SN 1679-2005動物邊蟲病微量補體結(jié)合試驗操作規(guī)程

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準動物邊蟲病微量補體結(jié)合試驗操作規(guī)程2005-09-30發(fā)布I本標準由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口動物邊蟲病微量補體結(jié)合試驗操作規(guī)程2.2CFT補體結(jié)合試驗3材料與試劑3.2試驗材料血清類別滅能溫度/℃滅能時間/min羊馬驢、騾黃牛、水牛、豬駱駝3.3.3.2紅細胞洗滌用VBS將紅細胞離心洗滌三次，每次2500r/min,離心10min。洗滌后立即配制3%綿羊紅細胞懸液或保存于4℃~8℃冰箱備用。3.3.3.3制備3%綿羊紅細胞懸浮液]2因所用抗原、血清、補體和溶血素均為無色液體，所以用VBS代替。血紅素為3%的紅細胞溶4.1.3標準比色孔的配制標準比色孔的配制見表2?？滋?234567890血紅素/μL03%紅細胞/μL50VBS/μL溶血素稀釋見表3表3溶血素稀釋稀釋度溶血素量/mL生理鹽水量/ml溶血素原液0.21/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素0.51/600溶血素1.0注：如果溶血素是加等量甘油保存，則溶血素原液所需量加倍，并相應(yīng)減少生理鹽水量；若溶血素效價高可適當(dāng)提高稀釋倍數(shù)。4.2.2測定溶血素效價溶血素效價測定見表4。3孔號123456789溶血素稀釋倍數(shù)對照2稀釋的溶血素/μL—1:20補體/μL—VBS/μL3%綿羊紅細胞懸液混勻，室溫30min,1000r/min離心10min,與標準溶血孔對比判定結(jié)果結(jié)果(例)-—+十十十十注：對照1:對照2對照3十十十十為1:100溶血素對照。:為補體對照。:為紅細胞對照。:75%不溶血。:50%不溶血。;25%不溶血。:100%溶血。以出現(xiàn)50%溶血的溶血素最高稀釋倍數(shù)為一個溶血單位，如第7孔，溶血素的稀釋倍數(shù)為1:800,正式試驗時溶血素用2個單位，即800÷2=400,因此正式試驗時，溶血素作1:400稀釋。4.3補體效價測定4.3.1試驗當(dāng)天開啟補體，解凍，若是凍干的補體需加定量的蒸餾水復(fù)原，若為新鮮豚鼠血清，則直接稀釋。4.3.2用VBS先將補體作1:50稀釋，按表5測定補體效價(根據(jù)補體效價可適當(dāng)改變其稀釋度)。表5補體效價測定孔號1234567對照1:50補體/μL—VBS/μL致敏紅細胞/μL混勻，室溫30min,1000r/min離心10min。結(jié)果+++十十十十十+十+十十十十注：+++十：100%不溶血十十+:75%不溶血。十十:50%不溶血，十:25%不溶血。:100%溶血。以引起50%溶血的最小補體量為一個單位，正式試驗使用4個單位。上述結(jié)果的一個補體單位為20μL,按式(1)計算：式中：X——配制4個單位補體所需補體原液的稀釋倍數(shù)；4a——滴定時補體稀釋倍數(shù)；k測出的1個單位補體用量)正式試驗時每孔補體用量。計算結(jié)果：X=15.6,即補體作1:15.6倍稀釋，25μL體積中含有4個補體單位。4.4抗原效價的測定4.4.1將抗原和陽性血清分別作2倍系列稀釋。4.4.2方陣試驗補體、溶血素按前面試驗的結(jié)果稀釋?？乖r測定見表6。表6抗原效價測定表孔號12345678抗原稀釋倍數(shù)對照抗原量/μL—陽性血清稀釋ABCDE陰性血清/μLF4單位補體/μL混勻，室溫1.5h致敏紅細胞/μL混勻，室溫1h1000r/min離心10min,與配制的標準溶血孔對比判定結(jié)果，結(jié)果如表7.表7抗原效價測定示例表孔號1234678抗原稀釋倍數(shù)對照陽性血清稀釋A十十十十++++十十十十++++十十十十+++十十—-B++++十十十+十十十十十十十十+++十十十—C十十++十十十十++++十++十—D++++十十十十++++十十十十十十十E十十十十十十十十十十十十+++++十—1:5陰性血清F-————-——注：++++:100%不溶血。+++:75%不溶血。十+:50%不溶血。+:25%不溶血。:100%溶血。5從表7看出，1:40稀釋的抗原為與陽性血清各稀釋度發(fā)生抑制溶血最強(++++)的最高抗原1要求滅活.孔號123456陽性血清對照陰性血清對照抗原對照補體對照紅細胞對照待檢血清對應(yīng)血清/μL2單位抗原/μL—4單位補體/μL—-VBS/μL混勻，室溫1.5h致敏紅細胞/μL混勻，室溫1h,1000r/min離心10min,判定結(jié)果 陰性血清對照：100%溶血若被檢血清溶血度大于50%,則為陰性；溶血度低于或等于50%,則為陽性。6巴比妥鈉緩沖液(VBS)的配制5,5-二乙基巴比妥鈉氯化鈉6水氯化鎂氯化鈣蒸餾水首先將巴比妥酸溶解到500mL熱的蒸餾水中，加入巴比妥鈉和氯化鈉，然后加水至2000mL混勻。加氯化鎂和氯化鈣，121℃滅菌20min。pH值應(yīng)為7.2,將其按每瓶100mL分裝后于4℃~8℃件用前將所配液體用蒸