SN-T2632-2010微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)范

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程Technicalcodesforroutinemicrobialcul2010-05-27發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局。1微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物菌種保藏的基本原則和常規(guī)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物菌種常規(guī)保藏工作。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則WS233微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例(國務(wù)院令第424號)人間傳染的病原微生物菌(毒)種保藏機(jī)構(gòu)管理辦法(中華人民共和國衛(wèi)生部令第68號)3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。微生物菌種microbialstrain可培養(yǎng)的具有保藏價值的微生物純培養(yǎng)(株)。微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性狀基本穩(wěn)定，以便于研究、交換和使用的目的。定期移植保藏法periodictransferonagarorinliquidmedium亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，于4℃~6℃進(jìn)行保存并間隔一定時間進(jìn)行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。液體石蠟保藏法preservationunderliquidparaffin亦稱礦物油保藏法，是定期移植保藏法的改良方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基或半固2體培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面或半固體，再通常直立放置于4℃~10℃進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。屬于載體保藏法的一種，是指將培養(yǎng)好的菌種用無菌水制成懸浮液，注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將菌苔或孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使其吸附在載體上，將管中水分抽干后熔封或石蠟封口，置干燥器中于4℃~10℃進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。低溫冷凍保藏法cryopreservation將菌種保藏在-60℃~-8Q.℃低溫冰箱中以減緩其生理活動的一種菌種保藏方法。冷凍干燥保藏法freeze-dexingpreservation亦稱凍干法，是在無菌條件年將欲保藏的菌種制成懸浮液后凍結(jié)，在真空條件下使冰升華直至干4基本原則4.1應(yīng)針對菌種的生物學(xué)性狀酰擇適宜方法進(jìn)行保藏。4.2應(yīng)使保藏的菌種不染雜菌，使退化和死亡降低到最低限度。4.3應(yīng)保證菌種保藏的安全性，不能對周圍環(huán)境造成污染和危害。病原微生物菌(毒)種的保藏應(yīng)遵從GB19489和WS233以及《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》、《人間傳染的病原微生物菌(毒)種應(yīng)生物安全等級的實(shí)驗(yàn)室開展工作，且應(yīng)加強(qiáng)個體防護(hù)和環(huán)境保護(hù)。5方法5.1定期移植保藏法按附錄A的規(guī)定。5.2液體石蠟保藏法按附錄B的規(guī)定。5.3沙土管保藏法按附錄C的規(guī)定。5.4低溫冷凍保藏法按附錄D的規(guī)定。5.5冷凍干燥保藏法按附錄E的規(guī)定。3(規(guī)范性附錄)定期移植保藏法A.1適用范圍本方法廣泛適用于細(xì)菌、放線菌、酵母、真菌等的短期保藏。A.2原理保藏培養(yǎng)基一般含有機(jī)氮多，糖分總量不超2%,既能滿足南種培養(yǎng)時生長繁殖的需要，又可防止因產(chǎn)酸過多而影響菌種性能。大多數(shù)在低磁條件下保減出大大減緩菌種的代謝活動，抑制繁殖速度，降低突變頻率，延長菌種保藏時間。A.3技術(shù)要求異常應(yīng)重新移植培養(yǎng)。A.3.4在傳代過程中，將保藏菌種在營養(yǎng)貧乏和豐富的新鮮培養(yǎng)基中作交替培養(yǎng)，有利于保持菌種的優(yōu)良特性。個對照，檢查無誤后再存放。A.4方法與步驟A.4.1培養(yǎng)基制備按GB/T4789.28和SN/T1538.1執(zhí)行，常用菌種保藏培養(yǎng)基的配方參見附錄F。