園林生物技術(shù)

園林生物技術(shù)1564906041015169+1981043000081303都市規(guī)劃與設(shè)計3171341422000090706園林植物與觀賞園藝※1104939000560100風(fēng)景園林碩士17+5563免費考研網(wǎng)園林植物與觀賞園藝※12018474833免費考研網(wǎng)BiotechnologyofHorticulturalPlant園藝植物生物技術(shù)（理論課教案）華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院2007-2018-1

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（首頁）授課時刻2007年9-11月教案編寫時刻2007年8月課程名稱園藝植物生物技術(shù)課程編號總學(xué)時40講課：30學(xué)時實驗：10學(xué)時實習(xí)：學(xué)時學(xué)分數(shù)2.5課型必修課（）選修課（）理論課（）實驗課（）任課教師郭文武、程運江職稱教授、副教授（博士）授課對象2002（班）級園藝專業(yè)1、2班差不多教材或要緊參考書園藝植物生物技術(shù)，鄧秀新、胡春根主編。高等教育出版社，2005H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的與要求通過本課程的學(xué)習(xí)，要求園藝專業(yè)學(xué)生把握園藝植物生物技術(shù)相關(guān)差不多理論和方法。教學(xué)重點、難點重點：生物技術(shù)的概念/應(yīng)用現(xiàn)狀、組織培養(yǎng)技術(shù)、病毒病脫除與無病毒繁育難點：原生質(zhì)體操作技術(shù)、基因分離克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù)教學(xué)進程第次課12-56-78-910-1112-1314-15授課章節(jié)（30學(xué)時）Theorypart1)Introduction2)Tissuecultureofhorticplant3)Protoplastculture&somaticfusion4)Viruseradication,detection&characterization5)Molecularmarkers6)Geneisolation&cloning7)Transgenictechniques學(xué)時2844444備注本課程采納多媒體課件教學(xué)3次實驗課，分不為實驗室布局/大型生物技術(shù)儀器介紹、組織培養(yǎng)技術(shù)、DNA鑒定技術(shù)。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時備課）第1次課2學(xué)時課目、課題（章節(jié)）要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求把握生物技術(shù)的概念、所包含的技術(shù)內(nèi)容、對園藝科學(xué)進展的奉獻及可能引起的深刻變化。了解園藝植物生物技術(shù)的進展歷程課程要求與安排重點難點生物技術(shù)的內(nèi)涵生物技術(shù)與產(chǎn)業(yè)的結(jié)合教學(xué)進程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動、學(xué)時分配、板書設(shè)計）課程安排生物技術(shù)的概念組織和細胞培養(yǎng)是園藝生物技術(shù)的平臺基因工程技術(shù)是以后園藝生物技術(shù)的核心生物技術(shù)對園藝科學(xué)進展的奉獻園藝植物生物技術(shù)的展望課程要求與安排一生物技術(shù)的概念以現(xiàn)代生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，以基因工程為核心的一系列技術(shù)的總稱。狹義的植物生物技術(shù)：在離體條件下，對植物（細胞）進行遺傳改良或使其增殖的各種技術(shù)的總稱，包括細胞水平、分子水平兩個大的層面。細胞學(xué)以及分子生物學(xué)是生物技術(shù)的基礎(chǔ)?！癇iotechnology”meansanytechnologicalapplicationthatusesbiologicalsystems,livingorganisms,orderivativesthereof,tomake,ormodifyproductsorprocessesforspecificuse.二生物技術(shù)進展的歷史和作用（一）組織和細胞培養(yǎng)是園藝植物生物技術(shù)的平臺1838-1839年，Schleiden和Schuwann提出植物和動物均由細胞構(gòu)成，細胞進行分裂而增多，并組建成生物體的“細胞學(xué)講”；同時指出，若提供的條件同在活體內(nèi)一樣，每個細胞應(yīng)該能獨立生存和進展。1943年，White出版了《植物組織培養(yǎng)手冊》。1958年，Steward從煙草髓細胞培養(yǎng)出完整植株，向證明細胞全能性邁進了一大步。該結(jié)果促進了多細胞組織和器官的培養(yǎng)研究與應(yīng)用。1960年Morel培養(yǎng)蘭花莖尖獲得再生植株，并證明脫除了病毒。該結(jié)果催生了蘭花工業(yè)的進展。直到今天，世界蘭花種苗差不多上通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)。同年，Cocking通過酶解法從植物組織中分離得到去除了細胞壁的原生質(zhì)體，使組織培養(yǎng)技術(shù)又向前邁進了一步。1962年，Murashige和Skoog發(fā)表了促進煙草快速生長的培養(yǎng)基配方，即今天十分流行的MS培養(yǎng)基。1964年，Guha和Maheshwari成功地從蔓陀蘿花藥培養(yǎng)得到再生植株，開創(chuàng)了花藥培養(yǎng)獲得單倍體的先河。1971年，Takebe等報道了煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)成為完整植株，至此，植物細胞全能性得到完全證明。次年，Carlson獲得煙草兩個種間的原生質(zhì)體融合再生的體細胞雜種植株。植株組織培養(yǎng)的進展得益于兩個方面的進展。一是對植物激素(planthormone)的認識，以及人工合成激素（生長調(diào)劑劑，plantgrowthregulator，PGR）的生產(chǎn)和應(yīng)用，促進了植物組織培養(yǎng)技術(shù)的進展。1934年Went發(fā)覺了植物生長素；1956年Miller發(fā)覺細胞興奮素。正是這些發(fā)覺帶動了植物組織培養(yǎng)技術(shù)的進展。今天，組織培養(yǎng)研究多數(shù)情形下是在摸索激素配比，也講明了植物激素研究對組織培養(yǎng)的重要性。第二是植物營養(yǎng)學(xué)科的進展。人們認識了植物生長必須的營養(yǎng)物質(zhì)，利用該學(xué)科的成就，不斷改進培養(yǎng)基配方，使得組織培養(yǎng)技術(shù)得到迅速普及。植物組織培養(yǎng)技術(shù)的進展和成熟，有了一個離體無菌的技術(shù)平臺，人們才有可能進行今天的轉(zhuǎn)基因研究，才會有“作物分子設(shè)計”的概念產(chǎn)生，才會有今天依靠離體培養(yǎng)的諸多技術(shù)的產(chǎn)生，如快繁技術(shù)，離體儲存、莖尖微芽嫁接脫除病毒技術(shù)等。能夠講，組織培養(yǎng)技術(shù)是植物生物技術(shù)的差不多平臺，一個作物組織培養(yǎng)技術(shù)的成熟程度能夠阻礙其基因工程的進展。（二）基因工程技術(shù)是以后園藝植物生物技術(shù)的核心基因工程技術(shù)的進展以20世紀70年代DNA重組技術(shù)的建立為標志。人們把1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，作為分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的里程碑。與組織培養(yǎng)技術(shù)的進展歷程類似，基因工程技術(shù)的進展得益于生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細胞學(xué)等多個學(xué)科的進展。1983年，世界上首批轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯咨詢世；1986年，首批轉(zhuǎn)基因植物進入田間實驗；1993年，轉(zhuǎn)基因番茄在美國面市。盡管轉(zhuǎn)基因番茄沒有在美國得到大面積推廣應(yīng)用，但轉(zhuǎn)抗除草劑的大豆、轉(zhuǎn)抗蟲基因的玉米在美國等國家大面積推廣，產(chǎn)品已銷往世界許多國家。（三）生物技術(shù)對園藝科學(xué)進展的奉獻1.脫毒與快繁技術(shù)廣泛用于園藝作物種（苗）的生產(chǎn)2.花藥培養(yǎng)以及小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體以及純合二倍體材料的最佳途徑3.胚搶救技術(shù)克服了果樹早熟品種選育的技術(shù)難題4.細胞融合技術(shù)制造出200多例柑橘體細胞雜種5.分子標記廣泛應(yīng)用于育種和資源研究6.