《基于質譜的定量蛋白質組技術規(guī)程》編制說明

2本標準基于衛(wèi)健委/科技部國家重點研發(fā)計劃《醫(yī)學生命組學數(shù)據(jù)質量控制關鍵技術研發(fā)與應用》（2018YFC0910200，2018年立項，2021年結題）和廣東省重點領域研發(fā)計劃《多組學整合技術研發(fā)及標準化組學數(shù)據(jù)質量控制技術的推廣應用》（2019B020226001，2023年9月提出申報，根據(jù)中國國際科技促進會標準化工作委員會[2023]中科促標字第982號文件：關于開展《基于質譜的定量蛋白質組技術規(guī)程》團體標準立項通知，正式確立立質譜是目前蛋白質組學研究的主流技術，可以一次性分析復雜樣品中上萬種蛋白質。但質譜的重現(xiàn)性一直是一個很大的問題。同一個樣品做兩次質譜實驗，鑒定到的蛋白質都有較大的不同，重現(xiàn)性（即兩次都能鑒定到的蛋白數(shù)量占總鑒定數(shù)的百分比）一般只能達AcquisitionofallTheoreticalfragmentions,SWATH）質譜技術中被重復鑒定到，而SWATH已經(jīng)被認為是重現(xiàn)性相對較高的質譜技術了?！禨cience》曾組織專題研討會討論如何提高質譜的重現(xiàn)性，指出現(xiàn)有質譜的重現(xiàn)性遠遠不能滿足生物標志物的要求。重現(xiàn)性問題如果不能得到很好的解決，那么基于質譜的生物標志物發(fā)現(xiàn)及臨床應用將十分困難。對于定量蛋白質組學研究，因為樣品制備流程、質譜平臺和分析流程常常不一致，加大了蛋白質組學在精準醫(yī)學中的應用難度；此外，Hela細胞蛋白酶解的標準品作為一種高度驗3證的哺乳動物蛋白消化物，可用作復雜蛋白質組學樣品的質譜分析的質控樣品被人們廣泛使用。然而Hela細胞因其存在超強的種內污染和種間污染而存在廣泛爭論?；谝陨项I域內存在的諸多問題，我們利用多組學技術手段評估并開發(fā)出一種或多種可作為蛋白質組標目前國內外均無相關的標準流程，各蛋白質組學研究單位處于各自為戰(zhàn)的狀態(tài)。流程本標準對樣品采集、處理、運輸、質控和檢測以及數(shù)據(jù)產(chǎn)生、質量評估和數(shù)據(jù)分析全流程進行標準化和規(guī)范化。該標準的特點是：流程標準化，可應對各種類型樣品蛋白質提取和制備需求，同時保持結果的重現(xiàn)性，對樣品保存運輸?shù)囊蟮?；開發(fā)出了具有極高蛋白質組穩(wěn)定性且可穩(wěn)定傳代的蛋白質組標準品細胞株：MHCC97H，可用于監(jiān)控實驗流程或本標準參加起草單位：暨南大學、華南理工大學、北京師范大學、中國科學院大連化學物理研究所、福建農林大學、福建省婦幼保健院、上海易算生物科技有限公司、布魯克本標準主要起草人：張弓、陳洋、余卓、盧少華、趙晶、李亞星、范小路、杜紅麗、參加單位工作分配：深圳承啟生物科技有限公司負責標準方案的制定及網(wǎng)頁發(fā)布；深圳承啟生物科技有限公司、暨南大學、華南理工大學、中國科學院大連化學物理研究所、北京師范大學、福建農林大學、福建省婦幼保健院、上海易算生物科技有限公司和布魯克生物科技有限公司參與了標準方案的實驗測試和質量評估；暨南大學、深圳承啟生物科技有限公司進行了標準起草和編制說明編寫，其他參與單位對標準各個版本的全部內容提出42019年1月至2019年6月，標準起草單位組織相關技術人員對標準項目進行了預研，課題組成員廣泛收集了國內外基于質譜的定量蛋白質組技術的應用現(xiàn)狀及技術發(fā)展趨勢相關2019年7月至2022年4月，標準起草單位對標準草案進行實驗驗證和技術論證并確立了基于質譜的定量蛋白質組技術從采樣、前處理、運輸、質控和檢測以及數(shù)據(jù)產(chǎn)生、質量評估和數(shù)據(jù)分析全流程，形成了《基于質譜的定量蛋白質組學技術規(guī)程》的初稿，并于2023（/Resources/omicsSt2022年8月，國家衛(wèi)生健康委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心組織專家對本標準流程初稿進行評審，參會專家做“基本完成主要相關考核指標”的評價，建議進一步加強相關數(shù)據(jù)2022年9月至11月，編制組針對收集的意見，對標準進行了補充和完善。