細(xì)胞培養(yǎng)工作流程樣本

細(xì)胞培養(yǎng)工作流程Vero細(xì)胞復(fù)蘇流程準(zhǔn)備1.1工作地點(diǎn)檢查：檢查臺(tái)面、地面與否干凈，確認(rèn)無(wú)不有關(guān)物品。1.2設(shè)施檢查：確認(rèn)空調(diào)、傳遞窗工作狀態(tài)完好。1.3層流罩準(zhǔn)備：?jiǎn)?dòng)層流罩，觀測(cè)其運(yùn)營(yíng)與否正常，用消毒劑將臺(tái)面、墻面、地面、保護(hù)簾及層流罩內(nèi)設(shè)備進(jìn)行清潔消毒。并運(yùn)營(yíng)30分鐘后開(kāi)始生產(chǎn)操作。1.4操作工具和試劑檢查：檢查本次操作所用滅菌物品外包裝與否嚴(yán)密，與否在效期內(nèi)。檢查本次操作所用溶液/試劑瓶?jī)?nèi)與否有異物，瓶表面與否有裂紋，瓶塞與否松動(dòng)，溶液名稱(chēng)、批號(hào)、數(shù)量、有效期與否符合規(guī)定。合格后用消毒劑擦拭外表面后拿入層流罩。復(fù)蘇、換液用液體：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、慶大霉素、7.5%NaHCO3溶液。1.5復(fù)蘇用水準(zhǔn)備：（1）融化種子用溶液：按1L/1支種子準(zhǔn)備39±1℃含0.1%新潔爾滅溶液。（2）百級(jí)內(nèi)消毒種子用水：1L/1支種子準(zhǔn)備36.5±1℃含0.1%新潔爾滅溶液。1.6操作人員進(jìn)入層流罩：穿一層無(wú)菌連體服并戴無(wú)菌手套，靜止5分鐘后方可操作。1.7溶液使用前解決：輔助人員用止血鉗夾酒精棉球點(diǎn)燃后消毒瓶塞外表面，旋轉(zhuǎn)1周，操作人員將翻塞翻開(kāi)，再用點(diǎn)燃酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。配液配方復(fù)蘇液MEM生長(zhǎng)液名稱(chēng)加入量（ml）含量控制范疇加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液100/300/新生牛血清109%～10%154.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液10.9%～1%30.9%～1%慶大霉素0.10.12%～0.13%0.40.12%～0.13%7.5%NaHCO31.51.5%～1.8%4.51.5%～2%輔助人員將配制所需液體按順序打開(kāi)后放至鹽水瓶架上，操作人員按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一種液后輔助人員應(yīng)及時(shí)用無(wú)菌翻塞將其蓋緊，在其瓶身用記號(hào)筆注明用量、日期等。復(fù)蘇液及生長(zhǎng)液配完后輔助人員及時(shí)用無(wú)菌翻塞將其蓋緊，充分混勻待用。輔助人員打開(kāi)混勻后復(fù)蘇液，放置鹽水瓶架上。操作人員將培養(yǎng)瓶（T175）蓋打開(kāi)，傾斜或直立放置酒精燈附近，將復(fù)蘇液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4ml/cm2），擰緊瓶蓋并放在恒溫室待用。種子支領(lǐng)根據(jù)種子庫(kù)管理規(guī)定進(jìn)行支領(lǐng)，根據(jù)生產(chǎn)指令按數(shù)量支領(lǐng)。本操作規(guī)格按復(fù)蘇1支細(xì)胞種子到1個(gè)T75cm2瓶規(guī)定各項(xiàng)操作。若支領(lǐng)數(shù)量變化培養(yǎng)瓶面積按比例調(diào)節(jié)，后續(xù)操作各項(xiàng)用量按比例調(diào)節(jié)。種子速溶種子庫(kù)管理員從細(xì)胞庫(kù)剛?cè)〕黾?xì)胞種子時(shí)，在液氮罐頸部停留幾秒，核對(duì)所支領(lǐng)種子標(biāo)簽內(nèi)容與細(xì)胞種子申領(lǐng)單上內(nèi)容與否一致。核對(duì)無(wú)誤后，迅速所有浸入39±1℃含0.1%新潔爾滅溶液（1000ml/支種子），順時(shí)針不斷搖動(dòng)直至融化，將每次速融時(shí)間控制在1分鐘內(nèi)。然后用75%酒精消毒容器外表面，放置在傳遞窗內(nèi)風(fēng)淋2分鐘。同步立即告知細(xì)胞區(qū)人員將種子從傳遞窗取走。迅速傳遞并浸入百級(jí)內(nèi)36.5±1℃含0.1%新潔爾滅溶液中，百級(jí)內(nèi)操作人員取出擦干。