利用RNA干擾技術沉默稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A基因

利用RNA干擾技術沉默稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A基因水稻是世界上最重要的糧食作物之一,全球有一半以上的人以稻米為主食,然而,蟲害卻是造成水稻減產的主要原因之一。稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis),俗稱卷葉蟲,刮青蟲、苞葉蟲等,屬于鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae),是對水稻危害最為嚴重的主要害蟲之一。幾丁質合成酶是昆蟲體內幾丁質合成通路中最后一個酶,也是關鍵酶,在昆蟲生長發(fā)育中具有重要作用,是控制害蟲的理想靶標。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。本研究的主要目的是利用體外注射RNAi和轉基因RNAi技術,獲得對稻縱卷葉螟幾丁質合成酶基因具有沉默作用的轉基因水稻植株,從而達到控制稻縱卷葉螟危害的目的,為其的生物防治奠定基礎。取得的主要研究結果如下:1.稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A基因的克隆及表達譜采用RT-PCR結合RACE-PCR方法從稻縱卷葉螟中克隆得到幾丁質合成酶A基因(CmCHSA)的全長cDNA,其長度為5223bp,包含4695bp的開放閱讀框,編碼1564個氨基酸。生物信息學分析顯示該酶有16個跨膜螺旋區(qū),但無信號肽,等電點為6.63。同源建模預測顯示,CmCHSA的三維分子結構中含5個α螺旋,4個β折疊片。氨基酸序列同源性分析表明CmCHSA的氨基酸序列與亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis幾丁質合成酶A的氨基酸序列一致性最高,高達96%;與甜菜夜蛾Spodopteraexigua、甘藍夜蛾Mamestrabrassicae和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera等幾丁質合成酶A的序列一致性也較高,分別為92%、92%和91%。基因時空表達譜分析表明,CmCHSA在稻縱卷葉螟整個生長發(fā)育時期均有表達,在卵中的表達量最低,蛹中表達量最高;CmCHSA在檢測的成蟲各個組織中都有表達,其表達水平高低順序為:表皮>頭部>肌肉>中腸>卵巢>馬氏管>脂肪體>精巢。2.注射dsRNA干擾稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A基因的表達以稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A基因為靶標,設計兩個RNAi靶位點并將其命名為CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ,在體外合成CmCHSA的兩個dsRNA,用顯微注射法導入3齡幼蟲體內,然后通過表型觀察和熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測干擾效應。結果表明,注射兩種dsRNA后縱卷葉螟對水稻的取食明顯下降,生長發(fā)育阻滯,蟲體變小變黑和畸形,有的出現(xiàn)死亡。RT-qPCR表明,注射CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ兩種dsRNA在96h后,CmCHSA的表達量相比對照分別下降了59%和64%。注射CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ兩種dsRNA7d后,稻縱卷葉螟的死亡率分別為80%和83.33%,與對照組相比,分別增加了66.67%和70%;且各組的校正死亡率為76.92%和80.77%。3.重組RNA干擾植物表達載體的構建與鑒定以CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ兩個片段為靶位點,分別在其兩端添加BamHI和SpeI酶切位點并進行人工合成,經(jīng)雙酶切后與植物表達載體p1301連接,構建p1301-CmCHSA-Ⅰ*和p1301-CmCHSA-Ⅱ*重組植物表達載體。PCR、雙酶切及測序鑒定結果表明重組表達載體p1301-CmCHSA-Ⅰ*和p1301-CmCHSA-Ⅱ*已構建成功,并采用液氮凍融法將其成功轉入農桿菌LBA4404,構建基因工程菌。4.轉基因水稻的獲得及RNA干擾效應檢測用含有p1301-CmCHSA-Ⅰ*和p1301-CmCHSA-Ⅱ*質粒的農桿菌LBA4404浸染中花11號粳稻愈傷組織,經(jīng)過愈傷組織的抗性篩選、分化和植株再生,獲得20株轉基因再生植株。靶標位點的RT-PCR檢測結果表明,6株是含有CmCHSA-Ⅰ*的陽性轉基因植株,7株是含有CmCHSA-Ⅱ*的陽性轉基因植株。用取食非轉基因水稻的稻縱卷葉螟作為對照,觀察發(fā)現(xiàn)取食每株轉基因水稻后縱卷葉螟的生命活性明顯下降,生長發(fā)育滯后,出現(xiàn)蛻皮受阻,蟲體變小、畸形和死亡等情況。用實時熒光定量PCR方法分株測定取食轉基因水稻稻縱卷葉螟體內CmCHSA基因的mRNA表達水平,并統(tǒng)計其死亡情況。結果顯示,相較于對照組,取食轉入目的基因片段CmCHSA-Ⅰ*水稻稻縱卷葉螟CmCHSA基因平均相對表達量相下降了56.8%;取食轉入目的基因片段CmCHSA-Ⅱ*水稻稻縱卷葉螟CmC