酶的人工模擬

關(guān)于酶的人工模擬一、模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略

酶是高效的催化劑，它的應(yīng)用日趨廣泛。由于酶容易受到多種物理、化學(xué)因素的影響而變性失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑。模擬酶是人工合成的高分子化合物，它模擬酶的結(jié)構(gòu)和催化特性，并且能耐較惡劣的環(huán)境，活性穩(wěn)定而持久。

1.模擬酶的概念第2頁,共108頁，2024年2月25日，星期天研制模擬酶的基礎(chǔ)

20世紀(jì)70年代以來，由于對蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、X射線衍射技術(shù)及光譜技術(shù)的發(fā)展，人們對許多酶的結(jié)構(gòu)有了較深入的了解，對酶的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)理能夠在分子水平上作出解釋。動力學(xué)方法的發(fā)展以及對酶活性中心、酶抑制劑復(fù)合物和催化反應(yīng)過渡態(tài)等結(jié)構(gòu)的描述，促進(jìn)了對酶作用機(jī)制的研究，從而為人工模擬酶的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。

第3頁,共108頁，2024年2月25日，星期天模擬酶的概念

模擬酶就是根據(jù)對酶催化作用起主導(dǎo)作用的因素，利用有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等方法設(shè)計和合成一些較天然酶簡單的非蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子，在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶作用機(jī)理和立體化學(xué)特性，以這些分子作為模型來模擬酶對其底物的結(jié)合和催化過程，以求模擬酶保留酶的高效性和專一性，克服其穩(wěn)定性差等缺點。第4頁,共108頁，2024年2月25日，星期天“主－客體”化學(xué)

Pederson和Cram報道了一系列光學(xué)活性冠醚的合成方法。這些冠醚可以作為主體而與伯銨鹽客體形成復(fù)合物。Cram把主體與客體通過配位鍵或其他次級鍵形成穩(wěn)定復(fù)合物的化學(xué)領(lǐng)域稱為“主－客體”化學(xué)（host-guestchemistry）。主－客體化學(xué)的基本意義來源于酶與底物的相互作用，體現(xiàn)為主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ)，這種主－客體互補(bǔ)與酶和它的底物結(jié)合情況相似。

第5頁,共108頁，2024年2月25日，星期天超分子化學(xué)

另一位法國的著名科學(xué)家Lehn也在這方面作出了非凡的貢獻(xiàn)，他在研究穴醚及大環(huán)化合物與配體絡(luò)合過程中，提出了超分子化學(xué)（supermolecularchemistry）的概念，并在此理論指導(dǎo)下，合成了更為復(fù)雜的主體分子。他提出，超分子的形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價鍵的作用。當(dāng)受體與絡(luò)合離子或分子結(jié)合成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實體，即形成了“超分子”，它兼具分子識別、催化和選擇性輸出的功能。第6頁,共108頁，2024年2月25日，星期天1987年諾貝爾化學(xué)獎獲得者

由于Cram、Pederson和Lehn在合成與天然蛋白質(zhì)功能一樣的有機(jī)化合物方面取得了開拓性成果，他們獲得了1987年的諾貝爾化學(xué)獎。CramPedersonLehn第7頁,共108頁，2024年2月25日，星期天模擬酶設(shè)計的前提

在設(shè)計模擬酶之前，應(yīng)當(dāng)對酶的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)有深入的了解：①酶活性中心－底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；②酶的專一性及其與底物結(jié)合的方式與能力；③反應(yīng)的動力學(xué)及各中間物的知識。第8頁,共108頁，2024年2月25日，星期天模擬酶設(shè)計時應(yīng)考慮的因素

設(shè)計模擬酶時應(yīng)考慮如下因素：非共價鍵相互作用是生物酶柔韌性、可變性和專一性的基礎(chǔ)，故模擬酶應(yīng)為底物提供良好的微環(huán)境，便于底物、特別是反應(yīng)的過渡態(tài)中間物以離子鍵、氫鍵等結(jié)合；催化基團(tuán)必須相對于結(jié)合點盡可能同底物的反應(yīng)基團(tuán)接近，以促使反應(yīng)定向發(fā)生；模擬酶應(yīng)有足夠的水溶性，并在接近生理條件下保持其催化活性。