基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化方興未艾（四）園藝植物生物技術(shù)的展望三、課程要求與安排總學(xué)時40，其中理論課30學(xué)時，實驗課10學(xué)時授課教師郭文武：博士/教授程運江：博士/副教授要求：認真聽講，做好實驗，把握差不多原理和技術(shù)成績：平常20%，實驗或期中20%，期末考試60%作業(yè)布置；生物技術(shù)包括哪些內(nèi)容？生物技術(shù)進展經(jīng)歷了哪幾個時期？生物技術(shù)對園藝生產(chǎn)可能帶來哪些革命性的進步？生物技術(shù)進展過程中要注意哪些可能產(chǎn)生負面阻礙的咨詢題？課后自我總結(jié)分析緒論應(yīng)講得宏觀一些，激發(fā)同學(xué)們對該課程的學(xué)習(xí)愛好，同時幸免與后面各章節(jié)內(nèi)容的重復(fù)。注：板書設(shè)計可在授課進程中直截了當用橫線、浪線等標示出。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時備課）第2-5次課8學(xué)時課目、課題（章節(jié)）第二章植物組織與細胞培養(yǎng)技術(shù)要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求把握植物組織培養(yǎng)的原理與技術(shù)了解植物組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝生產(chǎn)與品種改良中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景重點難點組織培養(yǎng)技術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用教學(xué)進程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動、學(xué)時分配、板書設(shè)計）組織培養(yǎng)(Tissueculture)指通過無菌操作分離植物體的一部分，即外植體（explants）接種到人工培養(yǎng)基（medium)，在人工操縱的條件下（包括營養(yǎng)、激素、溫度、光照等）進行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。一植物組織培養(yǎng)類型（一）依照培養(yǎng)方式：（二）依照培養(yǎng)過程分：（三）、依照培養(yǎng)材料分二、組織培養(yǎng)的意義園藝植物組織培養(yǎng)的意義和應(yīng)用加速無性或有性世代的繁育，縮短育種周期或獲得新的基因?？朔h緣雜交不親和的障礙，促進幼胚發(fā)育。獲得三倍體?？焖俜庇缒揪哂匈|(zhì)量好、體積小、便于攜帶、運輸和交流。獲得無病毒苗木。離體儲存（包括超低溫）種質(zhì)資源三、組織培養(yǎng)理論與技術(shù)進展簡史1.探究時期1902年，植物生理學(xué)家（德），依照細胞理論，提出：高等植物的器官和組織能夠不斷分割、直至單個細胞的植物細胞全能性（totipotency）的理論。即植物的體細胞在適當條件下，具有不斷分裂和繁育，進展成完全植株的潛在能力。HABERLANDT2.奠基時期3.迅速進展時期四技術(shù)的進展（一）材料范疇的逐步擴大第二節(jié)組織培養(yǎng)原理與技術(shù)細胞是生物有機體的差不多結(jié)構(gòu)單位，專門是植物細胞又是在生理上發(fā)育上具有潛在全能性的單位。受精卵：能夠產(chǎn)生具有完整形狀和結(jié)構(gòu)和功能的植株。體細胞：也具備遺傳信息的傳遞、轉(zhuǎn)錄和翻譯的能力。Basisforcellculture細胞分化和形狀建成1．合子胚的發(fā)育，經(jīng)歷生長和分化過程，生長為完整結(jié)構(gòu)的有機體；2．體細胞生長（類似），開始是進行生長。從一個分化的有專一功能的細胞，要表現(xiàn)它的全能性，第一要通過去分化（脫分化）的過程，改變細胞原先的結(jié)構(gòu)、功能，而回復(fù)到無結(jié)構(gòu)的分生組織狀態(tài)，即愈傷組織狀態(tài)。愈傷組織分生細胞團再分化，進行形狀建成，而產(chǎn)生完整植株。（體細胞胚胎發(fā)生）最常見的再分化是根的形成：3種方式（1）先形成根的，往往抑制芽的形成；（2）先形成芽的，較易產(chǎn)生根；（3）同時產(chǎn)生芽和根。一樣而言，芽和莖葉原基起源于組織培養(yǎng)中比較表層的細胞（外起源）根原基則發(fā)生在組織較深處（內(nèi)起源）在組織培養(yǎng)中再生植株還可通過與合子胚相似的胚胎發(fā)生過程，即形成胚狀體，而成為完整的植株。有分化胚狀體能力的種子植物已有117種（分屬于34科，75屬）。胚狀體可從以下幾種培養(yǎng)物中產(chǎn)生：1．直截了當從器官上發(fā)生；2．從愈傷組織上發(fā)生；3．從游離的單細胞發(fā)生；4．從小孢子發(fā)生。誘導(dǎo)胚狀體與誘導(dǎo)芽相比，有3個顯著優(yōu)點：1數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整；2胚狀體以單細胞直截了當分化成小植株，比通過愈傷組織再分化要快；3胚狀體一旦形成即可再生小植株，成苗率高。第二節(jié)實驗室設(shè)計及差不多設(shè)備一實驗室設(shè)置（一）基本實驗室預(yù)備室預(yù)備室的功能確實是進行一切與實驗有關(guān)的預(yù)備工作。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。接種室接種室的功能是進行無菌操作。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時刻保持無菌。為了保持清潔，接種室應(yīng)防止空氣對流。培養(yǎng)室培養(yǎng)室的功能是對離體材料進行操縱培養(yǎng)。其首要要求是要能操縱光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。（二）輔助實驗室細胞學(xué)實驗室其功能是對培養(yǎng)材料進行細胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室其功能是進行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情形下可建立此實驗室。生化分析室在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為要緊目的的實驗室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。二培養(yǎng)容器與用具玻璃容器塑料容器金屬用具塑料用具第三節(jié)組織培養(yǎng)基一培養(yǎng)基的種類和成分（一）培養(yǎng)基的種類1．培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)最重要的基質(zhì)。2．培養(yǎng)基的名稱－－多數(shù)以發(fā)表人的名字命名，再加上年號。3．國際上常用的五種培養(yǎng)基：MS：Murashige和Skoog(1962)ER：Eriksson（1965）B5：Gamborg等（1968）SH：Shenk和Hildebrandt（1972）HE：Heller（1953）MS（Murashige和Skoog1962）M6（朱至清1975）：用于禾本科植物花藥組織培養(yǎng)Miller（1963）：一樣組織培養(yǎng)H（Bowgin和Nitsch）：一樣組織培養(yǎng)T（一樣組織培養(yǎng)）White（1963）：一樣組織培養(yǎng)B5（Gamborgetal1968）一樣組織培養(yǎng)C17（王培等1986）：小麥花藥培養(yǎng)W14（歐陽俊聞等1988）：小麥花藥培養(yǎng)KM8P（Kaoetal1975）：原生質(zhì)體培養(yǎng)LloydandMccoun（Lloyd1980）：木本植物培養(yǎng)RM（Reinentetal1967）：蘭花4．各培養(yǎng)基特點MS：用于煙草細胞，硝酸鹽、鉀和銨的含量比其它培養(yǎng)基高。ER：與MS相似，磷酸鹽的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。B5：為培養(yǎng)大豆的細胞組織設(shè)計，銨的含量低。SH：與B5相似，無機鹽的含量稍高。HE：無機鹽濃度稍低，水稻愈傷組織培養(yǎng)上使用。(二)培養(yǎng)基成分要緊為五大類：（一）水（二）無機鹽大量元素微量元素（三）有機化合物1．碳水化合物2．植物激素3.維生素：維生素C、B1、B6、煙酸、葉酸、一樣0.1～0.5mg/L。4．肌醇：一樣用量100mg/L5．氨基酸（四）天然復(fù)合物1．椰乳coconutmilk2．香蕉3．胳朊加水分解物（1）要緊成分為氨基酸，濃度100～200mg/L。（2）受酶和酸的作用易分解。4．馬鈴薯（1）去皮和芽，煮30分鐘，過濾，一樣150～200mg/L。（2）對pH緩沖作用大。5．其它（1）酵母提取液、麥芽提取物、蘋果汁、番茄汁、黃瓜果實、未熟玉米的胚乳。（2）遇熱較穩(wěn)固，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。（五）培養(yǎng)材料的支持物1．瓊脂（agar)（1）凝固劑，一樣0.6～1%.（2）為防止有害物質(zhì)毒害，可加1～10g/L的活性炭。2．其它：玻璃纖維、濾紙橋等。（六）抗生物質(zhì)防止內(nèi)生菌，可加抗生物質(zhì)。