移種操作人員左手拿凍存管，右手打開(kāi)，用1ml吸管將融化后細(xì)胞種子吸出，緩慢滴加到1個(gè)T75cm2培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋。培養(yǎng)輔助人員在培養(yǎng)瓶上注明細(xì)胞名稱(chēng)、批號(hào)、代次、復(fù)蘇日期、瓶編號(hào)等信息后及時(shí)放置恒溫室靜置培養(yǎng)。24小時(shí)內(nèi)（細(xì)胞貼壁80%）進(jìn)行換液。清場(chǎng)將廢液倒入下水道，廢物、待清洗物品由傳遞窗傳到粗洗間，層流罩內(nèi)用75%酒精消毒，再用純水清潔整個(gè)房間。復(fù)蘇后觀測(cè)第二天觀測(cè)培養(yǎng)液顏色（PH）與否正常，在顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)數(shù)量。9、換液換液前準(zhǔn)備與復(fù)蘇前相似。觀測(cè)培養(yǎng)液顏色與否正常，有無(wú)漏液，看細(xì)胞與否生長(zhǎng)良好。用消毒劑擦拭表面后放入層流罩，操作人員進(jìn)入層流罩換好無(wú)菌連體服后靜止5分鐘方可操作。輔助人員用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人員將翻塞翻開(kāi)，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人員右手拿住培養(yǎng)瓶底部，左手?jǐn)Q開(kāi)瓶蓋，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使上清液沿其頂面流至廢液缸。輔助人員打開(kāi)裝生長(zhǎng)液瓶口，并將其在火焰外焰旋轉(zhuǎn)1圈后，放置鹽水瓶架上待用。操作人員將培養(yǎng)瓶蓋擰松放置酒精燈附近，將生長(zhǎng)液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4ml/cm2）。擰緊瓶口，平放到恒溫室培養(yǎng)。最后按規(guī)定清場(chǎng)細(xì)胞傳代流程準(zhǔn)備1.1工作地點(diǎn)檢查：檢查臺(tái)面、地面與否干凈，確認(rèn)無(wú)不有關(guān)物品。1.2設(shè)施檢查：確認(rèn)空調(diào)、蠕動(dòng)泵工作狀態(tài)完好。1.3層流罩準(zhǔn)備：?jiǎn)?dòng)層流罩，觀測(cè)其運(yùn)營(yíng)與否正常，用消毒劑將臺(tái)面、墻面、地面、保護(hù)簾及層流罩內(nèi)設(shè)備進(jìn)行清潔消毒。并運(yùn)營(yíng)30分鐘后開(kāi)始生產(chǎn)操作。1.4操作工具和試劑檢查：檢查本次操作所用滅菌物品外包裝與否嚴(yán)密，與否在效期內(nèi)。檢查本次操作所用溶液/試劑瓶?jī)?nèi)與否有異物，瓶表面與否有裂紋，瓶塞與否松動(dòng)，溶液名稱(chēng)、批號(hào)、數(shù)量、有效期與否符合規(guī)定。合格后用消毒劑擦拭外表面后拿入層流罩。細(xì)胞傳代用液體：MEM液，新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、慶大霉素、7.5%NaHCO3溶液、0.01MPBS溶液、細(xì)胞消化液（含0.25%胰蛋白酶溶液）。傳代1操作2.1配液配方MEM生長(zhǎng)液名稱(chēng)加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液400/新生牛血清204.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液40.9%～1%慶大霉素0.50.12%～0.13%7.5%NaHCO381.8%～2%向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、慶大霉素、7.5%NaHCO3。輔助人員蓋緊瓶口，在瓶身用記號(hào)筆注明用量、日期等，混勻待用。注意事項(xiàng)：無(wú)菌吸管不得碰觸除尾部以外任何地方，否則棄用。2.2洗滌輔助人員將PBS打開(kāi)，用酒精燈將瓶口消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將培養(yǎng)瓶打開(kāi)，將上清液沿培養(yǎng)瓶上表面倒至廢液桶。然后在酒精燈旁將PBS倒入培養(yǎng)瓶，倒入量：30ml/T75cm2瓶。（加量：0.2～0.4ml/cm2）蓋上蓋子，PBS交由輔助人員蓋緊塞子，標(biāo)記用量、日期。操作人員將培養(yǎng)瓶先后左右晃動(dòng)一次后倒掉PBS。注意事項(xiàng)：倒廢液時(shí)注意不能污染瓶口。