鏈霉素誘變育種的方案

關(guān)于鏈霉素誘變育種的方案元芳!此事你怎么看?第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天看目錄一、誘發(fā)突變（一）、出發(fā)菌株選擇（二）、誘變劑及誘變劑量的選擇（三）、影響誘變效果的因素（四）、平板分離二、突變株的篩選（一）、初篩（二）、復(fù)篩（三）、產(chǎn)物活性測定三、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選四、高產(chǎn)變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天插曲(很有必要)誘變育種的一般程序如下：出發(fā)菌株----菌種純化(出發(fā)菌株性能測定)----制備斜面孢子----制備單孢子懸液(懸液進行活菌計數(shù))----誘變劑處理(存活菌數(shù)的測定并計算存活率)----平板分離(測定變異率)----挑取變異菌落并移植至斜面上----初篩(初篩數(shù)據(jù)分析，生產(chǎn)性狀的粗測)----斜面?zhèn)鞔?---復(fù)篩(復(fù)篩數(shù)據(jù)分析，精確測定生產(chǎn)性狀)----變異菌株(菌株參數(shù)分析)----小型或中型投產(chǎn)試驗----大型投產(chǎn)試驗。

第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

（一）、出發(fā)菌株的選擇選擇從自然界(土壤）中分離鏈霉菌放線菌是產(chǎn)生抗生素活性最大的一類微生物，迄今已在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)上都有利用抗生素成功的實例，而鏈霉菌又是放線菌中抗生素的主要產(chǎn)生菌，具有廣泛的物種多樣性和代謝多樣性，是重要的資源微生物，但在鏈霉菌中普遍存在遺傳不穩(wěn)定性，而引起抗生素產(chǎn)量下降。因此,我們要研究提高抗生素產(chǎn)量的方法，已期獲得更大產(chǎn)量的抗生素，而提高產(chǎn)量的最重要途徑是通過育種改變生產(chǎn)菌種。誘變育種是一種簡便易行而且快速的選育方法，因而在抗生素的菌種篩選中應(yīng)用最廣泛。一、誘發(fā)突變第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天菌種的純化：1、土壤用無菌水浸泡，靜置取上清2、做梯度——上清分別稀釋10倍、100倍、1000倍等等3、使用鏈霉菌優(yōu)勢培養(yǎng)基（在上邊鏈霉菌比其他菌長的快），用步驟2的各個梯度液體分別鋪板。4、按照鏈霉菌最適生長溫度培養(yǎng)。5、選取菌落數(shù)在100個左右，菌落清晰無重疊的平板。6、根據(jù)伯杰氏菌種鑒定手冊中鏈霉菌的菌落外觀介紹，粗選出基本符合的鏈霉菌。7、挑取選出的菌落搖瓶培養(yǎng)，按照伯杰氏手冊做理化指標(biāo)檢測。8、符合伯杰氏手冊上理化指標(biāo)的，提總DNA，做16SrDNA擴增，測序9、測序結(jié)果在NCBI上blast，最終確定菌種第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天鏈霉菌單孢子懸液的制備：所處理的細胞必須是處于對數(shù)生長期同步生長的細胞，并且是均勻狀態(tài)的單細胞懸液，將121℃滅菌２０－３０ｍｉｎ的無菌水加入到培養(yǎng)有鏈霉菌斜面的試管中，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，(所處理的細胞必須是處于對數(shù)生長期同步生長的細胞，并且是均勻狀態(tài)的單細胞懸液），將含有孢子的無菌水轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入玻璃珠，在搖床上打碎，經(jīng)濾膜過濾后即得到單孢子率在98％以上的單孢子懸液。目的：在引起絕大多數(shù)細胞致死的同時，使存活個體中DNA的結(jié)構(gòu)變異頻率大幅度提高。第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天選擇該出發(fā)菌株的原因如下：

①對誘變劑的敏感性高；②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；③可采用劃線分離法和稀釋分離法進行純化；④該菌株變異幅度廣；⑤該菌株穩(wěn)定性較好。第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（二）、誘變劑的選擇及誘變劑量的選擇選擇物理誘變劑中非電離輻射即紫外線。因為紫外線是一種使用時間長、效果好、設(shè)備簡單、值得推廣的誘變劑，大約有80%的高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌都曾經(jīng)用過紫外線這一誘變方法。紫外線的誘變育種紫外線的作用機制是使兩個嘧啶之間聚合，形成嘧啶二聚體，堿基不能正常配對。