A.4.2接種A.4.2.1斜面接種A.4.2.1.1點(diǎn)接用接種環(huán)把菌種點(diǎn)接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌(如：毛A.4.2.1.2中央劃線用接種環(huán)從斜面中部自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。4A.4.2.1.3稀波狀蜿蜒劃線法用接種環(huán)從斜面底部自下而上劃稀“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。A.4.2.1.4密波狀蜿蜓劃線法用接種環(huán)從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細(xì)胞，適用于細(xì)菌和酵母菌等。A.4.2.1.5挖塊接種法用接種鏟挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。A.4.2.2穿刺接種用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌苔，從半固體培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底(勿穿到管底),然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細(xì)菌和酵母菌等。A.4.2.3液體接種挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。A.4.3培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至良好狀態(tài)。A.4.4保藏A.4.4.1保藏溫度培養(yǎng)好的菌種于4℃~6℃保存，有些菌種(如：部分弧菌、假單胞菌等)4℃~6℃容易死亡，適于A.4.4.2保藏濕度通常相對濕度為50%～70%。A.4.5定期移植定期移植的間隔時間，因微生物種類不同而異。一般不產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌間隔較短，需1周～2周，最長一個月移植一次。放線菌、酵母菌和絲狀真菌間隔時間較長，每4個月～6個月移植一次即可。對于某些菌種(如：芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病鬟霉等),應(yīng)1個月～3個月移植一次。按相應(yīng)的間隔時間將保藏菌種轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)。5(規(guī)范性附錄)液體石蠟保藏法本方法適用于不能分解液體石蠟的酵母菌、某些細(xì)菌(如：芽孢桿菌屬、乙酸桿菌屬等)和某些絲狀B.2原理液體石蠟保藏法可作為定期移植保藏法的輔助方法。在液體石蠟覆蓋下，菌種的生物代謝受到抑制，細(xì)胞老化被推遲。此方法可阻止氧氣進(jìn)入，使需氧菌不能繼續(xù)生長，也可防止因培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)而引起的菌體死亡，達(dá)到延長菌種保藏時間的目的。B.3.1菌種培養(yǎng)按附錄A的規(guī)定。B.3.3液體石蠟易燃，在操作時注意防止火災(zāi)。造成飛濺。B.3.5保藏場所應(yīng)保持干燥，防止膠塞污染。B.3.6保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時補(bǔ)充無菌液體石蠟。B.4方法與步驟B.4.1液體石蠟的準(zhǔn)備將液體石蠟分裝加膠塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進(jìn)行滅菌：a)121℃濕熱滅菌30min,置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用；b)160℃干熱滅菌2h,冷卻后，經(jīng)無菌檢查后備用。B.4.2斜面培養(yǎng)物的制備按附錄A的規(guī)定。B.4.3灌注石蠟無菌條件下將滅菌的液體石蠟注入剛培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂端1cm～2cm,加膠塞并用固體石蠟封口，使菌種與空氣隔絕。6B.4.4保藏將注入石蠟油的菌種斜面直立存放于低溫(4℃~6℃)干燥處或室溫下保存，見A.4.4.1。保藏時間為2年～10年不等。保藏期間應(yīng)定期檢查活力及雜菌情況。B.4.5恢復(fù)培養(yǎng)7SN/T2632—2010(規(guī)范性附錄)沙土管保藏法C.1適用范圍本方法適用于產(chǎn)孢類放線菌、芽孢桿菌、曲霉屬、青得屬以及少數(shù)酵母(如：隱球酵母和紅酵母等),不適用于病原性真菌的保藏，特別是不適于以圖絲發(fā)育為主的真菌的保題。C.2原理利用細(xì)沙土創(chuàng)造的干燥條件，使那些能產(chǎn)生孢不或芽孢的微生物，在干燥環(huán)境中代謝活動減緩，繁殖速度受到抑制,抵抗力強(qiáng),不易死亡。此方法可減少菌林多變,延長存活時間.C.3技術(shù)要求C.3.1菌種培養(yǎng)按附錄A的規(guī)定。