2.3消化輔助人員將消化液瓶口打開(kāi)，將瓶口用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。同步將培養(yǎng)瓶蓋子打開(kāi)交由操作人員。操作人員用吸管吸3ml細(xì)胞消化液到培養(yǎng)瓶底，（消化液加量：0.02~0.04ml/cm2）蓋好瓶蓋。輔助人員將消化液蓋好，標(biāo)記用量、日期。操作人員翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞消化液鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞面，靜置待細(xì)胞間質(zhì)疏松后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液鹽沿培養(yǎng)瓶上面倒入廢液缸中，蓋緊瓶蓋置36.5±0.5℃恒溫或室溫繼續(xù)作用5～10分鐘。注意事項(xiàng)：細(xì)胞培養(yǎng)瓶開(kāi)蓋后最佳要45°傾斜，操作完畢后立即蓋好蓋子。室溫消化細(xì)胞時(shí)肉眼觀測(cè)細(xì)胞面呈針眼狀時(shí)應(yīng)倒掉細(xì)胞消化液，避免細(xì)胞脫落。2.4懸液制備輔助人員將生長(zhǎng)液打開(kāi)，用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將消化好培養(yǎng)瓶打開(kāi)，用吸管吸10ml至T75cm2瓶中，用吸管沖洗下細(xì)胞，吹打分散，制成均勻細(xì)胞懸液。注意事項(xiàng)：分散細(xì)胞要充分，肉眼觀測(cè)細(xì)胞無(wú)團(tuán)塊方可。2.5分種操作人員將細(xì)胞懸液平均分種至2個(gè)T175cm2培養(yǎng)瓶中，，加生長(zhǎng)液至75ml。2.6培養(yǎng)輔助人員將細(xì)胞批號(hào)、代次、傳代比例、瓶編號(hào)、日期標(biāo)記在2個(gè)T175cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶上，將接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置恒溫室靜置培養(yǎng)。2.7清場(chǎng)按規(guī)定清場(chǎng)2.8觀測(cè)每天觀測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)3、傳代2操作3.1配液配方MEM生長(zhǎng)液名稱(chēng)加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液600/新生牛血清304.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液60.9%～1%慶大霉素0.750.12%～0.13%7.5%NaHCO3121.8%～2%向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、慶大霉素、7.5%NaHCO3。輔助人員蓋緊瓶口，在瓶身用記號(hào)筆注明用量、日期等，混勻待用。注意事項(xiàng)：無(wú)菌吸管不得碰觸除尾部以外任何地方，否則棄用。3.2洗滌輔助人員將PBS打開(kāi)，用酒精燈將瓶口消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將培養(yǎng)瓶打開(kāi)，將上清液沿培養(yǎng)瓶上表面倒至廢液桶。然后在酒精燈旁將PBS倒入培養(yǎng)瓶，倒入量：60ml/T175cm2瓶。（加量：0.2～0.4ml/cm2）蓋上蓋子，PBS交由輔助人員蓋緊塞子，標(biāo)記用量、日期。操作人員將培養(yǎng)瓶先后左右晃動(dòng)一次后倒掉PBS。注意事項(xiàng)：倒廢液時(shí)注意不能污染瓶口。3.3消化輔助人員將消化液瓶口打開(kāi)，將瓶口用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。同步將培養(yǎng)瓶蓋子打開(kāi)交由操作人員。操作人員用吸管吸7ml細(xì)胞消化液到培養(yǎng)瓶底，（消化液加量：0.02~0.04ml/cm2）蓋好瓶蓋。輔助人員將消化液蓋好，標(biāo)記用量、日期。操作人員翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞消化液鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞面，靜置待細(xì)胞間質(zhì)疏松后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液鹽沿培養(yǎng)瓶上面倒入廢液缸中，蓋緊瓶蓋置36.5±0.5℃恒溫或室溫繼續(xù)作用5～10分鐘。