二培養(yǎng)基的制備（一）母液配制和儲存（二）配制過程（三）pH值的調(diào)劑（四）培養(yǎng)基分注：趁熱分注（五）滅菌和洗滌三生長調(diào)劑物質(zhì)的應(yīng)用（一）生長素1．吲哚乙酸（IAA）：有天然，也可合成，活力低。遇高溫高壓、遇酶、受光易分解，對器官形成副作用小。2．萘乙酸（NAA）：可人工大量生產(chǎn)，高溫高壓下穩(wěn)固，功能比IAA高3.7倍。3．2,4-D：可促進愈傷組織形成。不同器官對生長素的反應(yīng)根：對生長素最敏銳，低濃度下10－5～10－3PPM，可促進生長；濃度高時，抑制生長。芽：濃度略高時，促進芽的生長。愈傷組織：高濃度的生長素可誘導(dǎo)產(chǎn)生，而且對愈傷組織的再分化也有誘導(dǎo)作用。其它：可促進細胞伸長、分裂、分化；還可促進新成代謝。（二）赤霉素（GA3）1．GA3對整個植株的作用比離體器官或組織作用顯著，這與生長素不同。2．GA3有刺激器官生長的作用，但抑制器官的發(fā)生。3．GA3可刺激植物體內(nèi)生長素的生物合成。（三）細胞分裂素1.對細胞分裂與分化，以及細胞的增大有促進。2.可解除頂端優(yōu)勢，促進側(cè)芽生長。3.可減少葉綠素分解、延緩葉片衰老。4.對根的生長起擬制作用。生長調(diào)劑物質(zhì)的使用溶劑1．水中直截了當溶解困難。IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水；KT、BA等則可用0.1～1N的HCl溶解，再加水。2．也可配制母液，低溫貯存使用，用量極微，一樣用mg/L表示。使用量1．一樣生長為0.05～10mg/l。細胞分裂素0.05～20mg/l。2．生長素和細胞分裂素的比例決定著發(fā)育的細胞類型，愈傷組織再分化是長根或長芽。生長素/細胞分裂素低促進芽形成生長素/細胞分裂素高促進根形成一StepsofMicropropagationStage0–Selection&preparationofthemotherplantsterilizationoftheplanttissuetakesplaceStageI

-InitiationofcultureexplantplacedintogrowthmediaStageII-Multiplicationexplanttransferredtoshootmedia;shootscanbeconstantlydividedStageIII-RootingexplanttransferredtorootmediaStageIV-Transfertosoilexplantreturnedtosoil;hardenedoff二外植體滅菌過程材料與前處理滅菌強度藥劑種類與消毒處理時刻三、組織培養(yǎng)過程中的變異現(xiàn)象（一）現(xiàn)象SomaclonalVariation:variabilityinplantsregeneratedfromtissueculturethatiseitherinducedoruncoveredbyatissuecultureprocess.Mostsomaclonalvariationisnegative,butifenoughplantsareexamined,positivechangescanusuallyberecovered.Thesourceformostbreedingmaterialbeginswithmutations,whetherthemutationoccursinamoderncultivar,alandrace,aplantaccession,awildrelatedspecies,orinanunrelatedorganismTotalsourcesofvariation:Mutation,Hybridization,PolyploidySomaclonalvariationisageneralphenomenonofallplantregenerationsystemsthatinvolveacallusphaseTherearetwogeneraltypesofSomaclonalVariation:Heritable,geneticchanges(altertheDNA)Stable,butnon-heritablechanges(altergeneexpression,AKAepigenetic)Sinceutilizingsomaclonalvariationisaformofmutationbreeding,weneedtoconsidermutationbreedinginmoredetail→InducingMutationsPhysicalMutagens(irradiation)Neutrons,AlpharaysDenselyionizing(“Cannonballs”),mostlychromosomeaberrationsGamma,Beta,X-raysSparselyionizing(“Bullets”),chromosomeaberrations&pointmutationsUVradiationNon-ionizing,causepointmutations(ifany),lowpenetratingChemicalMutagens(carcinogens)ManydifferentchemicalsMostarehighlytoxic,usuallyresultinpointmutations（二）組織培養(yǎng)過程變異的利弊與利用AdvantagesScreenveryhighpopulations(cellbased)CanapplyselectiontosinglecellsDisadvantagesManymutationsarenon-heritableRequiresdominantmutation(ordoublerecessivemutation);mostmutationsarerecessiveCanavoidthisconstraintbynotapplyingselectionpressureinculture,butyouloosetheadvantageofhighthrough-putscreening–havetogrowoutallregeneratedplants,produceseed,andevaluatetheM2Alternative:performonhaploidcelllinesDiseaseResistantSuccessusingSomaclonalVariation第五節(jié)幾種組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝中應(yīng)用一胚培養(yǎng)（EmbryoCulture）EmbryoCultureasaSourceofGeneticVariationRescueF1hybridfromawidecrossOvercomeseeddormancy,usuallywithadditionofhormonetomedia(GA)ToovercomeimmaturityinseedTospeedgenerationsinabreedingprogramTorescueacrossorself(valuablegenotype)fromdeadordyingplantHybridizationCantransfermutantallelesbetweenspeciesCanintroducenewgeneticcombinationsthroughinterspecificcrossesPolyploidyCancombineembryoculturewithchromosomedoublingtocreatenewpolyploidspecies(allopolyploidy)Embryoculturedevelopedfromtheneedtorescueembryos(embryorescue)fromwidecrosseswherefertilizationoccurred,butembryodevelopmentdidnotoccur;Thesetechniqueshavebeenfurtherdevelopedfortheproductionofplantsfromembryosdevelopedbynon-sexualmethods(haploidproductiondiscussedlater)（二）胚搶救（EmbryoRescueProcess）MakecrossbetweentwospeciesDissectembryo(usuallyimmature)Theyoungertheembryo,themoredifficulttocultureGrowonculturemediumusingbasictissueculturetechniques,useforbreedingiffertileManytimes,resultingplantswillbehaploidbecauseoflackofpairingbetweenthechromosomesofthedifferentspeciesThiscanbeovercomebydoublingthechromosomes,creatingallotetraploidsPolyploidsareanothersourceofgeneticvariation→（三）幼胚離體培養(yǎng)的生長發(fā)育方式1.胚性發(fā)育(embryonaldevelopment)：2.早熟萌發(fā)(earlymaturesprouting)（四）胚搶救應(yīng)注意的幾個因素1培養(yǎng)時期自養(yǎng)（autotrophy）異養(yǎng)（heterotrophy）活體內(nèi)胚>帶胎座的胚珠>胚珠>退化或敗育胚2.