包括：1）增加了蛋白質提取質量檢測標準；2）增加了使用MHCC97H標準品及標準數(shù)據(jù)集進行數(shù)據(jù)質量控制的內容；3）在暨南大學、華南理工大學、北京師范大學和布魯克生物科技有限公司2022年12月，向廣東省科技創(chuàng)新監(jiān)測研究中心組織的專家組進行總結報告，專家組考察了標準實施場地，審閱了相關資料并進行了咨詢。項目開發(fā)技術已在多家機構推廣應用，本標準由深圳承啟生物科技有限公司提出，由暨南大學和深圳承啟生物科技有限公司主編，其他單位共同參與起草，于2023年9月提交團體標準《基于質譜的定量蛋白質組學5技術規(guī)程》的立項申請書，經(jīng)中國國際科技促進會標準化工作委員會及相關專家技術審核，2024年1月，中國國際科技促進會標準化工作委員會完成了對本標準內容的審核并提出對格式重排和規(guī)范書寫的意見，編制組進一步參考標準書寫規(guī)范，修改和完善了標準文本內容，形成了《基于質譜的定量蛋白質組技術規(guī)程》團體標準征求意見稿和團體標準編2024年2月，本標準由中國國際科促會標準化工作委員會，在全國團體標準信息平臺二、標準編制原則、主要內容及其確定依據(jù)，修訂標準時，還包括修訂前后本標準的制定工作遵循“先進性、適用性、可操作性、實用性、規(guī)范性”的原則，依63.1蛋白質組標準流程可極大提高大腸桿菌蛋白組的重復性本項目前期已初步建立蛋白質組的制備分析全流程，并已研發(fā)獲得極為穩(wěn)定的蛋白質標準品，據(jù)此，我們利用前期研究成果進一步驗證流程和標準品的穩(wěn)健性。細菌中半數(shù)以上的蛋白質編碼基因是由兩個或兩個以上的基因組成的多順反子操縱子所組成。操縱子組織是否維持操縱子內基因的化學計量表達仍有爭議。在本研究中，我們進行了一項無標記、與數(shù)據(jù)無關的采集超反應監(jiān)測質譜(HRM-MS)實驗，以定量指數(shù)期的大腸桿菌蛋白質組，并順反子操縱子。我們發(fā)現(xiàn)翻譯調控在很大程度上有助于蛋白質組的復雜性:對于化學計量，較短的操縱子往往比較長的操縱子受到更嚴格的控制；主要編碼復合物的操縱子比主要編碼代謝途徑的操縱子更嚴格地控制化學計量?；蜷g隔(一個操縱子中相鄰基因之間的距離)可以作為化學計量的調節(jié)因子。催化效率可能是一個操縱子編碼的酶的差異表達的驅動力。這些結果說明了操縱子調控的多面性:操縱子統(tǒng)一轉錄水平和基因特異性翻譯水平。這種多水平調控通過優(yōu)化代謝途徑的生產(chǎn)力效率和維持不同類型的蛋白質復合物而有益于為了評估HRM-MS方法的定量能力和再現(xiàn)性，我們應用自研標準品對質譜進行標準測7可溶性蛋白進行了兩次生物學重復實驗。當使用先前的鑒定標準(至少一種獨特肽，肽長對幾乎相同的蛋白質進行了定量:僅在一個重復中對少數(shù)蛋白質進行了定量(圖1A)。在嚴格標準下為兩個獨特的肽和至少七個氨基酸的肽長度。即使在嚴格標準下，我們仍以高再893.2翻譯組可作為指導蛋白質組質量控制的獨立數(shù)據(jù)集到目前為止，在質譜蛋白質組鑒定的時候依然有超過一半的譜圖無法被鑒定。開放式搜索（OpenSearch）策略很早就被提出用來解決這一問題。但是OpenSearch的搜索策略的鑒定結果可靠程度一直難以評估，也缺乏一套完整系統(tǒng)的使用手冊。我們提出使用翻譯組測序數(shù)據(jù)作為最小化庫對OpenSe發(fā)現(xiàn)率（SDR）作為參考指標對OpenSearch策略和限制性搜索（NarrowwindowSearch）這對于促進容差搜索策略的發(fā)展有重要意義，并且能幫助我們更好地認識那些無法被鑒定所有RNC-seq都是以非常高的通量下1基酸修飾進行預先的設置，包括固定修飾或者可變修飾。