C.4方法與步驟C.4.1沙土管制備將河、海沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質(zhì)，再用80目過篩，去掉細(xì)沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機(jī)物較多可用20%鹽酸表泡。24多后倒去鹽酸，用自來水浸泡數(shù)次至中性，將沙子烘干或曬干。另取來鼓污染的地表以下土壤用100日過篩，自來水洗至中性，烘干。按沙：土=2:1混合均勻，分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃高壓滅菌1h~1.5h,或常壓間歇滅菌3次、每天每次1h。在50℃以下烘干(溫度不宜過高，否則土壤有機(jī)質(zhì)被高溫分解后，產(chǎn)生有害物質(zhì)，影響菌種性能),經(jīng)檢查無微生物生長方可使用。C.4.2斜面培養(yǎng)物的制備按附錄A的規(guī)定。C.4.3制備菌懸液向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入3mL～5ml.無菌水，洗下菌落或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2mL～0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。C.4.4干燥將有菌懸液的沙土管放入底部盛有干燥劑的干燥器內(nèi)，用真空泵抽真空4h,至沙土粒疏散不結(jié)團(tuán)8C.4.5純培養(yǎng)檢查從做好的沙土管中，按10:1比例抽查。無菌條件下用接種環(huán)取出少量沙土粒，接種于適宜的固體C.4.6保藏將純培養(yǎng)檢查合格的沙土管用火焰熔封管口，存放于低溫(4℃~10·℃)或常溫干燥處，定期檢查活力及雜菌情況。用此方法保藏時間為2年～10年不等。9(規(guī)范性附錄)低溫冷凍保藏法D.1適用范圍D.2原理大多數(shù)微生物可在一60℃及以下的低溫中保藏。通過低溫，使微生物代謝活動停止。一般而言，D.3技術(shù)要求D.3.2冷凍保藏時，要掌握好冷凍速度和解凍速度。D.3.3注意低溫冰箱的故障和停電事故，可以在低溫槽內(nèi)留有一定的空間，如果發(fā)生使低溫冰箱溫度變化的情況，可加入干冰以防止培養(yǎng)物融化。D.3.4融化后的菌種不能再用低溫保存，應(yīng)重新移種后再冷凍保藏。D.4方法與步驟D.4.1凍存管的準(zhǔn)備將2.0mL凍存管(圓底硼硅玻璃安瓿管或螺旋式塑料管)清洗干凈，121℃下高壓滅菌15min~20min,備用。也可使用商品化的菌種保存管。注意凍存管不能有裂紋。D.4.2保護(hù)劑的準(zhǔn)備保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇，一般采用無菌的10%～20%甘油或脫脂奶粉，或10%二甲D.4.3培養(yǎng)物的準(zhǔn)備微生物不同的生理狀態(tài)對存活率有影響，一般使用對數(shù)生長中后期培養(yǎng)物。菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法：a)刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；b)接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與等體積的保護(hù)劑混勻后分裝于凍存管內(nèi)，或者用45mm的無菌玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于凍存管內(nèi)；c)將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5mm～10mm),真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；D.4.4冷凍保藏將含菌種的凍存管插入保藏塑料盒中置于-60℃~-80℃低溫冰箱中保藏，保藏期間應(yīng)定期檢查活力及雜菌情況。保藏周期一般1年～5年。D.4.5復(fù)蘇方法從冰箱中取出菌種凍存管，應(yīng)立即置37℃~40℃水浴中輕輕搖動，直到溶化為止。開啟凍存管，將內(nèi)容物移接至適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)。SN/T2632—2010(規(guī)范性附錄)冷凍干燥保藏法E.1適用范圍孢子的絲狀真菌等。E.2原理冷陳干燥保藏法是在低溫、干燥、缺氧條件下保堿菌種。即在低溫條件下快速地將菌種凍結(jié)，使微生物保持完整，然后減壓抽真空使冰升華直至城水干燥，并在成空狀態(tài)密封隔絕空氣，使微生物代謝活E.3技術(shù)要求E.3.1應(yīng)使用冷凍保護(hù)劑，以防止冷凍干燥過程和保存期間微生物的損傷和死亡。E.3.2應(yīng)選用最適條件的培養(yǎng)物，菌齡控制在穩(wěn)定期，此期對外界抵抗能力強(qiáng)，容易忍耐冷凍和于燥的環(huán)境。E.3.3菌懸液濃度要足夠高，以彌補(bǔ)因冷凍干燥過程中部分死亡而造成濃度下降。E.3.4盛裝菌恐液的安溫管應(yīng)盡長冷凍，以防苗本沉淀而或面是液不南勻以及微生物的再次生長或萌發(fā)孢子。E.3.5應(yīng)掌握好冷凍溫度及干燥速度。