SN 1679-2005動(dòng)物邊蟲病微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作規(guī)程

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物邊蟲病微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作規(guī)程2005-09-30發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口動(dòng)物邊蟲病微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作規(guī)程2.2CFT補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)3材料與試劑3.2試驗(yàn)材料血清類別滅能溫度/℃滅能時(shí)間/min羊馬驢、騾黃牛、水牛、豬駱駝3.3.3.2紅細(xì)胞洗滌用VBS將紅細(xì)胞離心洗滌三次，每次2500r/min,離心10min。洗滌后立即配制3%綿羊紅細(xì)胞懸液或保存于4℃~8℃冰箱備用。3.3.3.3制備3%綿羊紅細(xì)胞懸浮液]2因所用抗原、血清、補(bǔ)體和溶血素均為無(wú)色液體，所以用VBS代替。血紅素為3%的紅細(xì)胞溶4.1.3標(biāo)準(zhǔn)比色孔的配制標(biāo)準(zhǔn)比色孔的配制見表2?？滋?hào)1234567890血紅素/μL03%紅細(xì)胞/μL50VBS/μL溶血素稀釋見表3表3溶血素稀釋稀釋度溶血素量/mL生理鹽水量/ml溶血素原液0.21/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素0.51/600溶血素1.0注：如果溶血素是加等量甘油保存，則溶血素原液所需量加倍，并相應(yīng)減少生理鹽水量；若溶血素效價(jià)高可適當(dāng)提高稀釋倍數(shù)。4.2.2測(cè)定溶血素效價(jià)溶血素效價(jià)測(cè)定見表4。3孔號(hào)123456789溶血素稀釋倍數(shù)對(duì)照2稀釋的溶血素/μL—1:20補(bǔ)體/μL—VBS/μL3%綿羊紅細(xì)胞懸液混勻，室溫30min,1000r/min離心10min,與標(biāo)準(zhǔn)溶血孔對(duì)比判定結(jié)果結(jié)果(例)-—+十十十十注：對(duì)照1:對(duì)照2對(duì)照3十十十十為1:100溶血素對(duì)照。:為補(bǔ)體對(duì)照。:為紅細(xì)胞對(duì)照。:75%不溶血。:50%不溶血。;25%不溶血。:100%溶血。以出現(xiàn)50%溶血的溶血素最高稀釋倍數(shù)為一個(gè)溶血單位，如第7孔，溶血素的稀釋倍數(shù)為1:800,正式試驗(yàn)時(shí)溶血素用2個(gè)單位，即800÷2=400,因此正式試驗(yàn)時(shí)，溶血素作1:400稀釋。4.3補(bǔ)體效價(jià)測(cè)定4.3.1試驗(yàn)當(dāng)天開啟補(bǔ)體，解凍，若是凍干的補(bǔ)體需加定量的蒸餾水復(fù)原，若為新鮮豚鼠血清，則直接稀釋。4.3.2用VBS先將補(bǔ)體作1:50稀釋，按表5測(cè)定補(bǔ)體效價(jià)(根據(jù)補(bǔ)體效價(jià)可適當(dāng)改變其稀釋度)。表5補(bǔ)體效價(jià)測(cè)定孔號(hào)1234567對(duì)照1:50補(bǔ)體/μL—VBS/μL致敏紅細(xì)胞/μL混勻，室溫30min,1000r/min離心10min。結(jié)果+++十十十十十+十+十十十十注：+++十：100%不溶血十十+:75%不溶血。十十:50%不溶血，十:25%不溶血。:100%溶血。以引起50%溶血的最小補(bǔ)體量為一個(gè)單位，正式試驗(yàn)使用4個(gè)單位。上述結(jié)果的一個(gè)補(bǔ)體單位為20μL,按式(1)計(jì)算：式中：X——配制4個(gè)單位補(bǔ)體所需補(bǔ)體原液的稀釋倍數(shù)；4a——滴定時(shí)補(bǔ)體稀釋倍數(shù)；k測(cè)出的1個(gè)單位補(bǔ)體用量)正式試驗(yàn)時(shí)每孔補(bǔ)體用量。計(jì)算結(jié)果：X=15.6,即補(bǔ)體作1:15.6倍稀釋，25μL體積中含有4個(gè)補(bǔ)體單位。4.4抗原效價(jià)的測(cè)定4.4.1將抗原和陽(yáng)性血清分別作2倍系列稀釋。4.4.2方陣試驗(yàn)補(bǔ)體、溶血素按前面試驗(yàn)的結(jié)果稀釋?？乖r(jià)測(cè)定見表6。表6抗原效價(jià)測(cè)定表孔號(hào)12345678抗原稀釋倍數(shù)對(duì)照抗原量/μL—陽(yáng)性血清稀釋ABCDE陰性血清/μLF4單位補(bǔ)體/μL混勻，室溫1.5h致敏紅細(xì)胞/μL混勻，室溫1h1000r/min離心10min,與配制的標(biāo)準(zhǔn)溶血孔對(duì)比判定結(jié)果，結(jié)果如表7.表7抗原效價(jià)測(cè)定示例表孔號(hào)1234678抗原稀釋倍數(shù)對(duì)照陽(yáng)性血清稀釋A十十十十++++十十十十++++十十十十+++十十—-B++++十十十+十十十十十十十十+++十十十—C十十++十十十十++++十++十—D++++十十十十++++十十十十十十十E十十十十十十十十十十十十+++++十—1:5陰性血清F-————-——注：++++:100%不溶血。+++:75%不溶血。十+:50%不溶血。+:25%不溶血。:100%溶血。5從表7看出，1:40稀釋的抗原為與陽(yáng)性血清各稀釋度發(fā)生抑制溶血最強(qiáng)(++++)的最高抗原1要求滅活.孔號(hào)123456陽(yáng)性血清對(duì)照陰性血清對(duì)照抗原對(duì)照補(bǔ)體對(duì)照紅細(xì)胞對(duì)照待檢血清對(duì)應(yīng)血清/μL2單位抗原/μL—4單位補(bǔ)體/μL—-VBS/μL混勻，室溫1.5h致敏紅細(xì)胞/μL混勻，室溫1h,1000r/min離心10min,判定結(jié)果 陰性血清對(duì)照：100%溶血若被檢血清溶血度大于50%,則為陰性；溶血度低于或等于50%,則為陽(yáng)性。6巴比妥鈉緩沖液(VBS)的配制5,5-二乙基巴比妥鈉氯化鈉6水氯化鎂氯化鈣蒸餾水首先將巴比妥酸溶解到500mL熱的蒸餾水中，加入巴比妥鈉和氯化鈉，然后加水至2000mL混勻。加氯化鎂和氯化鈣，121℃滅菌20min。pH值應(yīng)為7.2,將其按每瓶100mL分裝后于4℃~8℃件用前將所配液體用蒸