第9頁,共108頁，2024年2月25日，星期天二、模擬酶的分類模擬酶可分為：①

主－客體酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物和卟啉類等；②

膠束酶模型；③

肽酶；④

抗體酶；⑤

分子印跡酶；⑥

半合成酶；⑦

雜合酶；⑧

進(jìn)化酶。

第10頁,共108頁，2024年2月25日，星期天1．主－客體酶模型

環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是由多個葡萄糖以α－1,4－糖苷鍵連接而成的一類環(huán)狀低聚糖，可以含有6、7、8個葡萄糖單位。它們均是略呈錐形的圓筒，其伯羥基和仲羥基分別位于圓筒較小和較大的開口端。這樣，CD分子外側(cè)是親水的，其羥基可與多種客體形成氫鍵；其內(nèi)側(cè)是C3、C5上的氫原子和糖苷氧原子組成的空腔，這個空腔具有疏水性，能夠包接多種客體分子，類似于酶對底物的結(jié)合。在CD分子的兩面引入催化基團(tuán)，就可能具有酶的結(jié)合底物和催化反應(yīng)的作用。

（1）環(huán)糊精酶模型第11頁,共108頁，2024年2月25日，星期天環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)第12頁,共108頁，2024年2月25日，星期天A．水解酶的模擬α－胰凝乳蛋白酶是一種蛋白水解酶。它的活性部位有His的咪唑基、Asp的羧基及Ser的羥基組成電荷中繼系統(tǒng)，參與催化底物的水解反應(yīng)。Bender等在環(huán)糊精上引入這三種基團(tuán)，成功地制備出了模擬酶β－Benzyme（圖中的A），此酶催化對叔丁基苯基乙酸酯水解比天然酶快一倍以上。Rama等人將咪唑基的N直接與CD的C3相連，所得的模擬酶（圖中的B）催化對叔丁基苯基乙酸酯水解比天然酶快一個數(shù)量級。

第13頁,共108頁，2024年2月25日，星期天以環(huán)糊精為主體的模擬水解酶ABC第14頁,共108頁，2024年2月25日，星期天水解酶的模擬

Breslow在環(huán)糊精模擬酶領(lǐng)域做了大量而出色的工作，他認(rèn)為模擬酶增加催化效率的關(guān)鍵是要增加環(huán)糊精對底物過渡態(tài)的結(jié)合能力，最簡單的辦法是修飾底物來增加底物同CD的結(jié)合，從而可能增加CD對底物過渡態(tài)的結(jié)合，他們設(shè)計了一系列以二茂鐵、金剛烷為結(jié)合位點的硝基苯酯（圖中的C），以CD為催化劑可以加速這些酯水解達(dá)105－106倍。

第15頁,共108頁，2024年2月25日，星期天B．核糖核酸酶的模擬

核糖核酸酶有2個His咪唑基及1個質(zhì)子化的賴氨酸氨基處于活性中心，這2個咪唑基在催化反應(yīng)中交替起著廣義酸堿的作用。Breslow等人設(shè)計合成了兩種環(huán)糊精A和B模擬酶來催化環(huán)狀磷酸二酯的水解，A催化Ⅰ生成Ⅱ，而B催化Ⅰ生成Ⅲ。這里環(huán)糊精底物復(fù)合物的幾何形狀和催化基團(tuán)的位置對被水解鍵的選擇性起了決定性的作用。這兩種模擬酶的最適pH都在6左右，說明這兩個咪唑基也是分別以廣義酸堿參與催化的，與天然酶的催化機(jī)理一致。

第16頁,共108頁，2024年2月25日，星期天以環(huán)糊精為主體的模擬核糖核酸酶第17頁,共108頁，2024年2月25日，星期天C．轉(zhuǎn)氨酶的模擬

磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是許多涉及氨基酸反應(yīng)的輔酶，其中最重要的是轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)。吡哆醛本身也有催化此反應(yīng)的作用，但由于它本身無底物結(jié)合部位，反應(yīng)速度遠(yuǎn)不如轉(zhuǎn)氨酶催化時快。在環(huán)糊精上連接吡哆胺（A），它催化苯并咪唑基酮酸轉(zhuǎn)氨基的速度比吡哆胺單獨催化時快200倍，產(chǎn)物中D型和L型異構(gòu)體的含量不同，說明該模擬酶具有一定的立體選擇性。Tabushi等將催化基團(tuán)乙二胺引入吡哆胺基環(huán)糊精（B），使得反應(yīng)加速了2000倍以上。

第18頁,共108頁，2024年2月25日，星期天以環(huán)糊精為主體的模擬轉(zhuǎn)氨酶第19頁,共108頁，2024年2月25日，星期天D．含核糖的環(huán)糊精酶模型

Han等合成了一系列含核糖的環(huán)糊精酶模型，它兼具核酸酶、連接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的活性。核糖中的鄰二羥基對催化起著關(guān)鍵的作用。R0R1R3R12第20頁,共108頁，2024年2月25日，星期天E．橋聯(lián)環(huán)糊精酶模型

橋聯(lián)CD是近年發(fā)展起來的一類新型酶模型，它的兩個CD及橋基上的功能基構(gòu)成了具有協(xié)同包接和多重識別功能的催化活性中心，能更好地模擬酶對底物的識別和催化作用。Matsui等將乙二胺偶聯(lián)到CD上，然后與銅鹽作用形成橋聯(lián)環(huán)糊精，它催化糠偶姻氧化成糠偶酰的反應(yīng)，比沒有催化劑時大20倍。圖中A的兩個CD協(xié)同包接糠偶姻的兩個呋喃環(huán)，同時糠偶姻的烯醇負(fù)離子通過與橋基銅離子的靜電或配位作用得以穩(wěn)定，從而加速了反應(yīng)。第21頁,共108頁，2024年2月25日，星期天橋聯(lián)

CD酶模型第22頁,共108頁，2024年2月25日，星期天橋聯(lián)CD水解酶模型

Breslow近年來在橋聯(lián)CD方面做了較多工作，不僅報道了一系列橋聯(lián)CD的合成方法及其疏水結(jié)合能力，還成功地將圖中的C用于催化雙疏水基酯的水解反應(yīng)。底物被兩個CD包接后，配位于橋基的Cu2+正好處于底物的酯基附近，有利于OH－對酯基的進(jìn)攻。其催化速率比無催化劑時提高了2.2×105倍。第23頁,共108頁，2024年2月25日，星期天橋聯(lián)CD胡蘿卜素氧化酶模型

French等合成了含卟啉的橋聯(lián)CD，它可以選擇性地氧化C15=C15’鍵。他們的設(shè)計思路是：①合成的橋聯(lián)CD對底物胡蘿卜素的結(jié)合遠(yuǎn)大于對產(chǎn)物視黃醛的結(jié)合，這樣避免了產(chǎn)物抑制；②引入能催化雙鍵反應(yīng)的金屬卟啉作為活性中心。第24頁,共108頁，2024年2月25日，星期天橋聯(lián)CD胡蘿卜素氧化酶模型胡蘿卜素視黃醛第25頁,共108頁，2024年2月25日，星期天四橋聯(lián)CD酶模型

細(xì)胞色素是一類含血紅素輔基的電子傳遞蛋白質(zhì)的總稱，它們參與氧化還原反應(yīng)。Breslow等合成的四橋聯(lián)環(huán)糊精模擬P-450酶模型，是將P-450酶活性中心的金屬卟啉分子與4個環(huán)糊精分子相連，構(gòu)成了既具有底物結(jié)合部位又有催化基團(tuán)的小分子酶模型。