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件3.碳水化合物4.激素種類和水平5.溫度兩步培養(yǎng)法二胚乳培養(yǎng)（Endospermculture）概況：胚乳培養(yǎng)始于1933年，進行玉米胚乳培養(yǎng)。胚乳培養(yǎng)研究要緊集中探討以下咨詢題：1、胚乳細胞全能性：在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細胞是否與其它體細胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。2、多數(shù)被子植物胚乳是三倍體，能否通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株而得到無籽結(jié)實；通過胚乳培養(yǎng)，探究改良農(nóng)林、園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。3、研究離體培養(yǎng)條件下胚和胚乳的關(guān)系。迄今已有40多種植物進行胚乳培養(yǎng)。蘋果、柚、甜橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等胚乳培養(yǎng)再生了植株。三花藥和花粉培養(yǎng)圖示流程Anther/MicrosporeCultureFactorsGenotypeAswithalltissueculturetechniquesGrowthofmotherplantUsuallyrequiresoptimumgrowingconditionsCorrectstageofpollendevelopmentNeedtobeabletoswitchpollendevelopmentfromgametogenesistoembryogenesis大多數(shù)園藝作物花粉培養(yǎng)適宜的時期為盛花期、處于單核中期至晚期的花粉（單核靠邊期）PretreatmentofanthersColdorheathavebothbeeneffectiveCulturemediaAdditives,Agarvs.‘Floating’（三）花粉培養(yǎng)方法有二種方法，一種是將接種的花藥在培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)數(shù)天，然后將花粉分離出來進行懸浮培養(yǎng)，小孢子便能夠啟動發(fā)育；另一種取出經(jīng)消毒處理的花蕾中的花藥，放在加有4～5ml的液體培養(yǎng)基的小燒杯中。用玻棒或鑷子擠壓花藥，使花粉從花藥中開釋出來。再依照不同植物花粉粒的大小，選用孔徑大小合適的尼龍網(wǎng)（孔徑20～60μm）過濾，除去藥壁組織。過濾后的花粉液再經(jīng)低速離心（100～160r/min）3min，將沉淀用新奇培養(yǎng)期稀釋，重復(fù)兩次，可得到較純潔的花粉群體。然后將花粉進行懸滴培養(yǎng)和液體淺層培養(yǎng)。（四）花粉培養(yǎng)的培養(yǎng)基差不多培養(yǎng)基MS、Nitsch、White和N6、NLN、B5等，其中花粉培養(yǎng)以MS、Nitsch或White最為常用碳源以蔗糖成效較好，一樣花藥培養(yǎng)蔗糖濃度為6%～10%，花粉培養(yǎng)則要求13%左右，不同植物種類品種所需蔗糖濃度有些差異。生長素和細胞分裂素比較常用，一樣低濃度的生長素類物質(zhì)可提高胚狀體的誘導(dǎo)率而高濃度則易使胚狀體發(fā)生愈傷組織化和使單細胞倍性復(fù)雜化。作業(yè)布置；概念：組織培養(yǎng)、體細胞無性系變異、外植體、愈傷組織、胚狀體、細胞全能性、離體儲存等簡答題：簡述組織培養(yǎng)室的差不多設(shè)施；簡述培養(yǎng)基配制的差不多流程、應(yīng)注意哪些方面？簡述組織培養(yǎng)技術(shù)要緊有哪些應(yīng)用？課后自我總結(jié)分析該章是本課程的重點，是同學(xué)們畢業(yè)后能夠應(yīng)用的最基礎(chǔ)技術(shù)；除技術(shù)外，同學(xué)們對差不多建立起一個組培實驗室也專門有愛好。注：板書設(shè)計可在授課進程中直截了當用橫線、浪線等標示出。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時備課）第6-7次課4學(xué)時課目、課題（章節(jié)）第三章原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞融合要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求通過本次學(xué)習(xí)，要求同學(xué)們把握原生質(zhì)體操作的意義、差不多步驟及應(yīng)用，體細胞雜交的概念、融合方法方式、在育種中的應(yīng)用。重點難點原生質(zhì)體分離培養(yǎng)步驟、要緊應(yīng)用；原生質(zhì)體培養(yǎng)方法。原生質(zhì)體融合方法/方式、要緊應(yīng)用；體細胞雜種的遺傳鑒定。教學(xué)進程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動、學(xué)時分配、板書設(shè)計）一、原生質(zhì)體研究概況（一）原生質(zhì)體的概念Protoplast(原生質(zhì)體):anakedcellwithoutcellwallSub-protoplast(亞原生質(zhì)體):incompleteprotoplastwithorwithoutnucleusNucleo-plast(核質(zhì)體):nuclearprotoplastwithlittlecytoplasm(由原生質(zhì)膜和薄層細胞質(zhì)包圍細胞核形成的小原生質(zhì)體，即小原生質(zhì)體)(Miniprotoplast)Micro-protoplast:protoplastwithoneorafewchromosomesCytoplast(胞質(zhì)體):enucleatedprotoplast(不含細胞核而僅含部分胞質(zhì)的原生質(zhì)體)(二)原生質(zhì)體研究進展KeyachievementsinplantPPresearch1880,protoplastwasfirstusedbyHanstein1960,PPisolationfromtomatorootbyenzymeincubationbyCocking1971,mesophyllPPplantregenerationintobaccobyTakebe1981,embryogenicPPplantregenrationbyVardiinIsreal1985,FirstRicePPplantregenerationbyFujimura1986,singlePPculture&plantregenerationinRapeseedbySpangenbergFactsheetinplantPPresearchInHorticulturalcrops,citrusranksfirstinPPresearch.PPplantregenerationsucceededincitrus,persimmon,banana,apple,pear,grape,kiwi,etc.PPregenerationsucceededinover320plantspeciesbelongingto49families&146genera.Tendency:modelplantstostaple&economicplants;annualtoperennialplants.PPplantregenerationispossiblefromalmostallkindsofhigherplants.二、原生質(zhì)體分離（一）原生質(zhì)體分離的材料預(yù)備無菌試管苗葉片上胚軸和子葉

培養(yǎng)細胞（二）預(yù)處理及酶解酶溶劑及其滲透壓溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或?qū)ｉT配制。滲透壓調(diào)劑劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。材料預(yù)處理在游離原生質(zhì)體前對供體材料進行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可提高原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照耀等方法，可提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。例如，龍膽試管苗的葉片只有用4℃低溫處理，甘蔗植株必須先在黑暗條件下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂，柑橘離體葉片在上午、溫室葉片在遮蔭、適宜溫度（26-30C）條件下分離成效較好。酶處理原生質(zhì)體收集和純化過濾400-200目(40-100μ）界面離心法：13%甘露醇/25%蔗糖飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作為滲透壓調(diào)劑劑，先將酶液洗潔凈，再用Percoll飄浮一次。(三)原生質(zhì)體活力測定目測法：在顯微鏡下觀看，依照細胞形狀、流淌性確定原生質(zhì)體活力。

