尼古丁代謝酶Pno電子傳遞的研究和尼古丁轉(zhuǎn)化工程菌的應(yīng)用

尼古丁代謝酶Pno電子傳遞的研究和尼古丁轉(zhuǎn)化工程菌的應(yīng)用煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物,但其生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的含有尼古丁的廢棄物。因?yàn)槟峁哦∈且环N具有毒性的含氮雜環(huán)化合物,這些含有尼古丁的廢棄物如果處理不當(dāng),會(huì)污染環(huán)境并影響人類(lèi)健康。因此,必須開(kāi)發(fā)有效的技術(shù)來(lái)處理或回收利用煙草廢棄物。在多數(shù)情況下,與物理和化學(xué)方法相比,微生物可以更高效、更經(jīng)濟(jì)地?zé)o害化處理有毒化學(xué)品。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道已發(fā)現(xiàn)多種微生物可以降解代謝尼古丁,比如本論文使用的AgrobacteriumtumefaciensS33可以通過(guò)新型的吡啶途徑和吡咯途徑的“雜合途徑”氧化降解尼古丁,進(jìn)而以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長(zhǎng)。在該途徑中,吡啶環(huán)被開(kāi)環(huán)分解之前至少有六個(gè)步驟是氧化還原反應(yīng),S33通過(guò)這六個(gè)氧化還原反應(yīng)將電子從尼古丁及其中間代謝物沿著電子傳遞鏈(ETC)傳遞到最終的電子受體02,最終通過(guò)氧化磷酸化合成ATP獲得能量。在這六個(gè)氧化反應(yīng)中,催化第四步反應(yīng)(6-羥基假氧化尼古丁氧化脫氨生成6-羥基-3-琥珀酰半醛吡啶)的6-羥基假氧化尼古丁氧化酶Pno的生理電子受體仍不清楚。此外,該途徑中一些中間代謝物可以作為底物進(jìn)一步化學(xué)合成一些有價(jià)值的藥物,如6-羥基尼古丁,這為資源化利用煙草廢棄物和尼古丁提供了新途徑。因此,本論文主要對(duì)A.tumefaciensS33降解尼古丁途徑中的關(guān)鍵酶6-羥基假氧化尼古丁氧化酶(Pno)的電子傳遞及利用工程菌轉(zhuǎn)化尼古丁生產(chǎn)6-羥基尼古丁進(jìn)行了探究,具體內(nèi)容如下:人工電子受體2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)在實(shí)驗(yàn)室前期被用作Pno的電子受體測(cè)試了Pno催化6-羥基假氧化尼古丁氧化脫氨的反應(yīng)。為了方便實(shí)驗(yàn),本論文首先嘗試了Pno對(duì)假氧化尼古丁(6-羥基假氧化尼古丁的類(lèi)似物)的催化性質(zhì),并用其替代真正底物開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步通過(guò)生化分析、遺傳分析和LC-MS分析來(lái)確定Pno可利用電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白(EtfAB)作為生理電子受體催化假氧化尼古丁脫氨生成3-玻珀酰半醛吡啶。在此過(guò)程中,NAD(P)+、O2和鐵氧還蛋白不能作為電子受體發(fā)揮作用。同時(shí),利用18O標(biāo)記的底物證實(shí)產(chǎn)物3-琥珀酰半醛吡啶中的醛基氧原子來(lái)自H2O。對(duì)尼古丁降解基因簇上etfAB基因的敲除降低了A.tumefaciensS33在尼古丁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率,但其在HSP(6-羥基-3-玻珀酰吡啶,S33降解尼古丁雜合途徑下游的一種中間代謝物)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況沒(méi)有受到明顯影響,這表明EtfAB在菌株S33高效降解尼古丁的過(guò)程中起到了重要的作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白:泛醌氧化還原酶(Euo)的催化下,電子可從還原態(tài)EtfAB進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到輔酶Q。這些結(jié)果有助于深入了解尼古丁氧化降解途徑涉及的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程和能量代謝,為細(xì)菌分解代謝尼古丁提供了新見(jiàn)解。此外,實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了敲除了6-羥基尼古丁氧化酶Hno編碼基因的工程菌S33-△hno,本論文利用該工程菌進(jìn)行了將尼古丁轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的化合物6-羥基尼古丁的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。在最適條件(30℃、pH7.0、初始尼古丁濃度為1.0g/l)下,以含0.1g/1HSP的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24小時(shí)獲得的細(xì)胞作為生物催化劑,進(jìn)行分批轉(zhuǎn)化和分批補(bǔ)料細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。分批轉(zhuǎn)化中每批次發(fā)酵的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%;分批補(bǔ)料轉(zhuǎn)化中最終摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.4%?；厥债a(chǎn)物的回收率為76.9%,產(chǎn)率可達(dá)83.9%。綜上,本論文通過(guò)對(duì)EtfAB和Euo進(jìn)行的異源表達(dá)、純化和酶反應(yīng)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)Pno以EtfAB作為生理?xiàng)l件下的電子受體,且可進(jìn)一步通過(guò)Euo的催化將電子轉(zhuǎn)移到CoQ,進(jìn)而沿ETC傳遞給02,該結(jié)果說(shuō)明Pno是一個(gè)脫氫酶而非氧化酶,因此我們將Pno更名為6-羥基假氧化尼古丁脫氫酶。本研究完善了A.tumefaciensS33氧化降解尼古丁的“雜合途徑”,同時(shí)也為深入了解細(xì)菌氧化降解尼古丁過(guò)程中的電子