第26頁,共108頁，2024年2月25日，星期天四橋聯(lián)環(huán)糊精模擬P-450酶模型第27頁,共108頁，2024年2月25日，星期天底物的修飾

為了使該模擬酶催化甾體分子的羥基化，先給底物引入能與環(huán)糊精特異結(jié)合的叔丁基苯。在四橋聯(lián)環(huán)糊精模擬P-450酶模型催化下，此底物能被亞碘?；剑≒hIO）氧化，在C6位羥基化。此反應(yīng)表現(xiàn)出相當(dāng)高的立體特異性。

在C6位羥基上引入第3個叔丁基苯，這樣3個叔丁基苯與酶模型中的3個環(huán)糊精形成3點結(jié)合復(fù)合物，可以催化甾體C9位氧化成羥基。由于羥基化后的甾體可轉(zhuǎn)化成重要的藥物中間體，因此該酶模型具有很大的應(yīng)用潛力。第28頁,共108頁，2024年2月25日，星期天四橋聯(lián)CD

模擬酶催化的甾體羥基化反應(yīng)第29頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（二）合成的主－客體酶模型

除了使用天然存在的主體來構(gòu)建模擬酶外，人們還合成了冠醚、穴醚、環(huán)番、杯芳烴等大環(huán)多齒化合物來構(gòu)建酶模型。

冠醚穴醚杯芳烴

第30頁,共108頁，2024年2月25日，星期天環(huán)番和杯芳烴的結(jié)構(gòu)特點

環(huán)番（cyclophane）和杯芳烴（calixarene）是一類具有共同的結(jié)構(gòu)和功能特征的芳香主體化合物，它們通常擁有兩個或兩個以上的芳香環(huán)，通過亞甲基或醚氧鏈連接成空間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由芳香環(huán)構(gòu)成的疏水空腔具有適當(dāng)?shù)某叽?，可以與另外一些小分子通過非共價鍵結(jié)合。為了使這類芳香主體化合物在水溶液中具有一定的溶解度，一般在其外層引入一些親水性基團(tuán)。第31頁,共108頁，2024年2月25日，星期天三種不同大小的杯芳烴杯（4）芳烴杯（6）芳烴杯（8）芳烴第32頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯（6）芳烴的杯狀結(jié)構(gòu)第33頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴與C60的包合物的直接觀察

第34頁,共108頁，2024年2月25日，星期天環(huán)番結(jié)構(gòu)式第35頁,共108頁，2024年2月25日，星期天以冠醚為主體的模擬酶

日本學(xué)者Koga等采用冠醚為主體，合成了帶有巰基的仿酶模型，利用此酶可在分子內(nèi)實行“準(zhǔn)雙分子反應(yīng)”以合成多肽。此模型具有結(jié)合兩個氨基酸的能力。第36頁,共108頁，2024年2月25日，星期天以冠醚為主體的模擬酶

Lehn等人合成了一種優(yōu)異的穴狀配體24－冠－N6O2。它能利用靜電引力和氫鍵結(jié)合多聚磷酸陰離子。研究表明此模擬酶在pH2.5～8.5之間可明顯水解ATP生成ADP或AMP，在催化過程中形成磷酰胺中間體。在pH7時可加速ATP水解500倍。第37頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴作為催化劑的優(yōu)點

在第一代和第二代超分子化合物中，冠醚在溶液中通常表現(xiàn)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而不是穴狀結(jié)構(gòu)，不能為底物提供有效的結(jié)合空腔；環(huán)糊精是一類半天然產(chǎn)物，其空腔骨架過于剛性，對底物的結(jié)合能力受到一定限制。杯芳烴是完全通過實驗室合成的大環(huán)化合物，與冠醚和環(huán)糊精相比具有內(nèi)在優(yōu)勢：其疏水的空穴可通過簡單地改變單元數(shù)目而調(diào)節(jié)尺寸、構(gòu)象易變并可受到調(diào)控、邊緣可以引入功能基團(tuán)進(jìn)行修飾和衍生化。因此，杯芳烴及其衍生物已經(jīng)被成功地用作催化劑和模擬酶。第38頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴的催化活性舉例