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細胞質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可在熒光顯微鏡下通過具熒光細胞的觀看確定細胞活性。伊凡藍法：伊凡藍不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴峻損壞使，細胞才能被染色，因而能夠通過細胞被染色與否確定活性。（四）阻礙原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時刻、酶溶液的滲透壓分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離連續(xù)時刻環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的阻礙三、原生質(zhì)體培養(yǎng)（一）原生質(zhì)體培養(yǎng)基1．無機鹽大量元素濃度；NO3－和NH4+的比例；對某些植物原生質(zhì)體分裂有抑制作用。有些僅用有機氮，如在菊苣原生質(zhì)體培養(yǎng)中，將培養(yǎng)基中的氨和硝酸鹽全部去掉，只以谷氨酰胺作為氮源，培養(yǎng)成效專門好(Grep，1982)。Ca2+濃度較高的ca”濃度能提高原生質(zhì)體的穩(wěn)固性，有利于原生質(zhì)體生長和發(fā)育2．有機成分

維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。3.激素

常用的激素：NAA、IAA、BA與2,4-D4.滲透壓

常用的滲透壓調(diào)劑劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細胞滲透壓等滲。（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng):Liquidthinlayerculture固體平板培養(yǎng):Solidculture液體－固體雙層培養(yǎng):Liquidsolidculture瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarosebeadculture（三）原生質(zhì)體發(fā)育與植株再生1.細胞壁再生原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后開始再生新的細胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細胞壁。新合成的細胞壁能夠用0.1％熒光增白劑（Calcofluor）染色后在熒光顯微鏡下觀看，可見到綠色熒光圍繞細胞表面，證明細胞壁差不多形成。也可用高滲溶液產(chǎn)生質(zhì)壁分離的方法、電子顯微鏡觀看技術(shù)和冰凍蝕刻法等進行再生細胞壁的研究。電鏡觀看發(fā)覺，原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后新壁開始形成，先是質(zhì)膜合成形成細胞壁要緊成分的微纖維，然后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面進行聚合作用產(chǎn)生多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜與片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐步形成不定向的纖維團，最后形成完整的細胞壁。只有能形成完好細胞壁的再生細胞才能進入細胞分裂的時期。2.細胞分裂和生長原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)天后，胞質(zhì)增加，細胞器增殖，RNA、蛋白質(zhì)及多聚糖合成增加，不久即可發(fā)生核的有絲分裂及胞質(zhì)分裂。原生質(zhì)體一樣培養(yǎng)2～7d后開始第1次分裂，但開始第1次分裂的時刻隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。3.愈傷組織形成大多數(shù)情形下原生質(zhì)體培養(yǎng)二周后，形成多細胞的細胞團，三周后形成肉眼可見的小細胞克隆，大約六周后形成直徑1mm的小愈傷組織。原生質(zhì)體培養(yǎng)7～10天后必需及時添加新奇培養(yǎng)基，否則形成的細胞團不連續(xù)生長。待小愈傷組織長至1mm左右時應(yīng)及時轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進一步生長。（四）阻礙原生質(zhì)體培養(yǎng)的要緊因素

基因型原生質(zhì)體來源

起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基差不多起始密度適宜密度為1-5×105/ml左右培養(yǎng)基激素水平（柑橘不要激素能夠再生）密度與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分完全性五、原生質(zhì)體再生植株遺傳及變異（一）染色體變異染色體倍性變異是原生質(zhì)體再生植株的常見變異類型原生質(zhì)體再生植株的倍性與分離原生質(zhì)體的起始材料有關(guān)。由莖尖、葉肉和胚性組織的細胞分離的原生質(zhì)體能較好地保持原先的倍性；用懸浮培養(yǎng)細胞專門是長期繼代培養(yǎng)的細胞系分離的原生質(zhì)體，較易顯現(xiàn)染色體倍性及數(shù)目的變化。Grosser等（1984）報道由三葉草葉肉原生質(zhì)體再生的植株為二倍體（2n=16），而由培養(yǎng)細胞分離的原生質(zhì)體再生的植株為四倍體（2n=32）。原生質(zhì)體再生植株變異還與植物種類有關(guān)(二)植株表型變異原生質(zhì)體再生植株表型變異包括植物學(xué)性狀、同功酶譜、抗性變異變異程度的大小與起始材料及培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異有關(guān)。原生質(zhì)體再生植株的變異可為體細胞遺傳學(xué)研究和作物改良提供有用的材料。第二節(jié)體細胞雜交一、體細胞雜交的概念概念：體細胞雜交，即原生質(zhì)體融合，將兩個不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)稱為體細胞雜交（A+B）。SH,i.e.protoplastfusion,aprocessofPPsfromtwodifferentparentswereinducedtofuseandthenregenerateintoplantlets,alsonamedasSH(A+B)幾種不同的表述：體細胞雜交：Somatichybridization細胞融合：Cellfusion原生質(zhì)體融合：Protoplastfusion無性雜交：asexualhybridization超性雜交：Parasexualhybridization超性融合：Parasexualfusion細胞操作：Cellmanipulation細胞工程（Cellengineering）相關(guān)的術(shù)語（Terminology）對稱雜種(symmetrichybrid)（雙親給雜種奉獻的遺傳物質(zhì)均為100%）非對稱雜種(asymmetrichybrid)（雙親給雜種奉獻的遺傳物質(zhì)不等（相對值）胞質(zhì)雜種（cytoplasmichybrid,Cybrid）：細胞質(zhì)重組，細胞核未重組對稱融合（symmetricfusion），也稱標準融合（Standardfusion）非對稱融合（asymmetricfusion）：融合前對一方進行處理，使其染色體丟失一部分供-受體融合：Donor-recipientfusion體配融合（gameto-somaticfusion）（性細胞與體細胞融合）亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合：Subprotoplast-protoplastfusion小原生質(zhì)體：Miniprotoplast微原生質(zhì)體：Microprotoplast胞質(zhì)體：Cytoplast胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合:Cytoplast-protoplastfusionTechnicaldevelopmentalhistory1)1970s,establishandoptimizeofPPtechnique2)1972,tobaccointerspecificsomatichybrid3)1975,highCa-highpHPEGfusion;electro-fusionNumerousreports,somewerenotrealistic4)Early1980s,modelplantstostaple/economiccrops,symmetrictoasymmetric,morerealistic5)Late1980s,manyreportsonperennialwoodyplants6)1990stodate,aconventional&safe‘biotech’forplantbreedingincitrus,rapeseed,wheatetc.二、原生質(zhì)體融合（一）融合方法1.PEG-mediatedfusion

Characteristics:1)Meritsinclude:lowinput,highfrequencyofhetero-karyons,nospecieslimit;2)Defectsinclude:tediousfusionprocedure,toxicitytocells.

