非洲爪蟾在發(fā)育生物學(xué)中的研究進展

非洲爪蟾在發(fā)育生物學(xué)中的研究進展摘要：非洲爪蟾是一種有價值的非哺乳動物模型生物，它作為一類兩棲綱脊椎動物，利用其作為模式動物具有取卵方便，卵子和胚胎個體大，便于進行等諸多優(yōu)點，以及其體外受精，體外發(fā)育以及胚后發(fā)育為變態(tài)發(fā)育[1]過程，而具有易在實驗室人工飼養(yǎng)，以及對研究細(xì)胞凋亡，激素調(diào)控中是一個很好的材料，因而在發(fā)育生物學(xué)方面發(fā)揮著非常重大的作用。在這篇綜述中，主要以研究脊椎動物心臟發(fā)育和探索人類先天性心臟缺陷（CHDs）的潛在分子機制和神經(jīng)系統(tǒng)先天或后天的病變將影響生物體的正常生命活動這兩點進行闡述，再提及其他方面的相關(guān)研究。關(guān)鍵詞：非洲爪蟾發(fā)育生物學(xué)神經(jīng)系統(tǒng)心臟疾病研究模式生物一、非洲爪蟾非洲爪蟾又名光滑爪蟾，是南非的一種水生青蛙，是一種重要的模式生物。它們可以長達12厘米，頭部及身體扁平，沒有外耳或舌頭[2]。其后腳上有3趾短爪，是用來挖泥來躲避掠食者。由于沒有舌頭只能利用其前肢攪食水中的脊椎動物。自然條件下非洲爪蟾以小魚、蝦、蟹、昆蟲為食，進食時常迫不及待地用前肢的三只長爪將食物撥進口中。它們完全水棲，無論是蝌蚪還是成蛙，一生都生活在水里，廣棲于淡水水域中，尤其喜好靜止水域的環(huán)境。白天多潛藏于水底深處，夜晚則會爬至淺灘。初春至晚夏間為繁殖期[3]。原產(chǎn)地是非洲東南部，由南非的熱帶草原起，北至肯尼亞，烏干達西至喀麥隆。二、爪蟾作為模式生物的一些特點從20世紀(jì)50年代以來，非洲爪蟾已經(jīng)成為胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、功能基因組學(xué)等研究的重要模式生物。爪蟾作為模式生物，適合建立多種人類疾病模型進行疾病發(fā)病機制和治療等相關(guān)研究，還可以結(jié)合生物信息學(xué)分析進行高通量藥物篩選及藥物開發(fā)等研究。另外在發(fā)育生物學(xué)和基因功能研究方面也發(fā)揮重要作用。爪蟾作為脊椎模式動物用來科學(xué)研究，與其它模式動物有著很多的優(yōu)勢。非洲爪蟾是發(fā)育生物學(xué)的重要模式生物。它們約需1-2年的時間才達至性成熟，且是有四套染色體的。它們的胚胎很大及容易處理，故在發(fā)育生物學(xué)上的地位舉足輕重。1.爪蟾成為重要的模式生物主要有如下優(yōu)點：（1）爪蟾是脊椎動物，比果蠅、線蟲等更適合于作為人類疾病的模式生物開展研究；（2）產(chǎn)卵量很大，體外受精，胚胎體外分化很快，整個器官發(fā)育過程都可以體外觀察；（3）卵較大，適合顯微操作和胚層分割移植；（4）利用Morhpolinooligonucleotide（MO）微注射技術(shù)[4]可以特異性抑制特定基因的表達；（5）爪蟾生活在水中，成體約長7cm，易于在實驗室人工養(yǎng)殖，從而養(yǎng)殖本低；（6）易于進行人工繁育，通過注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）可以一年四季產(chǎn)卵，適合于大量繁殖；（7）許多重要基因與人類之間有同源性，如骨形成蛋白（BMP）這為人類基因功能研究奠定了堅實的基礎(chǔ)；（8）爪蟾的卵子較大，直徑約為1～2mm，且在體外受精、體外發(fā)育，因而無需復(fù)雜昂貴的儀器，就可在實驗室進行顯微操作等各種實驗；（9）發(fā)育早期通過輻射狀完全卵裂產(chǎn)生囊胚。其透明的卵殼可以采用手術(shù)或化學(xué)方法脫去，從胚胎上切下來的細(xì)胞團可以依靠細(xì)胞中的卵黃提供營養(yǎng)，在無菌的生理鹽水中繼續(xù)發(fā)育；[5]2.非洲爪蟾作為模式生物存在的缺陷：（1）難以進行遺傳學(xué)研究，主要由于其生命周期過長，從受精發(fā)育至成熟具有升值能力的成蛙需要一年時間；（2）非洲爪蟾是異源四倍體，多數(shù)基因都存在四個拷貝，很難進行遺傳突變試驗；二、爪蟾在發(fā)育生物學(xué)中的研究進展1.