GB-T《核酸適體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》

ICSFORMTEXT07.080FORMTEXTB20/39中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2017FORMTEXTFORMTEXT核酸適體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范FORMTEXTGeneraltechniquerulesforscreeningandpreparationofaptamerFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)FORMDROPDOWNFORMTEXTFORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施GB/TXXXXX—2017核酸適體篩選制備技術(shù)通則范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了核酸適配體篩選條件與流程的優(yōu)化，建立高效、快速、標(biāo)準(zhǔn)化的篩選技術(shù)通則。本標(biāo)準(zhǔn)適用于針對(duì)小分子、大分子、細(xì)胞、以及復(fù)雜靶標(biāo)等不同層次靶標(biāo)體系的核酸適配體篩選。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求術(shù)語(yǔ)和定義核酸適配體(Aptamer)能夠與多種目標(biāo)物（蛋白、藥物、金屬離子、無(wú)機(jī)或有機(jī)分子、細(xì)胞、組織）發(fā)生高親和性和特異性結(jié)合的一類(lèi)單鏈核苷酸（DNA或RNA）分子。指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX)利用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)寡核苷酸對(duì)相應(yīng)靶標(biāo)物質(zhì)的高親和性和高特異性，在隨機(jī)序列文庫(kù)中，通過(guò)多次循環(huán)選擇富集，來(lái)獲取所需的特定結(jié)構(gòu)或功能核酸適配體的過(guò)程。操作步驟文庫(kù)的構(gòu)建DNA文庫(kù)的構(gòu)建核酸適配體篩選的單鏈DNA文庫(kù)是由兩端的固定引物區(qū)加上中間的隨機(jī)區(qū)構(gòu)成。固定引物區(qū)的設(shè)計(jì)遵循一般PCR引物設(shè)計(jì)規(guī)則。中間隨機(jī)區(qū)的長(zhǎng)度決定文庫(kù)的庫(kù)容量，通常為20-50堿基。初始文庫(kù)一般包含1015～1018個(gè)隨機(jī)DNA序列。RNA文庫(kù)的構(gòu)建篩選RNA核酸適配體應(yīng)先合成DNA文庫(kù)分子且序列5’端帶有T7啟動(dòng)子識(shí)別序列，轉(zhuǎn)錄成RNA分子篩選文庫(kù)。不同靶標(biāo)的篩選細(xì)胞的篩選細(xì)胞的篩選分為懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞篩選。懸浮細(xì)胞篩選應(yīng)通過(guò)離心法；貼壁細(xì)胞篩選應(yīng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中通過(guò)孵育清洗，吸棄上清保留細(xì)胞。大分子的篩選大分子的篩選應(yīng)將大分子偶聯(lián)到固相的載體上，分析固相載體的性質(zhì)，選擇磁性分離、離心分離和超濾分離等。小分子的篩選小分子的篩選應(yīng)根據(jù)小分子靶標(biāo)的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和核酸適配體的應(yīng)用目的，選擇固定靶標(biāo)或固定核酸庫(kù)的方法進(jìn)行分離。復(fù)雜靶標(biāo)的篩選復(fù)雜靶標(biāo)的篩選應(yīng)根據(jù)復(fù)雜靶標(biāo)的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇電泳分離、孵育清洗分離，要考慮消減或反篩驗(yàn)證方法，保證降低非特異性結(jié)合。結(jié)合效率的測(cè)定在每一輪篩選的過(guò)程中應(yīng)設(shè)立對(duì)應(yīng)的結(jié)合效率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)熒光定量PCR的Cq值計(jì)算出每一輪與靶標(biāo)結(jié)合的核酸分子數(shù)，與投入的總分子數(shù)比值，得到結(jié)合效率結(jié)果。擴(kuò)增常規(guī)PCR擴(kuò)增將4.2得到的與靶標(biāo)特異性結(jié)合的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，常見(jiàn)的PCR體系見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5～10分鐘，95℃變性，55～60℃退火，72℃延伸，擴(kuò)增35～40個(gè)循環(huán)。常見(jiàn)的PCR體系名稱(chēng)終濃度10×聚合酶buffer1×dNTP0.2～0.5mM正向引物0.025～0.5μM反向引物0.025～0.5μMDNA聚合酶0.02U/uL熒光染料1～3×模板小于總體積1/10總體系（用水補(bǔ)足）20～100uL微滴式PCR擴(kuò)增微滴式PCR應(yīng)按照4.3.1的PCR體系配置，進(jìn)行微滴生成后應(yīng)按照4.3.1的擴(kuò)增程序進(jìn)行，擴(kuò)增得到的DNA產(chǎn)物應(yīng)通過(guò)正丁醇純化后制備單鏈。次級(jí)文庫(kù)制備DNA次級(jí)文庫(kù)的制備應(yīng)采用磁珠法、酶解法、不對(duì)稱(chēng)PCR法和長(zhǎng)短鏈法中的一種或多種。RNA文庫(kù)的制備應(yīng)將PCR得到的雙鏈DNA為模板進(jìn)行體外的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳回收。獲得的單鏈產(chǎn)物后應(yīng)采用分光光度計(jì)法測(cè)量A260/280，進(jìn)行質(zhì)量及純度檢驗(yàn)。多輪篩選和篩選進(jìn)程監(jiān)測(cè)將4.4獲得的靶標(biāo)與文庫(kù)孵育，分離未結(jié)合的核酸，重復(fù)4.3-4.4過(guò)程10-20次。篩選過(guò)程中應(yīng)逐輪增加篩選壓力，方法主要包括：減少投入的單鏈DNA文庫(kù)的量、靶標(biāo)的用量和兩者的孵育時(shí)間等。親和力檢測(cè)在每輪篩選的同時(shí)應(yīng)設(shè)立平行的結(jié)合效率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)的變化監(jiān)測(cè)庫(kù)容PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)達(dá)到平臺(tái)期之后，應(yīng)停止篩選并將該輪文庫(kù)的親和力。核酸適配體分析克隆測(cè)序獲得具有親和力的篩選文庫(kù)應(yīng)用未標(biāo)記的引物擴(kuò)增后進(jìn)行克隆和測(cè)序。高通量測(cè)序獲得具有親和力的篩選文庫(kù)應(yīng)按照高通量測(cè)序要求準(zhǔn)備后進(jìn)行高通量測(cè)序并分析。核酸適配體序列結(jié)構(gòu)分析測(cè)序結(jié)果應(yīng)利用分析生物學(xué)軟件進(jìn)行核酸適配體的同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析，并預(yù)測(cè)核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。防污染措施檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北食品檢驗(yàn)研究院等