陳骨和燒骨DNA提取的法醫(yī)學(xué)鑒定探討

1.北京匯正卓越科技有限公司司法鑒定中心，北京102488；2.齊齊哈爾市公安局刑事技術(shù)支隊，黑龍江齊齊哈爾161000；3.北京中一諾達(dá)科技有限公司司法鑒定中心，北京100015；4.北京華大方瑞鑒定技術(shù)有限公司司法鑒定中心，北京101300；5.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014040骨是由骨組織、骨膜和骨髓等構(gòu)成的堅硬器官，在機(jī)體中主要起支持、運(yùn)動和保護(hù)作用，骨中含有大量鈣、磷等礦物質(zhì)。骨組織是骨骼的主體結(jié)構(gòu)，包括骨組織細(xì)胞和骨基質(zhì)。骨基質(zhì)是指鈣化的細(xì)胞外基質(zhì)，包括有機(jī)成分和無機(jī)成分。骨組織細(xì)胞包括成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)主要是由膠原和羥基磷灰石構(gòu)成。骨中30%是由骨細(xì)胞分泌的膠原，65%～75%則是骨骼的支撐結(jié)構(gòu)羥基灰石。骨組織中骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是骨骼DNA的主要來源。由于骨骼組織堅硬，具有良好的抗腐敗、侵蝕、灼燒等功能，是生物個體組織中降解緩慢、抗污染力強(qiáng)的結(jié)構(gòu)，能夠較好保護(hù)生物個體的DNA，即使其他軟組織被完全腐敗、碳化，在骨骼組織中仍可提取DNA檢材。提供骨骼中DNA并進(jìn)行生物信息檢測和比對研究，在當(dāng)今考古、法庭科學(xué)領(lǐng)域中是一項(xiàng)重要的技術(shù)手段。在軟組織不具有提取DNA價值時，可以考慮在骨中提取DNA。法庭科學(xué)鑒定工作中，除了在腐敗尸體中提取骨DNA，還包括在陳骨和燒骨中提取DNA。然而同樣由于骨骼抗腐敗、侵蝕的原因，相較于其他組織，骨骼的酶解消化、DNA提取和純化難度也隨之增大。筆者通過在法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域的工作和學(xué)習(xí)，分享了關(guān)于陳骨和燒骨DNA的提取、測序要點(diǎn)等檢驗(yàn)鑒定內(nèi)容，以期為廣大鑒定同仁、法律界人士提供參考。一、陳骨與燒骨（一）陳骨對于陳骨的定義，目前尚無權(quán)威的解釋，主要是指年代久遠(yuǎn)的骨骼，包括掩埋多年的尸體、古代尸體、木乃伊，甚至骨化石等。對于古代尸體等陳骨的研究，主要是考古界等為了進(jìn)行種群溯源或族屬分類，如萬誠等人［1］通過對陳骨的DNA提取和測序，獲取了大量古人的遺傳信息，這些DNA信息為骨樣所屬時代和與之有關(guān)族屬的遷徙和發(fā)展，提供了豐富的研究資料。法庭科學(xué)鑒定工作中，對陳骨DNA的研究主要是為了進(jìn)行個體識別。由于案發(fā)時間距離發(fā)現(xiàn)尸體的時間較遠(yuǎn)，尸體因環(huán)境因素腐敗、白骨化，甚至骨骼被侵蝕、風(fēng)化，難以辨識陳骨的個體信息，給案件偵破活動帶來困難。通過對陳骨中DNA的提取和檢驗(yàn)，可以進(jìn)行個體識別。當(dāng)然，也可通過對陳骨中DNA的提取和檢驗(yàn)，進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，李成濤等人［2］曾報道了一起陳骨且骨骼已風(fēng)化的案件，通過對陳骨與案件中可疑父母進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，雖然檢出的基因位點(diǎn)較少，但仍推斷出了骨樣本身源者的性別，并推斷不排除骨樣與疑母存在親緣關(guān)系，為偵查提供了方向。