealthyadults:Asystematicreviewofrandomizedcontrolledtrials.GenomeMed.2016,8,52.25GrundySM,CleemanJI,DanielsSR,DonatoKA,EckelRH,FranklinBA,etal.Diagnosisandmanagementofthemetabolicsyndrome:anAmericanheartassociation/nationalheart,lung,andbloodinstitutescientificstatement.Circulation.2005;112(17):2735–52.26AdesPA,SavagePD.Potentialbenefitsofweightlossincoronaryheartdisease.ProgCardiovascDis.2014;56(4):448–56.27NogalA,ValdesAM,MenniC.Theroleofshort-chainfattyacidsintheinterplaybetweengutmicrobiotaanddietincardio-metabolichealth.GutMicrobes.2021;13(1):1–24.28González-BoschC,BoormanE,ZunszainPA,MannGE.Short-chainfattyacidsasmodulatorsofredoxsignalinginhealthanddisease.RedoxBiol.2021;47:102165.29Robles-VeraI,ToralM,delaVisitaciónN,Aguilera-SánchezN,RedondoJM,DuarteJ.Protectiveeffectsofshort-chainfattyacidsonendothelialdysfunctioninducedbyangiotensinII.FrontPhysiol.2020;11:277.30HolstJJ.Thephysiologyofglucagon-likepeptide1.PhysiolRev.2007;87(4):1409–39.31CaniPD,EverardA,DuparcT.Gutmicrobiota,enteroendocrin