Workingmechanism:PEG分子具有輕微的負極性，可與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，從而使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進而促進原生質(zhì)體融合；PEG能增加類脂膜的流淌性，也使原生質(zhì)體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。融合液：CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0molpH5.6誘導(dǎo)液：融合液＋PEG20～45％稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0B液(g/100ml)pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.1692．電融合法

Electro-fusion,ElectricallyinducedfusionThreeadvantagescomparedwithPEGfusionNotoxicitytoprotoplastsHigherfusionfrequencySimplermanipulationElectro-fusion:AhighfrequencyACfieldisappliedbetween2electrodesimmersedinthesuspensionofprotoplasts-thisinduceschargesontheprotoplastsandcausesthemtoarrangethemselvesinlinesbetweentheelectrodestoformpearl-chain.Theyarethensubjecttoahighvoltagedischargewhichcausestheirmembranestofusewheretheyareincontact.FusionparametersAlternatecurrentvoltage(交流電壓)TimedurationofAC(交變電場處理時刻)Directcurrentvoltage(直流高頻電壓)Pulsewidth(脈沖寬度)No.ofPulses(脈沖次數(shù))FactorsaffectingPPfusionPPquality(intact,viabilityetc)Fusionmethod(PEGorelectro-)Fusionparameters(電融合參數(shù)、溶液濃度等)

SHIdentificationMorphology:leafshape,thickness,stomadensity&numberCytology：Chromosomenumbers,flowcytometry,FISH/GISHIsozymeMolecularmarkers:RAPD,RFLP,RAPD,SSRetc.體細胞雜交技術(shù)的應(yīng)用Tocircumventbiologicalbarrierstocreatenovelgermplasm(克服生殖障礙，制造新種質(zhì))Totransferbeneficialtraitstoimprovecropquality(轉(zhuǎn)移有益性狀，改良作物品質(zhì))Totransferpartialchromosomestoproduceasymmetrichybrids(轉(zhuǎn)移部分染色體，制造非對稱雜種)Totransfercytoplasmicgenometocreatecybrids(轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組，制造胞質(zhì)雜種)Toserveasbridgematerialforfurtherimprovement&breeding作業(yè)布置；原生質(zhì)體培養(yǎng)有何意義？原生質(zhì)體培養(yǎng)阻礙因素有哪些？體細胞融合與自然生殖過程的融合有何異同？如何增強體細胞融合過程雙親遺傳物質(zhì)的選擇性分配？課后自我總結(jié)分析：內(nèi)容較多，應(yīng)側(cè)重原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合原理與方法以及體細胞雜種的要緊應(yīng)用，輔以典型實例，幸免過多介紹柑橘體細胞雜交。注：板書設(shè)計可在授課進程中直截了當用橫線、浪線等標示出。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時備課）第8-9次課4學(xué)時課目、課題（章節(jié)）要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求了解園藝生產(chǎn)中存在的病毒病類型與檢測方法了解病毒脫除的原理與技術(shù)方法重點難點病毒病脫除技術(shù)；病毒病的類型與分子檢測方法教學(xué)進程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動、學(xué)時分配、板書設(shè)計）一病毒的定義病毒的定義：是一類沒有細胞核、細胞質(zhì)和細胞壁結(jié)構(gòu)，但有遺傳復(fù)制等生命特點，要緊由核酸和蛋白質(zhì)組成的大分子生物。病毒個體相當微小，大多數(shù)病毒在100～300毫微米之間。病毒是結(jié)構(gòu)簡單的微小生命體，病毒粒體有各種不同形狀，由一種核酸（RNA或DNA）”和不處的蛋白質(zhì)（或脂蛋白質(zhì)）衣殼所組成，同時在適宜的條件下至少能夠在一種寄主上引起病害。病毒是傳染性寄生物，它的核酸基因組的重量小于3×108道爾頓，需要有寄主細胞中的核糖體和其它成分才能增殖。二園藝植物病毒病的發(fā)生及危害特點（一）園藝植物病毒病的侵染特性與真菌和細菌病害不同，病毒多為系統(tǒng)性侵染（systemicinfection），即病毒侵染后專門快擴展至植物的全身，因此，從帶有病毒的植株上取接穗或插條繁育的苗木，也帶有病毒。埋伏侵染（latentinfection），這類病毒稱為潛隱病毒（latentvirus）。（二）園藝植物病毒病的發(fā)生及危害特點四重要的園藝植物病毒及類似病原可引起植物的系統(tǒng)性發(fā)病表現(xiàn)特有癥狀外，有的其它病原引起的病害，也表現(xiàn)相似的發(fā)病特點，通常將病毒及這類病原引起病害統(tǒng)稱為病毒類病害。病毒（virus）類病毒（viroid）植原體（phytoplasma）螺原體（spiroplasma）韌皮部及木質(zhì)部限制性細菌等。這類病原引起的病害發(fā)病規(guī)律相似，均可通過嫁接傳染，許多還可經(jīng)由介體昆蟲傳播，在防治策略上也有相同之處。五園藝植物病毒病的防治（一）防治策略(1)栽培無病毒苗木(2)加強檢疫(3)防治傳毒蟲媒(4)抗病毒基因工程（二）抗病毒基因工程將外源基因?qū)胫参?，使植物獲得抗病性。一個重要的策略確實是利用來源于病毒本身的基因，這種通過將病原物基因?qū)胫参锒@得的抗病性稱為病原獲得抗病性（Pathogenacquiredresistance，PAR）。外殼蛋白(coatprotein)基因介導(dǎo)的抗性病毒復(fù)制酶基因運動蛋白基因RNA介導(dǎo)的抗性策略衛(wèi)星RNA,缺陷干擾RNA,反義RNA和RNAi第二節(jié)病毒鑒定及檢測技術(shù)生物學(xué)鑒定血清學(xué)鑒定核酸分析一生物學(xué)鑒定植物病毒都有一定的寄主范疇，并在某些寄主植物上表現(xiàn)特定的癥狀，這種能鑒不某種病毒的植物通常稱為指示植物或鑒不寄主。有些鑒不寄主對病毒的侵染易產(chǎn)生枯斑，因此將產(chǎn)生枯斑的寄主也稱為枯斑寄主。鑒不寄主能夠是草本和木本植物。常用的接種方法包括汁液摩擦接種和嫁接傳染。（一）草本指示植物鑒定植物種類，常用的有藜科、茄科、豆科、葫蘆科等植物。