高效液相色譜簡(jiǎn)介及操作

關(guān)于高效液相色譜簡(jiǎn)介及操作一、高效液相色譜概述及原理高效液相色譜法（HPLC）是在20世紀(jì)70年代在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上迅速發(fā)展起來(lái)的一種高效、快速的分離分析技術(shù)。第2頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.色譜的演化色譜：由于不同的組分與固定相作用強(qiáng)弱不同，在一定的推動(dòng)力下，它們?cè)诠潭ㄏ嘀袦舻臅r(shí)間長(zhǎng)短不一，從而使它們按一定順序從色譜柱中先后流出。經(jīng)典的柱色譜經(jīng)典的柱色譜第3頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天漸漸地，人們以傳統(tǒng)色譜為藍(lán)本開(kāi)發(fā)了氣相色譜氣相色譜示意圖經(jīng)典的柱色譜第4頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜：效仿氣相色譜，用高壓輸液泵將流動(dòng)相輸入高柱效色譜柱，使其在柱內(nèi)快速流動(dòng)，并在柱末端附加檢測(cè)器檢測(cè)分離情況。高效液相色譜就這樣誕生了。第5頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜儀就這樣誕生了LCGCHPLC第6頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天填料顆粒小（2~10μm），受到的阻力較大，為了能迅速地通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液施加15~30MPa的高壓。由于采用高壓，載液在色譜柱內(nèi)的流速可達(dá)l~10mL／min，因而所需分析時(shí)間少。

使用細(xì)、規(guī)則、孔淺的顆粒做為固定相，分離效率大大提高。采用紫外、熒光、蒸發(fā)激光散射、電化學(xué)、質(zhì)譜等檢測(cè)器，檢測(cè)靈敏度高。紫外檢測(cè)器檢測(cè)限可達(dá)0.01ng；熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。2.為什么叫高效液相色譜???第7頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC和經(jīng)典液相色譜法的比較第8頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.高效液相色譜法的分類(lèi)通常將液相色譜法按分離機(jī)理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類(lèi)。第9頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.如何閱讀色譜圖？？tR：保留時(shí)間；tM：死時(shí)間；：調(diào)整保留時(shí)間；W：峰寬第10頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天定性分析：在同一色譜系統(tǒng)中相同物質(zhì)具有相同的保留值定量分析：組分含量與其響應(yīng)值（峰高或面積）成正比第11頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.如何評(píng)價(jià)色譜峰？？柱效：描述被分離組分的集中程度。柱效越高，組分越集中，對(duì)應(yīng)色譜峰的峰寬越窄?？捎美碚撍甯叨菻描述。H越小，柱效越高。選擇性：描述不同組分的分離程度。選擇性越高兩個(gè)色譜峰頂相距越遠(yuǎn)。用R表示第12頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天（a）柱效和分離度都不好；（b）分離度高，柱效低；（c）理想色譜峰第13頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天用分離度R可以描述選擇性和柱效的總效能R值越大，表明兩組分的分離程度越高，R=1.0時(shí)，分離程度可達(dá)98%，R<1.0時(shí)兩峰有部分重疊，R=1.5時(shí)，分離程度達(dá)到99.7%.所以，通常用R=1.5作為相鄰兩色譜峰完全分離的指標(biāo).第14頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天分析未知物質(zhì)------聯(lián)用技術(shù)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜-核磁共振聯(lián)用色譜-傅氏轉(zhuǎn)換紅外線(xiàn)光譜分析儀聯(lián)用第15頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)

液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)以及檢測(cè)和記錄系統(tǒng)四大部分組成。此外，可根據(jù)需要配置流動(dòng)相在線(xiàn)脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱后反應(yīng)系統(tǒng)和全自動(dòng)控制系統(tǒng)等。高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程圖第16頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第17頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天1高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)有貯液器、高壓泵及壓力表等組成，核心部件是高壓泵。（1）貯液器流動(dòng)相貯液器，一般由玻璃、不銹鋼或聚四氟乙烯塑料制成，常用體積為0.5~2L。流動(dòng)相溶劑放入貯液器之前必須經(jīng)過(guò)過(guò)濾和脫氣處理。常用脫氣方法：超聲脫氣、加熱脫氣、真空脫氣、吹氮脫氣等。第18頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）高壓輸液泵主要部件之一，泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性，常用的壓力范圍：(150～350)×105Pa。

輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定；②流量范圍寬；

③輸出壓力高；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎?，耐腐蝕。第19頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天高壓泵的分類(lèi)往復(fù)式柱塞泵分類(lèi)恒流泵恒壓泵螺旋注射泵柱塞往復(fù)泵隔膜往復(fù)泵第20頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣方式：注射器進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。早期使用注射器進(jìn)樣，現(xiàn)在大都使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣或自動(dòng)進(jìn)樣。第21頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天六通閥的結(jié)構(gòu)：第22頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜柱是高效液相色譜的心臟。柱管多用不銹鋼制成。兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，防止填料漏出。填料的粒度多為0.2-20μm(5-10μm)。

發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

常規(guī)分析柱：內(nèi)徑2~5mm(常用4.6mm，3.9mm)，柱長(zhǎng)10~30cm(15cm，25cm居多）。

3分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。第23頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天4檢測(cè)系統(tǒng)主要作用：監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由工作站記錄數(shù)據(jù)，定性、定量分析。高效液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器等。第24頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理：朗伯-比爾定律a.紫外檢測(cè)器(UVD)：應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器。特點(diǎn)：使用面廣；

靈敏度高（檢測(cè)下限為10-10g／ml）；

線(xiàn)性范圍寬；

對(duì)溫度和流速變化不敏感；

可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。缺點(diǎn)：只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。第25頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天b.示差折光檢測(cè)器(RID)原理：監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來(lái)測(cè)量試樣濃度。特點(diǎn)：通用性檢測(cè)器；對(duì)溫度變化比較敏感，要保持在±0.001℃；靈敏度低(10-6g)；對(duì)溶劑變化敏感，不適用于梯度洗脫。凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。目前，糖類(lèi)化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。第26頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天c.熒光檢測(cè)器(FLD)原理:某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見(jiàn)光(熒光)的性質(zhì)檢測(cè)。

特點(diǎn):選擇性檢測(cè)器，靈敏度比紫外檢測(cè)器高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，可達(dá)到10-12g；選擇性好，對(duì)流量和溫度敏感性低。缺點(diǎn)：只適合于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的檢測(cè)。只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類(lèi)、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測(cè)定。第27頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天

d.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)通過(guò)檢測(cè)光散射程度而測(cè)定溶質(zhì)濃度的檢測(cè)器。工作原理:適用檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分，主要用于檢測(cè)糖類(lèi)，高級(jí)脂肪酸，磷脂，維生素，氨基酸，甘油三酯及甾體等。適用范圍：第28頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。第29頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、高效液相色譜基本操作步驟（1）檢查電源線(xiàn)連接是否正確后打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)（2）泵體及流路內(nèi)的氣泡排除（3）正確連接色譜柱

注意流向標(biāo)志，切勿反接第30頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）系統(tǒng)平衡第一步：先用甲醇或乙腈沖洗流路約20分鐘，平衡活化色譜柱，并趕走管路中的雜質(zhì)和水分。第二步：平衡色譜柱方法一：若流動(dòng)相為有機(jī)相與水相的混合物，則第一步完成后，按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)有機(jī)相與水相的比例后沖洗流路約30分鐘后，待基線(xiàn)走平后即可進(jìn)樣。方法二：若流動(dòng)相中含有緩沖鹽溶液、有機(jī)/無(wú)機(jī)酸，則第一步完成后，先用95%的去離子水沖洗流路約20分鐘后，再按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例，沖洗流路約30分鐘，待基線(xiàn)走平后即可進(jìn)樣。第31頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天（5）色譜柱平衡后，打開(kāi)檢測(cè)器（開(kāi)燈）（6）測(cè)定樣品（7）清洗儀器

色譜柱及流路清洗進(jìn)樣閥清洗進(jìn)樣針清洗

第32頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、主要注意事項(xiàng)1泵使用的注意事項(xiàng)防止任何固體微粒進(jìn)入泵體（用0.22

um或0.45um的微孔濾膜過(guò)濾）流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖鹽的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)更不允許留在柱內(nèi)。泵工作時(shí)防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)一是會(huì)使大量空氣進(jìn)入柱內(nèi)柱床崩塌、也會(huì)磨損柱塞、密封圈，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力。流動(dòng)相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性和分析結(jié)果。第33頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2色譜柱使用的注意事項(xiàng)3其他注意事項(xiàng)色譜柱在