注意事項(xiàng)：細(xì)胞培養(yǎng)瓶開(kāi)蓋后最佳要45°傾斜，操作完畢后立即蓋好蓋子。室溫消化細(xì)胞時(shí)肉眼觀測(cè)細(xì)胞面呈針眼狀時(shí)應(yīng)倒掉細(xì)胞消化液，避免細(xì)胞脫落。3.4懸液制備輔助人員將生長(zhǎng)液打開(kāi)，用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將消化好培養(yǎng)瓶打開(kāi)，將生長(zhǎng)液直接倒入至T175cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管沖洗下細(xì)胞，吹打分散，制成均勻細(xì)胞懸液。注意事項(xiàng)：分散細(xì)胞要充分，肉眼觀測(cè)細(xì)胞無(wú)團(tuán)塊方可。3.5分種操作人員將細(xì)胞懸液平均分種至8個(gè)T175cm2培養(yǎng)瓶中，加生長(zhǎng)液至75ml。3.6培養(yǎng)輔助人員將細(xì)胞批號(hào)、代次、傳代比例、瓶編號(hào)、日期標(biāo)記在細(xì)胞培養(yǎng)瓶上，將接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置恒溫室靜置培養(yǎng)。3.7清場(chǎng)按規(guī)定清場(chǎng)3.8觀測(cè)每天觀測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)傳代3操作4.1配液配方MEM生長(zhǎng)液名稱(chēng)加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液/新生牛血清1004.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液200.9%～1%慶大霉素2.50.12%～0.13%7.5%NaHCO3401.8%～2%輔助人員先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，擰松桶蓋，操作人員解開(kāi)線(xiàn)繩將外包裝紙向外翻至露出傳液瓶塞頂部位置右手拿住鏈接空氣過(guò)濾器及出液口管道，左手將包裝袋松動(dòng)，一次性取出管道并放入MEM桶中，輔助人員需要將點(diǎn)燃酒精棉球始終放在桶口附近創(chuàng)造無(wú)菌環(huán)境。輔助人員將所需溶液依次打開(kāi)，操作人員用配液直管將溶液吸入MEM桶內(nèi)，加完后混勻待用。然后拔掉直管，將帶細(xì)胞工廠接頭不銹鋼管道與之相連，待用。注意事項(xiàng)：無(wú)菌吸管使用過(guò)程中禁止接觸其她部位（除吸管后端任何位置），如不慎遇到應(yīng)及時(shí)廢棄。安裝管道過(guò)程中，如管道不慎遇到其她部位應(yīng)及時(shí)廢棄。4.2洗滌輔助人員將PBS打開(kāi)，用酒精燈將瓶口消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將培養(yǎng)瓶打開(kāi)，將上清液沿培養(yǎng)瓶上表面倒至廢液桶。然后在酒精燈旁將PBS倒入培養(yǎng)瓶，倒入量：60ml/T175cm2瓶。（加量：0.2～0.4ml/cm2）蓋上蓋子，PBS交由輔助人員蓋緊塞子，標(biāo)記用量、日期。操作人員將培養(yǎng)瓶先后左右晃動(dòng)一次后倒掉PBS。注意事項(xiàng)：倒廢液時(shí)注意不能污染瓶口。4.3消化輔助人員將消化液瓶口打開(kāi)，將瓶口用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。同步將培養(yǎng)瓶蓋子打開(kāi)交由操作人員。操作人員用吸管吸7ml細(xì)胞消化液到培養(yǎng)瓶底，（消化液加量：0.02~0.04ml/cm2）蓋好瓶蓋。輔助人員將消化液蓋好，標(biāo)記用量、日期。操作人員翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞消化液鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞面，靜置待細(xì)胞間質(zhì)疏松后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液鹽沿培養(yǎng)瓶上面倒入廢液缸中，蓋緊瓶蓋置36.5±0.5℃恒溫或室溫繼續(xù)作用5～10分鐘。