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為253.7nm，燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天最適誘變劑量的選擇在誘變育種中有兩條重要的實驗曲線:①劑量-存活率曲線②劑量-誘變率曲線通過比較以上兩曲線，可找到劑量-存活率-誘變率三者的最佳結(jié)合點。在實際工作中，突變率往往隨劑量的增加而提高，但到達一定程度后，再提高劑量反而會使突變率降低。根據(jù)UV、X射線和乙烯亞胺等誘變效應(yīng)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變較多地出現(xiàn)在偏高的劑量中。因此，在誘變工作中，大多傾向于采用較低劑量（致死率在70-80%）。第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天紫外線誘變的操作步驟：1．將細菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，加入無菌生理鹽水洗滌再離心。

2．將菌懸液放入巳滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液通過濾紙過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，使細胞數(shù)約為108個／ml，作為待處理菌懸液。

3．取2～4ml制備的菌液加到直徑7cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外燈預(yù)熱10min，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天4．取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。

5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。

6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。

7．挑取菌落進行篩選。第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（三）、影響誘變效果的因素（1）菌種遺傳特性各菌株因遺傳特性不同，對誘變劑敏感性也不一樣。（2）菌體細胞壁結(jié)構(gòu)絲狀菌孢子壁的厚度及表面的蠟質(zhì)會阻礙誘變劑滲入細胞。（3）環(huán)境條件的影響環(huán)境條件的影響包括：①誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)②溫度、pH、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天由接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，使鏈霉菌細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來。如果劃線適宜的話，能將鏈霉菌細胞一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。并測定出其變異率（變異數(shù)與觀察總個體數(shù)的比值）。挑出變異菌落并移植至斜面上。（四）、平板分離：第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天分離后得到的菌落，真正能發(fā)生性能變好的所謂正突變個數(shù)極少，要從幾千萬個菌落中選出幾個好的，與自然選育中的篩選方法相同?？煞譃槌鹾Y（平板篩選、搖瓶發(fā)酵篩選)和復(fù)篩。篩選的方法：隨機亂向篩選定向篩選突變是隨機不定向的，但是篩選是定向的，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是決定菌種某些特性保留或淘汰的“篩子”。二、突變株的篩選第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天初篩：以多為主，盡量擴大篩選范圍。復(fù)篩：以質(zhì)和精為主，反復(fù)多次，結(jié)合自然分離，選育高產(chǎn)或其他優(yōu)良菌株。多級水平篩選：由于誘變產(chǎn)生高產(chǎn)突變株的頻率很低，而且實、驗誤差又很難避免，所以篩選工作中常用多級篩選，一利于優(yōu)良菌株的獲得篩選根據(jù)主次分為初篩和復(fù)篩第16頁,共56頁，2024年2月25日，星期天平板菌落預(yù)篩根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，利用瓊脂平板進行篩選和活性粗測的方法，大幅度擴大有效篩選量，提高篩選工作效率。搖瓶發(fā)酵篩選

優(yōu)點：不管種子或發(fā)酵過程的生產(chǎn)條件、生理條件如何，都與發(fā)酵罐大生產(chǎn)條件相近，可以模擬進行。（一）、初篩缺點：在突變率小的情況下，如果菌落挑取少，很難篩選到理想的突變株第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天對初篩出來的菌株進行復(fù)篩時，通常采用搖瓶培養(yǎng)法，一般一個菌株至少要重復(fù)3~5個瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液必須采用精確分析方法測定。復(fù)篩過程中，要結(jié)合各種培養(yǎng)條件進行篩選，在不同培養(yǎng)條件下進行試驗。（二）、復(fù)篩第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天篩選步驟如下：第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1、步驟：搖瓶培養(yǎng)通常分為初篩和復(fù)篩，初篩因菌株多常常一株菌一瓶，進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后逐個進行活性測定，將生產(chǎn)性能高的菌株用沙土管或冷凍管保藏。復(fù)篩時取出，以一株3-5瓶，振蕩培養(yǎng)后，測定活性，以提高精確性。2、優(yōu)點：培養(yǎng)條件與發(fā)酵罐接近，這樣篩選出來的菌容易在大生產(chǎn)中推廣。搖瓶培養(yǎng):3、注意事項：搖瓶的條件要盡量與發(fā)酵罐接近。且各搖瓶間的培養(yǎng)條件要盡量一致（搖瓶型號，裝量，瓶塞厚度或瓶口包扎紗布的層數(shù)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)，溫度）第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基培養(yǎng)基脂肪酶產(chǎn)生菌透明圈法成色圈法果膠酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基生長圈法抑菌圈法嘌呤產(chǎn)生菌青霉素產(chǎn)生菌一、根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選變株第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天20℃37℃二、采用冷敏感菌篩選抗生素變株第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天加入抗生素不加抗生素三、濃度梯度法篩選法第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天四、復(fù)印技術(shù)快速篩選變株測定不同酵母菌胞內(nèi)脂肪含量的簡單定量法蘇丹黑染色第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1五、瓊脂大通量篩選變株第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天200搖瓶液體培養(yǎng)寥寥無幾產(chǎn)物活性鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)條件調(diào)整正交實驗設(shè)計第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