神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究脊髓是脊椎動物胚胎發(fā)生過程中發(fā)展的第一個中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，強調(diào)了它對機體的重要性。由于其早期形成，羊膜動物對發(fā)育中脊髓是具有挑戰(zhàn)性的，通常是侵入性，并且適合于對哺乳動物等系統(tǒng)進行建模的實驗方法也是有限的。相比之下，兩棲動物和非洲爪蟾提供了模型系統(tǒng)，其中脊髓的形成，脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的分化以及脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)肌肉突觸的建立可以很容易對整個生物體的微擾進行研究?；蚓庉嫼惋@微鏡方面的重大進展以及最近完成的非洲爪蟾基因組測序重新啟動了這種經(jīng)典模型物種的使用。[6]脊髓功能的發(fā)展依賴于脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的分配，然后建立突觸連接。我們目前對脊髓神經(jīng)元功能分化的理解便來自非洲爪蟾的研究。Spitzer和Baccaglini的開創(chuàng)性研究調(diào)查了體內(nèi)和體外發(fā)育脊髓神經(jīng)元的電興奮性的發(fā)展。他們發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)管閉合后不久，體內(nèi)未成熟的感覺脊髓神經(jīng)元就會引發(fā)Ca2+依賴性動作電位。隨著成熟的進行，動作電位依賴于Na+和Ca2+，并且逐漸地，動作電位的Na+驅(qū)動成分變得更加主導(dǎo)，直到Ca2+依賴性成分在受精后3天消失。在發(fā)育中的脊髓神經(jīng)元中從Ca2+依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)镹a+介導(dǎo)的動作電位取決于離子通道表達。而在發(fā)育中的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)Ca2+依賴性動作電位開辟了一個突出且有影響力的研究領(lǐng)域，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中Ca2+介導(dǎo)的電活動的作用和機制。非洲爪蟾的蝌蚪尾巴之前的神經(jīng)管、雞胚第29對體節(jié)之前的神經(jīng)管和哺乳類胚胎骶骨之前的神經(jīng)管是通過初級神經(jīng)胚形成的方式形成的。在中胚層脊索的誘導(dǎo)下，胚胎背側(cè)的外胚層增厚成神經(jīng)板，神經(jīng)板以頭側(cè)寬于尾側(cè)的形態(tài)隨脊索的生長而增長，隨后，神經(jīng)板沿其長軸凹陷形成神經(jīng)溝，神經(jīng)溝兩側(cè)的隆起形成神經(jīng)褶，兩側(cè)的神經(jīng)褶在神經(jīng)溝的中段靠攏并愈合，繼而向頭尾側(cè)延伸，形成封閉的神經(jīng)管。所以說，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機制的研究以及各種調(diào)節(jié)因子的發(fā)現(xiàn)、研究以及研制都將是人類精神史上的一大跨越。利用模式生物爪蟾研究神經(jīng)發(fā)育病理是防止先天及后天智力問題的關(guān)鍵。神經(jīng)系統(tǒng)自身存在的再修復(fù)和發(fā)育的潛能為改變?nèi)祟惖谋粍泳车貙龀鼍薮筘暙I。