接種方法汁液摩擦法，從待檢植株上取一定的組織，包括葉片、花瓣、根、或枝皮，加入2~5倍（V/W）的提取緩沖液，在低溫條件下研磨，然后蘸取汁液在撒有金剛砂的供試指示植物葉片上輕輕摩擦，接種完畢趕忙用蒸餾水沖洗凈葉片上殘留的汁液。然后將指示植物放在22~28℃、半遮蔭的條件下生長，定期觀看并記錄指示植物的癥狀反應(yīng)。（二）木本指示植物鑒定常用木本指示植物接種方法1.汁液磨擦接種2.嫁接接種（1）雙重芽接法（2）雙重切接法（3）指示植物直截了當嫁接法3.昆蟲傳毒鑒定法二血清學(xué)檢測抗原（antigen）：凡注射到動物體內(nèi)能刺興奮物機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)均可稱為抗原。抗原刺興奮物機體發(fā)生免疫反應(yīng)而產(chǎn)生抗體的特性叫免疫原性；抗原能與所產(chǎn)生的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，這種特性叫反應(yīng)原性；抗原性上述二者合稱。兼具這兩種特性的抗原物質(zhì)稱為完全抗原；只有反應(yīng)原性，沒有免疫原性的抗原物質(zhì)稱為半抗原。（一）植物病毒抗血清制備(1)病毒抗原的分離純化與制備從感染病毒的寄主植物中，通過物理和化學(xué)的方法，將病毒與寄主植物的各種組分分離，以獲得純潔的病毒制品。病毒抗原的制備方法，要緊步驟包括分步沉淀、差速離心和梯度離心等,去雜質(zhì)濃縮病毒。（二）植物病毒抗體制備（1）植物病毒抗血清制備用純化的病毒抗原免疫注射動物獲得。常用動物為家兔，一樣選用半周歲左右、體重2－3千克、健康、自然抗體陰性的日本大耳兔和半耳垂家兔.以上方法制備的抗血清含有多種抗體，這些抗體是由動物的多種淋巴細胞所產(chǎn)生的，因此也稱為多克隆抗體（Polyclonalantibody，Pab）(2)單克隆抗體單克?。∕onoclone）即是單一的無性細胞系，或稱單細胞系。單克隆抗體確實是由免疫動物的單細胞系所產(chǎn)生的抗體。（三）常用血清學(xué)檢測方法（1)免疫電鏡技術(shù)（Immunoelectronmicroscopy，IEM）是將抗原與抗體的專化性免疫反應(yīng)與電鏡觀看相結(jié)合的一種病毒檢測方法。其操作簡便、結(jié)果判定直觀?？乖健庖咝揎棥旧干潆婄R觀看(2)酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay，ELISA）酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay，ELISA）具有檢測靈敏度高、快速、簡便、準確等優(yōu)點，不需要提純病毒，可在較短時刻內(nèi)檢測大量樣品。直截了當法即所用酶標抗體為病毒特異抗體，因此針對不同抗體需分不進行標記；間接法所用酶標抗體為通用的市售抗體，如：羊抗兔酶標抗體、羊抗鼠酶標抗體等，因此無需對每一抗體進行標記雙抗體夾心法（DoubleantibodysandwichELISA，DAS-ELISA）是一種直截了當法。第一用病毒特異性抗體（IgG）包被微板孔，然后加入待檢樣品粗提液，使包被的抗體捕捉樣品中的病毒粒子，再加入酶標抗體，最后加入底物，室溫避光放置一定時刻后，判定結(jié)果A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法（ProteinAsandwichELISA，PAS-ELISA）為一種間接法。第一用A蛋白包被微板的孔，然后加入病毒的抗體，再加入待檢樣品粗提液，經(jīng)第二層抗體與病毒結(jié)合，加入酶標記A蛋白，最后加入底物，室溫避光放置一定時刻后，判定結(jié)果。(3)直截了當組織免疫雜交分析（Directtissueblotimmunoassay，DTBIA）也稱組織免疫印跡ELISA（TissueprintingELISA）分析，是ELISA的另一形式，其原理與ELISA相似，所不同的是用一種專門的薄膜代替常規(guī)的微量板作固相支持物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生的是不可溶的有色物質(zhì)沉積在帶病毒的部位，觀看有色物質(zhì)即可判定是否帶有病毒。通過組織切面在膜上產(chǎn)生印跡，將抗原直截了當束縛在膜上，不需要制備或提取樣品，而且可直截了當提供病毒在組織中的分布信息，專門適合于韌皮部限制性病毒的檢測，具有靈敏度高、結(jié)果可靠和快速的特點，該項技術(shù)已成功應(yīng)用于柑橘速衰病毒（CTV）的檢測（四）核酸分析電泳分析在類病毒的檢測中應(yīng)用廣泛，類病毒為環(huán)狀單鏈RNA分子，大小為246~375個核苷酸（nt），內(nèi)部堿基高度互補。在自然情形下形成棒狀或三葉草狀的二級結(jié)構(gòu)，在常規(guī)電泳條件下遷移較快；在變性條件下，由于二級結(jié)構(gòu)破壞而成環(huán)狀，在電泳介質(zhì)中遷移減緩，而與其它小分子物質(zhì)分開，表現(xiàn)類病毒的特有電泳條帶。因此雙向電泳也是鑒不一種病原是否為類病毒的常用技術(shù)。PCR技術(shù)病毒和類病毒的基因組成差不多明確，能夠依照已知序列設(shè)計特異引物進行PCR檢測核酸雜交技術(shù)探針第三節(jié)園藝植物病毒脫除技術(shù)一無病毒的培養(yǎng)方法熱處理莖尖培養(yǎng)脫毒其它組織培養(yǎng)脫毒莖尖微芽嫁接脫毒熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒化學(xué)治療脫毒二、熱處理脫毒柑橘黃龍病50℃50min蒸氣或37℃，3周柑橘衰退病40/30變溫，7－12周柑橘碎葉病40/30變溫，8周草莓斑駁病37－38℃，2周通常，熱處理對球狀、線狀病毒、類菌質(zhì)體、類細菌體是有效的。對類病毒沒有成效。三莖尖脫毒1．White（1943年）第一發(fā)覺了感染煙草花葉病毒的煙草植株生長點鄰近病毒濃度專門低；2．Morel等（1953）從感染花葉病毒的大麗菊分離出了莖尖分和組織，并得到無病毒植株。3．以后，相繼在其它植物培養(yǎng)成功，如：馬鈴薯、菊花、蘭花、百合、草莓、矮牽牛、蔦尾；四其它方法脫毒1．愈傷組織培養(yǎng)無病毒苗：取材方便，一次可得到大量無病毒苗；2．莖尖微體嫁接培養(yǎng)：桃、柑桔、蘋果等，砧木試管培養(yǎng)，然后嫁接無病芽；3．珠心胚培養(yǎng)：柑桔類，通過珠心細胞產(chǎn)生無性胚（珠心胚），培養(yǎng)能夠得到無病毒的珠心胚苗。4.花粉培養(yǎng)獲得無病毒苗木五莖尖微芽嫁接脫毒培養(yǎng)無病毒植株解決生根難的咨詢題莖尖嫁接苗無童期的，能快開花結(jié)果。從1980年開始，農(nóng)業(yè)部在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)建立了柑橘研究所，在章文才教授的主持下，仿照西班牙無病毒良種生產(chǎn)程序，領(lǐng)先在我國進行柑橘莖尖微芽嫁接及無病毒良種繁育技術(shù)研究，該項目1986年獲農(nóng)業(yè)部科技進步二等獎。此后后，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘研究所為全國柑橘主產(chǎn)區(qū)培養(yǎng)了大批技術(shù)骨干。1988至1991我所與廣西農(nóng)墾局橫向聯(lián)合，培養(yǎng)了12個優(yōu)良柑橘品種脫毒苗200余株，為廣西省無病毒柑橘推廣起到了良好的示范作用。莖尖嫁接脫毒的原理莖尖微芽嫁接脫毒：依照一樣病毒在植物體內(nèi)分布不平均，頂端生長點的分生組織不帶毒或檢查不到病毒的原理，通過莖尖嫁接脫毒得到無毒苗。目前莖尖嫁接方法可脫去柑桔大多數(shù)病害，這一方法被世界各國普遍采納，成為獲得柑桔良種無毒植株的要緊手段。操作方法：試管砧木苗的培養(yǎng)莖尖消毒和嫁接移栽試驗病毒鑒定六幾種常見園藝病毒病及脫除（一）柑橘黃龍病病癥黃龍病又名黃梢病，國外稱青果病，是國內(nèi)外檢疫對象。