注意事項(xiàng)：細(xì)胞培養(yǎng)瓶開(kāi)蓋后最佳要45°傾斜，操作完畢后立即蓋好蓋子。室溫消化細(xì)胞時(shí)肉眼觀測(cè)細(xì)胞面呈針眼狀時(shí)應(yīng)倒掉細(xì)胞消化液，避免細(xì)胞脫落。4.4懸液制備輔助人員將生長(zhǎng)液打開(kāi)，用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將消化好培養(yǎng)瓶打開(kāi)，將生長(zhǎng)液直接倒入至T175cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管沖洗下細(xì)胞，吹打分散，制成均勻細(xì)胞懸液。然后將8個(gè)培養(yǎng)瓶細(xì)胞合并到1個(gè)T175cm2瓶中。用傳液管道吸入MEM中，混勻待用。注意事項(xiàng)：分散細(xì)胞要充分，肉眼觀測(cè)細(xì)胞無(wú)團(tuán)塊方可。4.5分種輔助人員將10層細(xì)胞工廠蓋子打開(kāi)，操作人員將連接管道出液口處細(xì)胞工廠轉(zhuǎn)接頭無(wú)菌取出后與細(xì)胞工廠左端口對(duì)接，并將細(xì)胞工廠橫放在操作臺(tái)上，同步將細(xì)胞工廠右端蓋擰松。輔助人員真空泵打氣端與管道空氣濾器相連，啟動(dòng)真空泵將生長(zhǎng)液打入細(xì)胞工廠內(nèi)。結(jié)束后，操作人員用止血鉗將管道夾緊后將細(xì)胞工廠右端蓋擰緊，平衡后把細(xì)胞工廠向上直立，再取下左端連接細(xì)胞工廠管道轉(zhuǎn)接頭交輔助人員，用蓋子蓋緊右側(cè)細(xì)胞工廠接口，將細(xì)胞工廠放平。然后將管道內(nèi)殘夜打入準(zhǔn)備好T25cm2培養(yǎng)瓶中作對(duì)照。注意事項(xiàng)：注意打氣過(guò)程中管道不要崩開(kāi)。4.6培養(yǎng)輔助人員將細(xì)胞批號(hào)、代次、傳代比例、瓶編號(hào)、日期標(biāo)記在細(xì)胞工廠上，放置到恒溫室靜置培養(yǎng)。4.7清場(chǎng)4.8觀測(cè)5、傳代4操作5.1配液配方MEM生長(zhǎng)液名稱(chēng)加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液8000/新生牛血清4004.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液800.9%～1%慶大霉素100.12%～0.13%7.5%NaHCO31601.8%～2%輔助人員先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，擰松桶蓋，操作人員解開(kāi)線(xiàn)繩將外包裝紙向外翻至露出傳液瓶塞頂部位置右手拿住鏈接空氣過(guò)濾器及出液口管道，左手將包裝袋松動(dòng)，一次性取出管道并放入MEM桶中，輔助人員需要將點(diǎn)燃酒精棉球始終放在桶口附近創(chuàng)造無(wú)菌環(huán)境。輔助人員將所需溶液依次打開(kāi)，操作人員用配液直管將溶液吸入MEM桶內(nèi)，加完后混勻待用。然后拔掉直管，將帶細(xì)胞工廠接頭不銹鋼管道與之相連，待用。注意事項(xiàng)：操作人員取管道時(shí)連接MEM液桶內(nèi)管道不能遇到包裝紙外部，將管道放入MEM液桶內(nèi)時(shí)，伸入桶內(nèi)管道不能遇到MEM液桶外部，否則此管道停止使用。5.2洗滌輔助人員將PBS打開(kāi)，用火焰消毒瓶口，放到鹽水瓶架上待用。操作人員將細(xì)胞工廠內(nèi)上清倒入廢液桶，然后將細(xì)胞工廠平放在桌面上，倒入PBS，加入量：1L/CF10（0.2～0.4ml/cm2），蓋上蓋子，平衡PBS液后放平，先后左右搖晃幾次，倒掉。注意事項(xiàng)：千萬(wàn)不能污染細(xì)胞工廠瓶口5.3消化輔助人員打開(kāi)消化液瓶口，用火焰消毒后放在鹽水瓶架上待用。操作人員將細(xì)胞工廠平放在桌面上，倒入消化液，加入量：200ml/CF10(0.02~0.04ml/cm2)。平衡后放平，搖晃細(xì)胞工廠，使消化液鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞面，帶細(xì)胞間質(zhì)疏松后倒掉，蓋好蓋子放到恒溫室5-10分鐘。注意事項(xiàng):室溫消化細(xì)胞時(shí)肉眼觀測(cè)細(xì)胞面呈針眼狀時(shí)應(yīng)倒掉細(xì)胞消化液，避免細(xì)胞脫落。