SN-T 3730.7-2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第7部分：水牛成分檢測Real-timePCRmethod2013-11-06發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局ISN/T3730《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法》共分為以—第2部分：狗成分檢測實時熒光PCR法；—第6部分：貓成分檢測實時熒光PCR法；——第8部分：豬成分檢測實時熒光PCR法。本部分為SN/T3730的第7部分。本部分由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出1本部分適用于食品和飼料中水牛成分的定性檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測下列術(shù)語和定義適用于本文件每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)Tris:三(羥甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)Taq:水生棲熱菌(Thermusaquaticu)OD:光密度值(opticaldensity)2名稱序列(5’-3’)目的基因水牛成分5’端引物水牛成分3’端引物水牛成分探針TTCATTGAYCTCCCTGCTCCGGAATAGGCCGGTGAGGATTFAM-ACTTTGGCTCTCTCC-MGB水牛線粒體ATPase8基因6.2十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide,CTAB)。6.3三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]。6.4乙二胺四乙酸二鈉(disodiumethylenediaminetetraaceticacid,Na?EDTA)。6.970%乙醇。6.10CTAB提取緩沖液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl.0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa?EDTA,pH8.0。6.14TE緩沖液(Tris-Cl、EDTA緩沖液):10mmol/LTris-HCl(~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料(某些熒光PCR儀不需要ROX校正)。如果具有等效的3提取緩沖液和10μL蛋白酶K溶液。60℃振蕩過夜后13000g離心10min,轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中。加入750μL三氯甲烷后用力振蕩，13000g離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入2倍體積的CTAB沉淀溶液，室溫靜置60min,13000g離心15min,棄去上清液。加入350μLNaCl溶液將沉淀進行懸浮。再加入350μL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13000g離心10min。轉(zhuǎn)移上清液后加入0.6倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min,13000g離心10min,棄去上清液。加入500μL70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于200μL.TE溶液中。立即使用或-20℃保存?zhèn)溆?。也可用?.2DNA濃度和純度的測定使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)?60和A?8o。c=A×N×50/1000N——核酸稀釋倍數(shù)。60℃1min.40個循環(huán)。8.3.3每個樣品設(shè)置兩個平行的反應(yīng)體系。檢測過程中應(yīng)分別設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。4在符合第9章的情況下，被檢樣品進行檢測時：c)如35.0<Ct值<40.0,則重復(fù)一次。如再次擴增后Ct值仍為<40.0.則判定被檢樣品陽性：如12檢出限本方法所規(guī)定的最低檢出限為1g/kg。5(資料性附錄)水牛的基因擴增靶標參考序列(GenBank:JQ2412