1.瓊脂平板活性圈法2.紙片法:發(fā)酵液濃度高時3.瓊脂薄層紙片法4.自動生化儀器分析法（三）、產(chǎn)物活性測定：第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天透明圈變色圈生長圈抑菌圈(水解酶、有機酸）(產(chǎn)酸菌)(工具菌+待檢菌)(抗生菌)

本組方案采用瓊脂平板活性圈法中的抑菌圈來測定其活性。第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體野生型菌株wildtypestrain原始菌株營養(yǎng)缺陷型auxotroph人工誘變或自然突變原養(yǎng)型菌株prototroph回復(fù)突變或重組變異三、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天與篩選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)三類培養(yǎng)基

(1)基本培養(yǎng)基MM(2)完全培養(yǎng)基CM(3)補充培養(yǎng)基SM第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天突變株的表型 檢出方法營養(yǎng)缺陷型補充培養(yǎng)基（auxotroph）

抗性突變型藥物培養(yǎng)基（resistantmutant）條件致死型培養(yǎng)條件改變（conditionallethalmutant）基因突變的類型第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天誘發(fā)突變淘汰野生型菌株檢出缺陷性鑒別缺陷性營養(yǎng)缺陷性菌株的分離和篩選第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天選擇合適的誘變劑與誘變方法誘變劑和誘變方法都要簡便有效主要的誘變劑亞硝基胍,紫外線,亞硝酸誘變方法物理方法化學(xué)方法注意突變率還與誘變劑量有關(guān)（一）、營養(yǎng)缺陷性的誘變第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1.抗生素法青霉素法（細菌）作用于細菌細胞壁的主要成分肽聚糖制霉菌法（酵母菌）作用于真菌細胞膜上的甾醇（二）、淘汰野生型菌株第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2.菌絲過濾法適用于真菌和放線菌作用于絲狀菌的孢子3.高溫殺菌法適用于芽孢菌類作用于芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)體第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（三）、檢出營養(yǎng)缺陷型①夾層培養(yǎng)法

②限量補充培養(yǎng)法

③影印接種法

④逐個檢出法

第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1.夾層培養(yǎng)法（延遲補給法）第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2.限量補充培養(yǎng)法第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3.影印接種法第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天需要注意兩點第一防止菌落擴散和蔓延，在培養(yǎng)基中加入脫氧膽酸鈉第二為了克服孢子擴散而帶來不純現(xiàn)象，在操作方法上改進。第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天4.逐個檢出法第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1、鑒定方法一種方法是加入一種物質(zhì)測定多株缺陷型菌株一種方法是測定一種缺陷型菌株對許多生長因子的需求情況稱為生長譜法（四）、營養(yǎng)缺陷型的鑒定第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2、營養(yǎng)缺陷型鑒定步驟<1測定缺陷性菌株所需生長因子的類別<2具體測缺陷該類別物質(zhì)中的哪種因子<3用單一因子進行復(fù)證試驗（一）、營養(yǎng)缺陷性的誘變第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天營養(yǎng)缺陷型生長譜法鑒定

1.氨基酸混合液；

2.核酸堿基混合液；

3.維生素混合液；

營養(yǎng)缺陷型的鑒定第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天測定方法缺陷性菌株和基本培養(yǎng)基混合制成板，把生長因子分組直接點加于同一瓊脂平上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩組區(qū)產(chǎn)生混合生長圈，即可確定該菌株缺陷的生長因