（二）燒骨在法庭科學(xué)鑒定工作中，燒骨通常是指人體中骨骼與其他組織在火災(zāi)、爆炸、焚尸等案件中，被焚燒后，殘留的燒焦尸骨或殘骨碎片。骨骼加熱到300℃以上時，開始因?yàn)樽茻霈F(xiàn)長軸方向裂隙，隨著溫度的升高，骨骼內(nèi)的有機(jī)物變性、喪失，骨骼的顏色開始由黃色向褐色、深褐色、黑色、灰白色、白色依次逐漸變化，骨骼的脆性也隨之增加。燒骨可以導(dǎo)致有機(jī)物變性、碳化，焚燒嚴(yán)重者可使有機(jī)物丟失、灰化，骨組織的DNA檢出率也隨骨骼的被焚燒程度變化，焚燒程度越高的，骨DNA的檢出率也隨之降低。二、骨中DNA的提取對骨DNA的提取，無論何種方法都應(yīng)當(dāng)避免污染，實(shí)驗(yàn)室在收到骨檢材后，應(yīng)按實(shí)驗(yàn)室工作管理要求進(jìn)行必要的登記和妥善保存。骨DNA提取前，首先應(yīng)將骨樣洗凈晾干，而后進(jìn)行紫外線照射，再以鋸、鉆、刮等方式取得骨屑或骨粉。與其他組織DNA的提取一樣，骨DNA的提取同樣遵循三個步驟，即第一，對材料進(jìn)行細(xì)胞裂解，使其釋放DNA分子；第二，細(xì)胞裂解后，將DNA分子與其他細(xì)胞物質(zhì)分離；第三，將DNA提純，并制備成可以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）擴(kuò)增等應(yīng)用形式的樣本。提取過程應(yīng)防止樣本之間、樣本與外源物質(zhì)之間的污染。目前較為成熟的骨DNA提取方法有：苯酚-氯仿法、Chelex-100法、硅珠法、硅膠膜法等，對于燒骨更加微量DNA的提取，國內(nèi)學(xué)者還提出了改良苯酚-氯仿法、十六烷基三甲基溴化胺法［3］等。（一）苯酚-氯仿提取法苯酚-氯仿法是經(jīng)典的DNA提取方法，廣泛用于DNA測序工作中。在骨DNA提取時，采取碎骨、研磨方法取骨樣，通過乙二胺四乙酸鈉（EthyleneDiamineTetraaceticAcid，簡稱EDTA）脫鈣、十二烷基硫酸鈉（SodiumDodecylSulfate，簡稱SDS）去污、蛋白酶K（ProteinaseK，簡稱PK）消化，再通過離心分離DNA方式獲得樣液，而后使用苯酚（phenol）和氯仿（Trichloromethane，也稱三氯甲烷）進(jìn)行萃取，最后獲得DNA。在此過程中，使用EDTA可以螯合鈣、鎂等金屬離子，極大減少組織被破壞，不影響DNA分子結(jié)構(gòu)。（二）Chelex-100提取法Chelex-100是一種由苯乙烯和二乙烯苯共聚體組成的化學(xué)螯合樹脂，內(nèi)部含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，具有非常明顯的螯合多價金屬離子作用。通過螯合鎂離子等，使核酸酶失去活性，保護(hù)DNA分子不被降解。在骨DNA提取時，與苯酚-氯仿提取法取得樣液過程相同，再通過Chelex-100提取DNA。提取過程中應(yīng)始終在一個試管內(nèi)進(jìn)行，可有效避免污染。但由于本法提取的DNA純度不高，所以筆者不建議運(yùn)用Chelex-100法提取骨DNA。（三）硅珠提取法異硫氰酸胍（Guanidiniumthiocyanate，簡稱GuSCN）具有裂解消化細(xì)胞且抑制核酸酶活性的作用，硅珠法是通過碎骨、研磨、EDTA脫鈣、PK+GuSCN裂解消化骨中DNA，并利用硅珠在裂解介質(zhì)中對DNA的特異性吸附作用，將骨DNA進(jìn)行提取。劉雅誠［4］等人研究認(rèn)為，硅珠法相較于Chelex-100或苯酚-氯仿法，可以明顯提高骨DNA的檢出率。