在通常情況下，氨基酸的修飾千變萬化，無法準確地清楚所有的氨基酸修飾的具體情況，那么較為經(jīng)典的做法是對氨基酸進行占比例較大的一些修飾進行預先的設置，例如半胱氨酸的烷基化修飾和蛋氨酸的氧化1僅需要更多的計算也會導致鑒定結果的準確性的下降，因此，我們在這里只進行兩種占比例較大的氨基酸修飾進行預先的設置，分別為半胱氨酸的烷基化修飾和蛋氨酸的氧化修飾。通過不同的修飾設置的組合對相同數(shù)據(jù)集進行Narrowwnce=10ppm我們發(fā)現(xiàn)對于一般的搜庫軟件如pFind，增加可變修飾會使得鑒定結果的開放搜索策略的關鍵是允許更大的母離子質量容差，以耐受由修飾引起的質量偏移。然而，這也將導致允許更多假陽性的副作用。允許較小的母離子容差在理論上應該會降低的較高誤差，因此更嚴格的肽FDR應有助于控制質量。胱氨酸氨基甲酸乙酯化設置為可變修飾還是固定修飾，均可將開兩個搜索引擎獲取的身份信息的一致性反映了身份識別質量的提高。在所有數(shù)據(jù)集中，13.3利用翻譯組發(fā)現(xiàn)隱藏的非編碼基因來源蛋白質組人類基因組上已知大約有5萬個基因，其中約2萬個被標注為可以表達蛋白質的“編碼基因”，而另外3萬個基因被標注為“非編碼基報道中，除了部分非編碼基因可以表達為小肽行使調控功能外，也有個別lncRNA被發(fā)現(xiàn)實際上能翻譯成>50氨基酸的蛋白質，例如CLUU1,ESRG等，問題是，如果這種情況不是個案而是普遍存在的現(xiàn)象，則確實存在部分“編碼基因”被錯誤地標注成了“非編碼基1meprofiling計算模型認為章，僅僅是調整了計算模型，認為lncRNA可能編碼蛋白質，然而其始終拿不出蛋白質實“新蛋白質”，但隨后便被人類蛋白質組組織(HUPO)爆出其分析不合規(guī)范，存在大量的假陽性鑒定，在用較嚴格的標準進行質控后，這些所謂的“新蛋白質證據(jù)”幾乎都被認定為假陽性。因此，如何避免蛋白質組學質譜技術的固有缺陷，提供獨立的蛋白質編碼信息源，正在被翻譯，且可能以經(jīng)典翻譯起始方式翻譯出>50氨基酸的蛋白質。利用目前公認的驗確的細胞定位，功能實驗也證實它們以蛋白質形式（而非RNA形式）行使著明確的生物學11總蛋白質的鳥槍法蛋白質組學分析。我們認為根據(jù)以下標準進行鑒定是有把握的:(I)蛋白括蛋白名稱、唯一肽序列、肽長、搜索引擎，1集方法，包括多反應監(jiān)測(MRM)和平行反應監(jiān)測進行片段化和定量?？赏ㄟ^添加合成肽作為樣品中這些肽的進一步定量的加樣標準來輔助上允許的重標記標準肽。我們可以通過數(shù)據(jù)相關采集(DDA)分析確定313項標準中的206接下來，我們使用含有抗原表位的特異性肽制備了用于鳥槍法MS檢測的四種新蛋白的多克隆抗體。免疫印跡結果顯示，在各種人細胞系和人組織中，所有這些蛋白在預期分確?？贵w的特異性，我們使用體外翻譯的全長蛋白作為陽性對照，從細菌鮑曼不動桿菌和肺炎鏈球菌中提取的總蛋白作為陰性對照(圖513.4全長翻譯組的測序和蛋白質剪切變體的深度鑒定MinION三代測序平臺的三代長讀長測序，產(chǎn)生初始reads平均錯誤率大約為8.47%；對同一樣品進行精度高、短讀長的二代測序，用以對三代序列進行修正。修正后RNC-mRNA全長測序誤差最終控制在約0.61%。該研究實現(xiàn)了翻譯組的三代全長測序，并建立了相關實驗和分析流程。相關成果發(fā)表于FrontiersinMolecular了15131個全長剪切變體序列，其中包體；建立了包含基因剪切變體信息的最小化參考蛋白序列庫，鑒定到6766個來自于已知蛋白的不同全長剪切變體以及50個全新的蛋白剪切變體。該研究高精度地實現(xiàn)了蛋白質剪切變體的大規(guī)模鑒定，完善了相關的實驗流程和分析流程，并發(fā)現(xiàn)了大量可翻譯的新剪1本標準核心起草人張弓研究員，現(xiàn)為暨南大學翻譯組學實驗室負責人。