E.3.6融化后的菌種不能再用低提保仔，應(yīng)重新移種后再凍于保藏。E.4方法與步驟E.4.1安瓿管的準(zhǔn)備選用中性玻璃制作的安瓿管，規(guī)格為8mm×100mm。將安瓿管洗凈，并用2%鹽酸漫泡過夜，用蒸餾水洗干凈后烘干。瓶內(nèi)放入印有菌號和日期的標(biāo)簽，塞上棉塞，121℃滅菌30min后置60℃烘箱中干燥備用。E.4.2保護(hù)劑的準(zhǔn)備保護(hù)劑采用低分子和高分子化合物及一些天然化合物，其中以高分子和低分子化合物混合使用效果最好。冷凍干燥法常用保護(hù)劑及配方見表E.1。表E.1冷凍干燥法常用保護(hù)劑及配方脫脂牛奶脫脂牛奶(或奶粉)20%,110℃滅菌20min脫脂牛奶-谷氨酸鈉脫脂牛奶10%,谷氨酸鈉1%血清馬血清，過濾除菌血清-葡萄糖干燥合劑馬血清300mL,牛肉膏0.5g,蛋白胨0.8g,葡萄糖30g,蒸餾水100mL.0.2μm過濾除菌E.4.3斜面培養(yǎng)物的制備按附錄A的規(guī)定。E.4.4菌懸液的制備在無菌條件下，先將少量滅菌保護(hù)劑加入培養(yǎng)物斜面，輕輕刮下穩(wěn)定期的菌苔或成熟的孢子，制成菌懸液。一般細(xì)菌濃度為102/mL～10°/ml,,孢子濃度為10?/mL以上為宜。用毛細(xì)滴管取0.1mL~0.2ml.菌懸液加入滅菌安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，塞好棉塞。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝時間要短，在1h~2h內(nèi)分裝E.4.5預(yù)凍將裝有菌懸液的安瓿管預(yù)凍2h以上，冷凍溫度達(dá)到-15℃~-20℃即可。E.4.6冷凍干燥到達(dá)冷凍溫度后，立即啟動冷凍真空干燥機(jī)的真空泵，在15min內(nèi)使真空度達(dá)到66.66Pa。真空度上升至13.33Pa以上，升高溫度至室溫(20℃~30℃)。在真空狀態(tài)下，讓安瓿管保存在冷凍真空干燥機(jī)中至少16h,以獲得完全干燥。E.4.7熔封安瓿干燥后，在2.67Pa～4.00Pa的真空度下，將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì)熔封。E.4.8測真空度熔封后的安瓿管采用高頻電火花真空測定儀測定真空度，如管內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色光則符合要求，若是紅色光說明尚未真空。E.4.9保藏安瓿管應(yīng)低溫避光保藏，在4℃~5℃溫度下可保藏5年～10年，室溫下保藏效果不佳，-20℃~-70℃可長期穩(wěn)定保藏。保藏期間應(yīng)定期檢查活力和雜菌情況，一般保存半年、2年、5年、10年分別檢查一次。E.4.10復(fù)蘇方法從冰箱中取出安瓿管，用75%酒精棉球擦拭安瓿管上部，用火焰加熱其頂端，滴少量無菌水至加熱頂端使之破裂，用無菌銼刀或鑷子敲下已破裂的安瓿管頂端，加入0.5mL～1mL無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，用無菌吸管移接到新鮮培養(yǎng)基上作適宜培養(yǎng)。E.4.11冷凍干燥保藏法操作流程分裝安瓿測真空度清洗安瓿圖E.1冷凍干燥保藏法操作流程用于需氧菌的保藏。F.2土浸出液瓊脂F(xiàn).2.1成分蛋白胨用于需氧菌的保藏。F.2土浸出液瓊脂F(xiàn).2.1成分蛋白胨瓊脂土壤浸出液F.2.2制法(資料性附錄)常用菌種保藏培養(yǎng)基F.1營養(yǎng)瓊脂F(xiàn).1.1成分蛋白胨牛肉彎氯化鈉瓊脂gF.1.2制法將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加大一%氫氧化鈉情液約2mL,校正pH至7.2~7.4553首先制備土壤浸出液，即取干燥去雜石的土壤400g加入960mL自來水中，121℃高壓滅菌30min。棉布初濾，再用濾紙過濾。再次121℃滅菌20min。濾液用于配制培養(yǎng)基。濾液中加入蛋白F.2.3用途最宜于芽孢桿菌的保藏。F.3MRS培養(yǎng)基F.3.1成分蛋白胨10.0g..葡萄糖20.0g吐溫-801.0mL;瓊脂150g-蒸餾水F.3.3用途F.4番茄汁培養(yǎng)基F.4.1成分酵母膏碳酸鈣(CaCO?)瓊脂番茄汁濾液(pH7.0)蒸餾水F.4.2制法gíg番茄汁準(zhǔn)液的制法是將新鮮器茄洗凈，切碎(切勿搗碎)被人三角燒瓶，置4℃冰箱8h~12h,取出后用紗布過濾即成。如一次使用不完，可將其置入0飛冰箱，可保存4個月。使用時讓其在常溫下自然溶解。F.4.3用途用于乳酸桿菌的保藏。F.5乙酸桿菌保藏培養(yǎng)基F.5.1成分蛋白胨5g肝浸液碳酸鈣(CaCO?)瓊脂蒸餾水900ml.F.5.2制法肝浸液的制備方法是稱取牛肝，切碎，加水2L,加熱煮沸3h,過濾。乙酸桿菌保藏培養(yǎng)基的制法是將上述所有成分加入燒杯中，加熱溶解后分裝燒瓶，121℃高壓滅菌F.5.3用途用于乙酸桿菌的保藏。F.6高氏合成培養(yǎng)基F.6.1成分可溶性淀粉氯化鈉硝酸鉀硫酸鐵(FeSO?·7H?O)磷酸氫二鉀硫酸鎂(MgSO,·7H?O)瓊脂蒸餾水F.6.2.制法將上述所有成分加入燒杯中，加熱溶解，校正pH7.2～pH7.4。分裝燒瓶，121℃高壓滅菌15min~20min。F.6.3用途用于放線菌的保藏。F.