GuSCN屬于有毒物質(zhì)，特別是其在遇酸后可產(chǎn)生有毒氣體氰化氫（HCN），提取時應(yīng)注意人員和環(huán)境的保護(hù)。（四）硅膠膜提取法硅膠膜法是通過挫骨、EDTA脫鈣、消解獲取含有骨DNA的樣液，再通過快速離心柱，將DNA結(jié)合到QIAamp硅膠膜上，并過濾掉其他污染物，再通過兩次洗滌，將二價陽離子和蛋白質(zhì)等去除，最高得到高純度的DNA。在取骨樣時，可以挫取骨粉的方法獲取，無需對骨樣進(jìn)行研磨，減少提取流程，是筆者比較推薦使用的方法。［5］（五）改良苯酚-氯仿提取法徐國昌等人［6］通過對苯酚-氯仿法進(jìn)行改良，并運(yùn)用改良后方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究后認(rèn)為，改良方法雖然比常規(guī)方法多了3個步驟，且實(shí)驗(yàn)時間也較常規(guī)方法耗時長，但DNA的產(chǎn)率明顯提高，是燒骨DNA提取工作中值得推廣的方法，可以有效維護(hù)DNA分子結(jié)構(gòu)。在DNA提取時，使用EDTA可以極大減少組織破壞，不影響DNA分子結(jié)構(gòu)；在氯仿、異戊醇的作用下，減少酚對DNA分子結(jié)構(gòu)的破壞。對于DNA樣品純度不好的，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行純化處理，PCR反應(yīng)物應(yīng)當(dāng)盡快進(jìn)行電泳且體積在10ul為宜。當(dāng)出現(xiàn)“影子帶”（StutterBand，又稱鬼影帶），讀取時應(yīng)當(dāng)進(jìn)行嚴(yán)格鑒別。（六）十六烷基三甲基溴化銨提取法十六烷基三甲基溴化銨（SixteenAlkylThreeMethylBromide，CTAB）是一種陽離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，可以用于從大量產(chǎn)生黏多糖的有機(jī)體中制備純化DNA。葉健等人［3］通過實(shí)驗(yàn)，將燒骨研磨后加入CTAB緩沖液中，室溫下放置12～24h，而后加入PK，經(jīng)過水浴震蕩等流程使骨組織細(xì)胞釋放DNA，再通過離心獲取含有DNA的液體。通過磁珠純化DNA、PCR擴(kuò)增后，焚燒度較輕燒骨可以檢驗(yàn)完整清晰的DNA圖譜，焚燒度越重DNA的缺失位點(diǎn)越多。相較于傳統(tǒng)苯酚—氯仿提取法，CTAB法提取陳舊骨和燒骨的DNA更加穩(wěn)定、簡便。（七）其他其他還有一些新型的骨DNA提取方法，如美國的Steadman等人［7］研究的，利用熱離析作用協(xié)同PCR技術(shù)對燒骨DNA的提取，其實(shí)驗(yàn)中使用了十種化學(xué)藥品，結(jié)果表明每一種處理方法都可以順利獲取DNA。三、結(jié)語法庭科學(xué)從業(yè)人員或司法鑒定人，在受理此類案件時，應(yīng)對送檢骨樣進(jìn)行初步審查，對陳骨的腐敗、降解程度和燒骨的燒灼程度進(jìn)行肉眼綜合判斷，經(jīng)初步審查認(rèn)為難以檢出或僅可部分檢出DNA序列的檢材，受理審查人員應(yīng)在檢驗(yàn)前向委托方進(jìn)行告知。陳骨和燒骨的檢出率主要依靠取材和骨DNA提取過程，除了上述注意要點(diǎn)外，實(shí)驗(yàn)時還應(yīng)注意防止樣品污染。如，在吸加PCR試劑和模板時，吸樣要慢且盡量一次性完成，避免因多次抽吸導(dǎo)致的交叉污染或氣溶膠污染。取材料、碎骨、研磨、DNA提取等每一次操作過程要勤換手套，特別是進(jìn)入不同區(qū)域、接觸不同物體都要更換手套。每一項(xiàng)操