5.4懸液制備當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始脫落時(shí)，將細(xì)胞工廠豎立在臺(tái)面上，把連接生長(zhǎng)液桶細(xì)胞工廠接頭與細(xì)胞工廠相連，擰松右側(cè)蓋子，放到細(xì)胞工廠，啟動(dòng)真空泵，打入1L生長(zhǎng)液停止。蓋好蓋子，輔助人員雙手握住細(xì)胞工廠，上下小幅度迅速震蕩，使細(xì)胞充分分散。然后連接生長(zhǎng)液，將細(xì)胞懸液打入生長(zhǎng)液桶內(nèi)，混勻待用。注意事項(xiàng)：搖細(xì)胞工廠時(shí)要迅速有力度，使細(xì)胞充分分散。5.5分種將細(xì)胞懸液分4份均勻打入4個(gè)10層細(xì)胞工廠，并將殘液打入培養(yǎng)瓶中作對(duì)照。5.6培養(yǎng)輔助人員將細(xì)胞批號(hào)、代次、傳代比例、瓶編號(hào)、日期標(biāo)記在細(xì)胞工廠上，放置到恒溫室靜置培養(yǎng)。5.7清場(chǎng)5.8觀測(cè)6、傳代5操作6.1配液配方MEM生長(zhǎng)液名稱(chēng)加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液3/新生牛血清16004.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液3200.9%～1%慶大霉素400.12%～0.13%7.5%NaHCO36401.8%～2%輔助人員先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，擰松桶蓋，操作人員解開(kāi)線(xiàn)繩將外包裝紙向外翻至露出傳液瓶塞頂部位置右手拿住鏈接空氣過(guò)濾器及出液口管道，左手將包裝袋松動(dòng)，一次性取出管道并放入MEM桶中，輔助人員需要將點(diǎn)燃酒精棉球始終放在桶口附近創(chuàng)造無(wú)菌環(huán)境。PBS、消化液管道均按此辦法安裝。輔助人員將所需溶液依次打開(kāi)，操作人員用配液直管將溶液吸入MEM桶內(nèi)，加完后混勻待用。然后拔掉直管，將帶細(xì)胞工廠接頭不銹鋼管道與之相連，待用。注意事項(xiàng)：操作人員取管道時(shí)連接桶內(nèi)管道不能遇到包裝紙外部，將管道放入桶內(nèi)時(shí)，伸入桶內(nèi)管道不能遇到桶外部，否則此管道停止使用。6.2洗滌輔助人員將細(xì)胞工廠上清倒入廢液桶，交由操作人員與PBS管道相連，用真空泵打入1LPBS溶液，蓋好蓋子，搖晃幾次后倒掉。注意事項(xiàng)：千萬(wàn)不能污染細(xì)胞工廠瓶口6.3消化輔助人員打開(kāi)消化液瓶口，用火焰消毒后放在鹽水瓶架上待用。操作人員將細(xì)胞工廠平放在桌面上，倒入消化液，加入量：200ml/CF10(0.02~0.04ml/cm2)。平衡后放平，搖晃細(xì)胞工廠，使消化液鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞面，帶細(xì)胞間質(zhì)疏松后倒掉，蓋好蓋子放到恒溫室5-10分鐘。注意事項(xiàng):室溫消化細(xì)胞時(shí)肉眼觀測(cè)細(xì)胞面呈針眼狀時(shí)應(yīng)倒掉消化液，避免細(xì)胞脫落。6.4懸液制備當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始脫落時(shí)，將細(xì)胞工廠豎立在臺(tái)面上，把連接生長(zhǎng)液桶細(xì)胞工廠接頭與細(xì)胞工廠相連，擰松右側(cè)蓋子，放到細(xì)胞工廠，啟動(dòng)真空泵，打入1L生長(zhǎng)液停止。蓋好蓋子，輔助人員雙手握住細(xì)胞工廠，上下小幅度迅速震蕩，使細(xì)胞充分分散。然后連接生長(zhǎng)液，將細(xì)胞懸液打入生長(zhǎng)液桶內(nèi)，混勻待用。注意事項(xiàng)：搖細(xì)胞工廠時(shí)要迅速有力度，使細(xì)胞充分分散。5.5分種將細(xì)胞懸液打入4個(gè)10層細(xì)胞工廠和3個(gè)40層細(xì)胞工廠，并將殘液打入培養(yǎng)瓶中作對(duì)照。5.6培養(yǎng)輔助人員將細(xì)胞批號(hào)、代次、傳代比例、瓶編號(hào)、日期標(biāo)記在細(xì)胞工廠上，放置到恒溫室靜置培養(yǎng)。5.7清場(chǎng)5.8觀測(cè)傳代6操作7.1配液配方MEM生長(zhǎng)液名稱(chēng)加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液96000/新生牛血清48004.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液9600.9%～1%慶大霉素1200.12