過去稱之為類細菌[Bacteria-likeorganism(BLO)]，最近國外研究證實為一種細菌又稱難培養(yǎng)細菌[Fastidiousbacteria(FB)]。該病遠距離傳播，通過帶菌苗木和接穗的調(diào)運。從病區(qū)傳播到新區(qū)。田間初侵染源來自病樹，柑橘木虱是傳病的介體昆蟲。最感病的品種為蕉柑和蘆柑，其次為甜橙和柚，溫州蜜柑則較耐病。1傳播媒介—木虱2癥狀①斑駁型黃化，葉片呈黃綠相咨詢的不平均斑塊狀，這種類型最為常見，是田間診斷黃龍病的要緊依據(jù)。②平均黃化型，即呈平均的淺黃色。③缺素型黃化，顯現(xiàn)在中、晚期病樹上，葉脈及其鄰近呈綠色，而葉肉呈黃色，類似缺鋅、缺錳癥。患病樹葉小，質(zhì)硬，無光澤，常早落。開花多而早，花瓣短小肥厚，多個花朵集合成團，落花落果嚴峻。果實小，畸形果臍歪斜，著色不均，有的品種果蒂周圍變紅色，而其余部分仍為青色，俗稱“紅鼻果”。3防治方法①實施檢疫，嚴禁病區(qū)苗木向新區(qū)、無病區(qū)調(diào)運。②建立無病苗圃，培養(yǎng)推廣無病苗木。③及時挖除病樹并集中燒毀。④防治柑橘木虱，在每次抽梢期噴藥1—2次，操縱傳病蟲媒，抑制病害蔓延。4.指示植物長春花苗接種黃龍病病原，葉片顯現(xiàn)黃化斑駁。（二）柑橘衰退病又名速衰病，在我國分布普遍，要緊為害以酸橙為砧木的嫁接樹。由于我國目前栽培的柑橘一樣采納耐病的砧木，故大多植株帶病而不表現(xiàn)明顯癥狀。1.癥狀橙作砧木的甜橙苗木，一樣在嫁接當年于6—7月開始顯癥，新梢部分葉片主側(cè)脈鄰近綠色，葉肉黃化，似缺鋅癥。后主側(cè)脈鄰近也褪綠，呈平均黃化。黃化葉片中間常留近圓形小綠島。苗木發(fā)病后第二年黃化不顯著，但生長衰弱。嫁接口上部主干表現(xiàn)腫大、切下嫁接口交叉處的皮層，可看到病樹內(nèi)皮層上：顯現(xiàn)“蜂窩”狀陷點，木質(zhì)部外表則顯現(xiàn)剛毛狀小突刺。大樹發(fā)病常大部分大枝或個不大枝先表現(xiàn)。發(fā)病植株矮化，抽梢少或不抽梢、老葉失去光澤并顯現(xiàn)不同程度的黃化。病樹逐步落葉，自頂部向下枯梢，緩慢衰亡。有時病樹顯癥后不久即突然凋萎枯死，故稱之速衰病。指示植物墨西哥來檬、尤力克檸檬和葡萄柚上的癥狀為新長出的葉片顯現(xiàn)“明脈”，莖干的木質(zhì)部顯現(xiàn)凹陷點或凹陷條溝。植株矮化，葉脈木質(zhì)化，葉片黃化呈匙狀。2.防治方法①選擇耐病砧木，如枳、酸橙、枳橙和紅桔等。②選用無病毒的繁育材料。③防治媒介昆蟲蚜蟲。④用弱毒株系預(yù)先接種，干擾強毒株系的侵染為害。3.病原和發(fā)病規(guī)律由柑橘衰退病毒(CitrusTristezaVlrus簡稱CTV)引起。遠距離傳播通過帶病苗木和嫁接材料調(diào)運，田間要緊通過蚜蟲傳播。作業(yè)布置；什么叫病毒？園藝作物病毒病發(fā)生和傳播有何特點？如何防治病毒??？園藝植物病毒鑒定有哪些方法？園藝作物病毒病如何脫除？課后自我總結(jié)分析內(nèi)容較多，脫毒原理與要緊方法應(yīng)重點講解。注：板書設(shè)計可在授課進程中直截了當用橫線、浪線等標示出。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時備課）第10-11次課4學(xué)時課目、課題（章節(jié)）第五章分子標記技術(shù)要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社張獻龍植物生物技術(shù)科學(xué)工業(yè)出版社，2005教學(xué)目的和要求要求同學(xué)們把握分子標記的差不多原理、要緊分子標記類型，以及在園藝植物研究中的應(yīng)用。重點難點分子標記的要緊類型和應(yīng)用；分子標記的差不多原理。教學(xué)進程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動、學(xué)時分配、板書設(shè)計）分子標記的原理DNA是要緊的遺傳物質(zhì)DNA的生物學(xué)特性DNA檢測技術(shù)目前常用的分子標記技術(shù)RFLPRAPDSSRAFLP分子標記在園藝植物中的應(yīng)用品種鑒不與產(chǎn)權(quán)愛護種質(zhì)資源研究分子標記輔助育種構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位與克隆重要概念：1、遺傳標記（Geneticmarkers)：是能明確反映遺傳多態(tài)性的生物特點，它包括：形狀標記、細胞學(xué)標記、生化標記和分子標記2、遺傳多態(tài)性(Geneticpolymorphisms)：經(jīng)典遺傳學(xué)中指等位基因的變異；現(xiàn)代遺傳學(xué)中指的是基因組中任何位點上的相對差異。3、分子標記：能明確反映遺傳多態(tài)性的外觀性狀，一樣用肉眼可識不，或物理儀器便可識不的性狀。4、細胞學(xué)標記：能明確反映遺傳多態(tài)性的細胞學(xué)特點，染色體結(jié)構(gòu)的數(shù)目是常見的細胞學(xué)標記，它能反映染色體結(jié)構(gòu)的數(shù)目的遺傳多態(tài)性（染色體缺失、重復(fù)、倒位、易位）。5、生化標記：可分為酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩類。在非酶蛋白質(zhì)中用得最多的是種子貯藏蛋白；同工酶（isoenzyes）：催化功能相同，但結(jié)構(gòu)的生理性質(zhì)不同的一類酶。6、DNA標記：一切能揭示DNA多態(tài)性的技術(shù)手段；它是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直截了當反映，可分為：基于DNA-DNA雜交的標記；基于PCR的DNA標記；PCR與雜交相結(jié)合的標記；SNP。7、RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）：RestrictionFragmentLengthPolymorphism，物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當多的大小不等的片段，用放射性同位素標記的DNA作探針，把與被標記DNA相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜8、PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）：PolymerphaseChainReaction，是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制。9、RAPD(隨機擴增的多態(tài)性DNA）：RandomamplificationofPolymorphicDNA，以PCR為基礎(chǔ),利用人工合成的約10b的隨機序列寡核苷酸作引物,以生物的基因組DNA為模板,進行PCR擴增,產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物,通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA序列的多態(tài)性。RAPD反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)可多達40—50次,每次循環(huán)中,雙鏈DNA在95℃的高溫下變性,解開雙螺旋成為單鏈模板,然后在低溫(36℃)條件下與隨機引物結(jié)合,在DNA多聚酶的作用下，按堿基互補原則沿5‘至3’的方向把核苷酸鏈延長，完成DNA復(fù)制。如此反復(fù)數(shù)十次,能夠使單一的DNA序列擴增105-107倍。10、SSR（簡單序列重復(fù)）:SimpleSequenceRepeat，又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite）或短的串聯(lián)重復(fù)（ShortTandemRepeat,STR)；一類由幾