微生物的遺傳物質(zhì)

微生物的遺傳物質(zhì)染色體是微生物基因組的結(jié)構(gòu)單位，習(xí)慣上把原核生物的DNA分子也稱為染色體?；蚴蔷幋a功能性產(chǎn)物的一段具有特征結(jié)構(gòu)的DNA片段（以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒除外）。第一節(jié)遺傳物質(zhì)DNA的結(jié)構(gòu)和復(fù)制一、DNA的結(jié)構(gòu)4種脫氧核苷酸由3‘5’磷酸二酯鍵聚合而形成DNA的堿基順序一級結(jié)構(gòu)DNA結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)DNADoubleHelixmodelWatson&Crick,19533.4nm1nmB-DNA是在有堿金屬存在及92%濕度條件下，經(jīng)X光衍射分析得到的。A-DNA是在75%濕度條件下DNA纖維通過X光衍射分析得到的。右手雙螺旋結(jié)構(gòu)1979年，發(fā)現(xiàn)了左手雙螺旋DNA，稱為Z-DNA是由兩條反向平行的多聚核苷酸相連而成的。Z-DNA可能在基因表達(dá)調(diào)控中起作用。但確切的生物學(xué)功能尚待研究。ABZ三級結(jié)構(gòu)E.coli的染色體長度>1mm，比其細(xì)胞本身長1000倍，所以一定存在著超螺旋結(jié)構(gòu)；在真核生物中核小體的形成引入負(fù)超螺旋，在細(xì)菌和古細(xì)菌中是DNA回旋酶引起超螺旋。DNA的不同形式有：環(huán)狀和線狀通常細(xì)菌的染色體DNA，質(zhì)粒DNA，以及真核生物的線粒體DNA和葉綠體DNA為環(huán)狀二、DNA的復(fù)制特點和幾種主要的復(fù)制方式1.基本概念2.復(fù)制起點與方向

3.Semi-ConservationReplication

4.復(fù)制的方式

1.基本概念

(BasicConcept)Watson&Crick:

一種遺傳物質(zhì)，必須能行使兩種功能，即自我復(fù)制和對細(xì)胞的高度特異性的影響遺傳物質(zhì)的基本屬性：基因的自我復(fù)制基因的突變可以控制性狀的表達(dá)DNA復(fù)制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP,合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程?！馬eplicon;●Replisome;

每一個復(fù)制起點及其復(fù)制區(qū)稱為一個復(fù)制單位

Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

復(fù)制機理的復(fù)雜性

D.S.DNAS.S.DNA能量的供求構(gòu)型的變化超螺旋線狀，開環(huán)狀多種酶類的互作ReplisomeDNA復(fù)制起始控制機理知之甚少復(fù)制的準(zhǔn)確性（修復(fù)，校正）研究試材的特殊性（溫度敏感型ts，突變抑制體系Su）DNA復(fù)制速度(E.coli105bp/min，高速解旋112km/h?)缺乏統(tǒng)一的模式(D.S.DNA,S.S.DNA,LinearDNA….)

原核生物的復(fù)制起點（Originofreplication，簡稱ori）例如，E.coli的oriC，長度為245bp真核生物多個復(fù)制起點，例如釀酒酵母，約有400個復(fù)制起點（autonomouslyreplicatorysequence，ARS），每個長度為100-200bp。2.復(fù)制起點與方向（replicationorigin&direction）

isolationofori

richAT&palindromEnzymesbindingsite300bp±inreplicationorigin0fProkaryoteATrich復(fù)制起點的特征ATrich真核生物復(fù)制起點的研究是以酵母為基礎(chǔ)的ARS(automaticReplicationSequence)自主復(fù)制序列ARS1(A,B1,B2,B3)A區(qū)具有高度保守性

A/TTTTATG/ATTTA/TB區(qū)變化較大

“呼吸現(xiàn)象”

DNA復(fù)制原點處氫鍵迅速斷裂與再生，導(dǎo)致兩條DNA鏈不斷解鏈與聚合，形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程。在富含AT的區(qū)域內(nèi)尤為明顯子鏈DNA延伸方向

DNApolymerasereactsonthe3’endonlyNewDNAelongationfrom5’to3’direction進(jìn)化中保留的深刻的、選擇與適應(yīng)的、化學(xué)及功能的根源

5’OHTCATCAC

5’OH3’pppOHC++ppi如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+5’pppOH3’

GpppOH

GATCG5’pppOH3’ATCG

+5’pppOH3’

GpppOH

G5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理環(huán)境中，磷酸基團(tuán)間的強電負(fù)性，使dNTP難以聚合到DNA的5‘端，而且雙鏈DNA的5’端堿基配對困難需要其他機制以解脫堿基發(fā)生錯配后的校正……費時、費能、增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗

A

TCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH3.DNA的半保留復(fù)制（Semi-ConservationReplication）

Threereplicationhypotheses(CsClgradientcentrifuge)

N15

N14DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuousreplication）

后隨鏈前導(dǎo)鏈5‘3’3‘5’3‘5’5‘3’4.DNA復(fù)制的方式

(DNAreplicationmodel)

●θ型復(fù)制1963年，Cairns根據(jù)E.coli的環(huán)狀染色體復(fù)制的中間產(chǎn)物自顯影實驗提出的。形狀象“θ”●滾環(huán)方式