國家優(yōu)青，國家863青年科學家，國家萬人計劃青年拔事，中國分子系統(tǒng)生物學專業(yè)委員會委員。獲美國化學學會頒發(fā)的會員獎。任國際人類蛋白質組計劃（C-HPP）副主席，是中國人在C-HPP中的最高職位。建立了翻譯組學新學科領域，首次實現(xiàn)翻譯組全長測序，將中心法則定量化，對1972年諾貝爾化學獎理論“安芬森原則”作出重大更新，發(fā)現(xiàn)大量“非編碼RNA”可編碼蛋白質（暗蛋白質組）。翻譯張弓研究院研發(fā)了一系列大規(guī)模測序和蛋白質組質譜的基礎算法和實驗策略，建立了第一個全國產(chǎn)化測序分析全流程并規(guī)?；逃?，打破美國壟斷，被新聞聯(lián)播報道。建立核1研究領域一線的代表性高校、科研院所、技術服務及儀器供應商，可為本標準的執(zhí)行和推對基于質譜的定量蛋白質組技術進行調研評估，搜集相關資料及研究結果，結合文獻及眾多科研項目，以及深圳承啟生物科技有限公司內部標準化流程及評估標準，梳理出了具有代表性的關鍵步驟和通用流程。因此本標準規(guī)定了基于質譜的定量蛋白質組檢測的主要內容，主要實驗內容包括了：樣品采集、保存和運輸、蛋白質提取和質控、蛋白質酶解我們首先對數(shù)據(jù)產(chǎn)生的源頭即樣品開始了甄選，在各實驗室，各平臺廣泛使用且容易生產(chǎn)培養(yǎng)的細胞系的基礎上，選擇代次之間穩(wěn)定性最強的細胞株是組學數(shù)據(jù)產(chǎn)出的可靠保障。正常細胞系體外培養(yǎng)傳代次數(shù)有限，因此選擇多種惡性程度強的癌細胞系作為組學數(shù)可重復和可驗證的穩(wěn)定數(shù)據(jù)，這個結果不僅肯定了我們所建立的標準操作程序，還說明了MHCC97H是非常穩(wěn)定的，可以作為標準物質進行長時間生產(chǎn)，可以在各個實驗室廣泛推廣2使用。與此同時通過蛋白質組標準流程，我們對對大腸桿菌全蛋白質組進行了質譜測定。在兩個不同菌株的全蛋白質組兩次生物學重復測定中，實現(xiàn)了99.7%和99.8%的重現(xiàn)性，距離完美重現(xiàn)僅一步之遙。不僅重現(xiàn)性極高，其蛋白質鑒定數(shù)量也創(chuàng)造了大腸桿菌蛋白質在蛋白質組學數(shù)據(jù)質控方面，使用穩(wěn)態(tài)細胞翻譯組數(shù)據(jù)作為“標準答案”來評價開放式搜索蛋白質鑒定結果，質譜搜庫結果中沒有翻譯證據(jù)的蛋白被認為是假陽性蛋白，屬于“可疑鑒定”（SuspiciousIdentifications，SI而利用SI和有翻譯證據(jù)的蛋白質（Translation-supportedIdentifications，TI）則可計算可疑鑒定率（SuspiciousDiscoveryRate，SDR），以此來反映蛋白質的潛在錯誤鑒定率。研究發(fā)現(xiàn)，開放式搜索結果的SDR可達限制性搜索的兩倍甚至更多，強調開放性搜索若不進行有效質量控制難樣水平。對比開放式搜索不同參數(shù)設置下的結果，發(fā)現(xiàn)FDR控制是開放式搜索質控最重要的影響因素，而質量容差值、可變修飾、酶切方式和色譜分離條件并不是影響SDR的主要因素。該研究首次將翻譯組數(shù)據(jù)應用于開放式搜索策略的質控評估中，有效挖掘質譜數(shù)據(jù)此外，我們利用已經(jīng)建立的蛋白質組學標準流程和翻譯組學質控策略，成功發(fā)現(xiàn)疾病、神經(jīng)退行性疾病以及其他的疾病相關，而對他們的功能研究主要的停留在轉錄水平上或者與miRNA相互作用等。然而，我們的研究提供了確切的證據(jù)證明462個lncRNAs可以翻譯成具有功能的新蛋白質，而且數(shù)目可能不止462個，而是會更大。這一成果將推動lncRNAs研究領域從轉錄水平研究進入到蛋白水平的研究，也將會從根本上提高我們對疾病模型研究的認識。