模式動物的建立是突破神經(jīng)病變，如脊髓性肌萎縮、遺傳性痙攣性截癱、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化[7]、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏病、癲癇等疾病的研究治療關(guān)鍵，探討人類神經(jīng)系統(tǒng)的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。2.先天性心臟病研究上世紀(jì)三十年代，爪蟾作為研究內(nèi)分泌生物學(xué)的模式生物，被用于早期懷孕的檢測，在爪蟾上開展的工作，揭示了發(fā)育生物學(xué)背后的分子機制和許多信號[8]通路，如尾牙發(fā)育的Notch信號，爪蟾有助于脊椎動物的心臟發(fā)育的研究，為揭示人類先天性心臟疾病的分子機制提供了有價值的機制。脊椎動物心臟的發(fā)育是一個高度保守，精心策劃的過程，涉及細(xì)胞規(guī)格和分化以及心臟組織的廣泛形態(tài)發(fā)生重塑。早期心臟發(fā)生已經(jīng)分析爪蟾通過命運映射的組合方法，移植實驗，基因表達分析，組織切片和整裝共焦顯微術(shù)或免疫組織化學(xué)和3D重建[9]。雖然哺乳動物和鳥類具有四腔心臟，由兩個心房和兩個心室組成，但兩棲動物具有三室心臟，單心室，類似于哺乳動物的左心室。因此，非洲爪蟾心臟代表了兩腔心臟與鳥類和哺乳動物的四腔心臟之間的進化中間體。心臟發(fā)育的異常與許多人類先天性心臟缺陷（CHD）有關(guān)。CHDS是新生兒的最常見的疾病具有大約1％的活產(chǎn)率以及引起約10％的死產(chǎn)和自然流產(chǎn)率?；颊咧欣鏝KX2.5，GATA或T-BOX基因的突變與CHD相關(guān)，例如房間隔缺損，DiGeorge綜合征或法洛四聯(lián)癥。與其他模型系統(tǒng)相比，非洲爪蟾的幾個不同特征強調(diào)其對CHD建模的適用性。例如，由于非洲爪蟾的快速胚胎發(fā)育，可以快速分析基因功能。由于胚胎在沒有功能循環(huán)系統(tǒng)的情況下發(fā)育，可以在體內(nèi)研究心血管缺陷的發(fā)作。三腔心臟不是缺點，因為心室類似于哺乳動物左心室，并且允許對左心室發(fā)育不全綜合征缺陷（HLHS）進行建模[10]。與斑馬魚相比，非洲爪蟾心臟中的隔音心房允許研究房間隔缺損。冠狀動脈疾病由全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）發(fā)表在2007年。此后，GWAS精確定位與心血管疾?。ㄐ难懿。┫嚓P(guān)的遺傳因素。此外，患者及其親屬的全外顯子組測序已經(jīng)確定了大量可能導(dǎo)致疾病的突變。通過這些方法衍生的大量候選基因產(chǎn)生分離與相關(guān)病理學(xué)中的無關(guān)突變相關(guān)的突變的問題?；贛O介導(dǎo)的基因功能可以快速進行爪蟾基因的大規(guī)模篩選，目的是驗證因果候選基因[11]。另一個GWAS相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子CASZ1是有利于的心血管發(fā)育。因此，也可用于心臟的適當(dāng)?shù)纳砉δ?。Casz1的消耗導(dǎo)致沿著腹側(cè)中線的一部分心臟祖細(xì)胞停滯。它們作為心臟祖細(xì)胞維持，并且在心管形成之前不能最終分化成心肌細(xì)胞。免疫熒光分析顯示細(xì)胞中Casz1下調(diào)重新進入細(xì)胞周期并且Casz1的缺失導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)的有絲分裂指數(shù)增加。因此，Casz1調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。[12]3.爪蟾作為生物再生研究領(lǐng)域的模式生物，使其研究工作開始聚焦于再生功能涉及的再生集團，信號通路，膜電位變化，細(xì)胞凋亡等多個方面。4.通過研究表明，選用TPT對熱帶爪蟾胚胎進行暴漏，研究TPT對熱帶爪蟾的致畸效應(yīng)，并比較TPT致畸的表型的差異，為污染物對兩棲類種群的影響提供科學(xué)依據(jù)。