D.S.DNA→Nick→Elongation→rolling合成互補鏈，形成雙鏈A蛋白識別起點，產(chǎn)生切口polIII催化延長正鏈環(huán)化形成雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生A蛋白,識別復(fù)制起點●置換式或D-Loop（Displacementform）

D.S.DNA

InmitochondrialDNAalsoinchloroplasmDNA

→S.S.DNAastemplate→NewS.S.DNA→Displacement→D-Loop重鏈復(fù)制D-環(huán)延伸形成D-環(huán)輕鏈開始復(fù)制重鏈復(fù)制完成輕鏈正在復(fù)制輕鏈復(fù)制完成封閉新合成鏈上的缺口第二節(jié)原核生物的染色體及其復(fù)制原核生物染色體80%以上DNARNA蛋白質(zhì)環(huán)狀雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞內(nèi)相對集中的區(qū)域，成為擬核。無核膜。

一、原核生物染色體的數(shù)目和大小E.coli有1條環(huán)狀染色體，4.7MbB.subtilis有1條環(huán)狀染色體，4.2MbAgrobacteriumtumefaciens有1條線性染色體，2.1Mb；1條環(huán)狀染色體，3.0Mb。二、細(xì)菌染色體的結(jié)構(gòu)

參與DNA折疊的蛋白質(zhì)類組蛋白與DNA結(jié)合后，幫助DNA進(jìn)行高度折疊，除類組蛋白外，DNA還與其他蛋白質(zhì)相結(jié)合。如與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和加工有關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，這樣，其環(huán)狀染色體DNA以緊密纏繞的、致密的、不規(guī)則小體形式存在，該小體即是擬核。電鏡下呈圓形或橢圓形。擬核：三、細(xì)菌染色體的復(fù)制細(xì)菌的復(fù)制基因與酶類

Initiategenes

dnaBprepriming300kd~20copies/cellhexamerRNApolprimaseforleadingS.dnaCactswithdnaB25kddnaGprimaseforlaggingS.60kd~25(Okazakifragment)monomer

SSB

BindingwithS.S.DNA74kd~300PreventsfromannealmonomerElongategenesdnaE

DNApolymeraseIII(α)140kd~20dnaZ

DNApolymeraseIII(β)52kd~20polADNApolymeraseI109kd~400polBDNApolymeraseII90-120kd~100Topoisomerase

topATopI(swivelase)100kdsuperhelix→D.S.helixTopoisomerase

gyrαTopII(gyrase)gyrβD.S.helix→superhelixCutD.S.DNAATPLigateTopoisomeraserep

Relaxedprotein(Helicase)D.S.DNA→S.S.DNAligLigase

HDP

HelixDi-stabilizingProteinNoATPaseBindingS.S.DNAdecreaseTmPreventsfromannealb)DNA聚合酶（DNApolymerase）

Prokaryote

IpolA109KD3’-5’和5’-3’外切酶活性切除RNA引物和參與后隨鏈合成中的缺口填充反應(yīng)IIpolB3’-5’外切酶活性III10種不同的亞基組成核心酶和全酶

TopI,TopIIHelicase(repprotein)SingleStrandBindingprotein(SSB)Helixdestabilizingprotein(HDP)DnaBproteinDnaCproteinPrimaseUng-aseDNAPolymeraseIII

DNAPolymeraseI

Ligaseforprimosome復(fù)制體進(jìn)化中形成了靈活的多酶復(fù)合體replisome進(jìn)化中形成了靈活的多酶復(fù)合體replisome

位于復(fù)制叉處的多酶復(fù)合體完成

laggingStrandDNA延伸時必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎片段InlaggingStrand多酶系統(tǒng)必須完成多次反復(fù)的啟動與擴(kuò)展

E.coli啟動2000—4000次的岡崎片段復(fù)制Replisomemodel復(fù)制起點AT豐富DNA識別位點DNAbox5’-TTATCCACA-3’13個富含AT的單核苷酸5’-GATCTNTTNTTTT-3’大腸桿菌染色體復(fù)制起點oriC的結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制過程鏈的生長原理起始階段:識別oriC復(fù)制叉起始階段:雙鏈分開起始階段:引物的合成延伸階段:TheterminationofDNAreplication

E.coli(單起點雙方向)兩復(fù)制叉的相遇處具有多個終止位點(不是復(fù)制叉簡單相遇）terE,D,AterF,C,B(22bp保守區(qū))FBTerminusUtilizationSubstance（TUS36kd）CADETer-TUS復(fù)合體終止階段:terE,D,A僅對反時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng)

terF,B,C僅對順時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng)FBCADETer-TUS復(fù)合體(Rep.forktrap)終止DnaB(螺旋酶)防止DNA過度復(fù)制避免出現(xiàn)DNA多聚體，高拷貝四、細(xì)菌染色體的分離機制第三節(jié)基因結(jié)構(gòu)和基因組基因結(jié)構(gòu)和基因概念的發(fā)展基因組學(xué)大腸桿菌的基因組ΦX174噬菌體的基因組真核生物的基因組及其特點原核基因結(jié)構(gòu):-35,-10區(qū)的特征真核基因結(jié)構(gòu):增強子,外顯子,內(nèi)含子一、基因結(jié)構(gòu)和基因概念RNA剪切基本概念geneoverlappinggenesplitgenepseudogenemovablegeneIntronexonORFenhancersilencerpromoterterminator二、基因組學(xué)基因組的大小:病毒103bp原核生物106bp真核生物1