我們的研究成果，不僅豐富了人類基因組編碼基因的參考庫，2以上研究成果表明，蛋白質組學的標準操作流程和質控方法可以極大提高基于質譜技三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術經(jīng)濟論證，預期的經(jīng)濟效益、社會效 根據(jù)不同樣品類型和檢測目標準備足量樣品 應選擇溶解性強的蛋白質裂解液裂解樣品，亦可采購樣品溶解效果好、蛋白質提取效率高、酶解及質譜兼容的商品化蛋白質裂解液。為取得最佳的使用效果，可以適當將裂解F。如需檢測磷酸化蛋白，必須加入含磷酸酶抑制劑的蛋白酶抑制劑化合物。裂解樣品的1)常見的動物、植物、真菌等物種，包括人、鼠、水稻、擬南芥、酵母等，應盡量充分2破碎和溶解樣品，但也需要盡可能減少不必要的破碎步驟，以減少樣品損失；蛋白質3)血清、血漿、唾液、尿液、羊水、腦脊液、關節(jié)液等體液類樣品，可不加蛋白質裂解 使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）對樣品進行質檢，將所有蛋白質樣品取等量色，脫色至背景透明無色后使用凝膠成像儀掃描獲得樣品的完整蛋白質組條帶。樣品結果SDS結果/2 器本身固有特性，其在長時間工作后會出現(xiàn)質量精度的偏移如不及時矯正，則會出現(xiàn)信息峰寬能夠得到較好的定性定量效果。肽段碎裂信號的好壞決定了定性結果優(yōu)劣，因此保證iRT標肽的出峰均勻說明色譜流出的一致性較高，保證了定量信息的最高覆蓋及準確性。色譜半峰寬（FWHM）是衡量色譜效能的重要指標，大規(guī)模蛋白質組定性定量檢測中采4.1.1MS1TIC(MS1色譜總離子流)：各樣品在色譜圖梯度內譜峰盡可能的4.2.2MS2TIC(MS2色譜總離子流)：各樣品在色譜圖梯度內譜峰盡可能的4.2.3RTFragmentDistribution(碎片離子保留時間分布)：在色譜圖梯度內不同樣本中鑒定到的碎片離子數(shù)目基本一致。如出現(xiàn)的樣品間峰型基本一致而強度波動較大，24.2.4RTPrecursorDistribution(母離子保留時間分布)：在色譜圖梯度內不同樣4.2.5DeltaRT(保留時間偏差)：通過iRT留時間越符合模型計算，在定量中越可以得到較好的矯正計算結果。DeltaRT/iRT推薦4.2.7Datapointsperpeak(每個峰采集的數(shù)據(jù)點):推薦4.2.8Capacity(色譜峰容量):峰容量圖顯示了超高效液相色譜(UPLC)色譜柱在分成功多肽的平均半峰寬。更高的峰容量代表更窄的色譜峰，也代表了更好的肽分離能力，檢測到的肽段也就越多，通常FWHM會隨著梯度拉長而變寬。對于采用自填柱的色譜，峰：（24.4.1ExperimentIdentificationFrequency(鑒定結果分布)：組內各樣品鑒定數(shù)因此缺失值會相對偏高，其缺失值比例主要取決于樣品情況，其次是整個前處理和質譜流程中的重復性。組內的樣品缺失值比例和分布不應出現(xiàn)太大波動，且可盡可能聚類到一起；4.5.3QuantityCV(變異系數(shù))：用于評估各觀測值變異程度，即組內定量結果的重4.5.4Correlation(相關性)：通常情況下，同一組內樣本重復性越好，相關性就越按照本標準的方法，我們組織實施了關鍵性能指標的試驗項目驗證，實施驗證的內容22評估蛋白通過目標-誘餌庫（Target-decoy）搜庫策略降低鑒定假陽性率，最終得到不同2流程，質控方法如下：采取超濾管酶解標準操作進行實驗，酶解后對肽斷除鹽并進行肽斷DA模式，不分組分。評估蛋白通過目標-誘餌庫（Target-decoy）搜庫策略降低鑒定假陽性率，最終得到不同實驗室對同一樣品的蛋白質定性及定量列表。同一樣品蛋白質在四個實驗室的測試下（暨南大學一個生物學重復，鑒定結果取交集），蛋白質的鑒定數(shù)量相對一致。對四個實驗室蛋白質定量結果進行DDAiBAQ定量一致性測試同實驗室定量重復性布魯克生物科技有限公司的timsTOF的數(shù)字轉換技術，能夠在細胞和組織的定量蛋白質組學分