5.由于爪蟾的一些特性,使得爪蟾成為模式生物研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的重要生物。全氟辛碘酸是一種性質(zhì)穩(wěn)定，具生物富集效應(yīng)的表面活性劑，首先用21天兩棲類變態(tài)試驗，表明PFOS具甲狀腺激素干擾效應(yīng)，可能由于該化合物直接作用甲狀腺組織引起，有運用非洲爪蟾完全變態(tài)試驗，表明PFOS對爪蟾的變態(tài)過程具有小劑量刺激效應(yīng)，引起甲狀腺組織結(jié)構(gòu)引起的損傷，導(dǎo)致睪丸組織雌性化，具甲狀腺激素和性激素干擾效應(yīng)。在運用非洲爪蟾完全變態(tài)延長實驗，表明PFOS能抑制爪蟾變態(tài)，另外再運用非洲爪蟾幼蛙實驗，表明PFOS雖不能在顯微結(jié)構(gòu)上對爪蟾睪丸發(fā)育造成影響，但是能使其超微結(jié)構(gòu)損傷，最后用非洲爪蟾蝌蚪進行環(huán)境內(nèi)分泌干擾物篩選進行初步研究。參考文獻：[1]HarlandRM,GilchristMJ.Editorial:TheXenopuslaevisgenome[J].DevBiol.2017,426(2):139-142.[2]SachidanandaR,NagadiA,DassAA,etal.Anhidroticectodermaldysplasiapresentingasatrophicrhinitis[J].LaryngolOtol,2004,118(7):556-557.[3]ShinJJ,HartnickCJ.Otologicmanifestationsofectodermaldysplasia[J].ArchOtolaryngolHeadNeckSurg,2004,130(9):1104-1107.[4]葉中德,吳畏.非洲爪蟾早期胚胎發(fā)育的wnt信號.生命科學(xué).2007,19(4):359-363.[5]樊啟昶,白書農(nóng).發(fā)育生物學(xué)原理.高等教育出版社.2002:74-80.[6]BorodinskyLN.XenopuslaevisasaModelOrganismfortheStudyofSpinalCordFormation,Development,FunctionandRegeneration[J].FrontNeuralCircuits,2017,11(23):341-345.[7]FeesCP,StithBJ.InseminationorphosphatidicacidinducesanoutwardlyspiralingdiskofelevatedCa2+toproducetheCa2+waveduringXenopuslaevisfertilization[J].DevBiol,2019,11(1):371-374.[8]SaiL,QuB.Analysisoflongnon-codingRNAinvolvedinatrazine-inducedtesticulardegenerationofXenopuslaevis[J].EnvironToxicol,2019.24(1):237-239.[9]SlaterPG,HayrapetianL,LoweryLA.Xenopuslaevisasamodelsystemtostudycytoskeletaldynamicsduringaxonpathfinding[J].Genesis,2017,55(1).[10]Soto-AzatC,Pe?afiel-RicaurteA.XenopuslaevisandEmergingAmphibianPathogensinChile[J].Ecohealth,2016,13(4):775-783.[11]SharapovMG,NovoselovVI,RavinVK.Xenopuslaevisperoxiredoxins:Geneexpressionduringdevelopmentandcharact