Taniguchi和Nomura研究了杯芳烴159對苯酚與二氯甲烷的Willimson成醚反應(yīng)的催化作用，在催化劑存在的情況下，反應(yīng)24小時后轉(zhuǎn)化率為100%，而沒有催化劑時的轉(zhuǎn)化率僅有0.3%。

杯芳烴159叔丁基第39頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴159催化的Wiilimson成醚反應(yīng)第40頁,共108頁，2024年2月25日，星期天酶催化1-芐基-1,4-二氫煙酰胺的加水反應(yīng)

酶催化1-芐基-1,4-二氫煙酰胺的加水反應(yīng)如下，酶為底物提供質(zhì)子，同時以帶負(fù)電荷的基團(tuán)穩(wěn)定生成的正電荷中間體。第41頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴模擬酶

杯芳烴162下端的羧基可以為此反應(yīng)提供質(zhì)子，上端的磺酸負(fù)離子穩(wěn)定正電荷中間體，從而使第一步（限速步驟）加快而催化反應(yīng)。杯芳烴163也能加速上述反應(yīng)，但比杯芳烴162效果差，可能是因為羧酸與磺酸相比不易形成負(fù)離子，對正電荷的穩(wěn)定作用較差。

第42頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴季銨鹽164的水解酶活性

杯芳烴季銨鹽164能催化十二烷基對硝基苯酯的水解。杯芳烴季銨鹽164對乙酸酯的甲醇解在沒有金屬離子存在時反應(yīng)極慢，但加入少量Ba2+后可以使反應(yīng)加速一百萬倍以上，效率已與轉(zhuǎn)?；赶喈?dāng)。其原因是主－客體配合物中的Ba2+能穩(wěn)定親核加成時產(chǎn)生的負(fù)離子中間體。使親核加成限速步驟的反應(yīng)速率顯著提高。

第43頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴165的水解酶活性

杯芳烴165在被Ba2+活化后，在中等強(qiáng)度的堿性條件下能作為有效的?；D(zhuǎn)移催化劑，它可使對硝基苯基乙酸酯（pNPOAc）的水解速度增加10倍。

第44頁,共108頁，2024年2月25日，星期天核酸模擬酶

Reinhoudt等合成了一系列吡啶基修飾的杯[4]芳烴鋅配合物（166）和咪唑基修飾的杯[4]芳烴銅配合物（167），將它們作為核酸模擬酶。這些化合物在合適的pH下可以顯著催化RNA模型底物2-羥基丙基-對硝基苯基磷酸二酯的環(huán)化反應(yīng)，其中166使反應(yīng)加速2300倍，167使反應(yīng)加速10000倍，大于所有其他核酸模擬酶對該底物的催化活性。第45頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴166和167的結(jié)構(gòu)式第46頁,共108頁，2024年2月25日，星期天杯芳烴166和167的催化機(jī)理第47頁,共108頁，2024年2月25日，星期天2．膠束模擬酶膠束的結(jié)構(gòu)

球狀板層狀圓柱狀第48頁,共108頁，2024年2月25日，星期天模擬水解酶的膠束酶模型

在水溶液中，酶分子中有疏水的微環(huán)境，模擬酶在這種微環(huán)境中的化學(xué)反應(yīng)的特殊性質(zhì)，也是模擬酶的一個重要方面。有人利用組氨酸的衍生物十四酰組氨酸與十六烷基－三甲基溴化銨組成兩種分子的混合微膠束，來催化乙酸對硝基苯酯的水解，其速率比用組氨酸催化增加了100倍。

第49頁,共108頁，2024年2月25日，星期天氧肟酸和肟在膠束模擬酶中的作用

在膠束模擬酶中常用氧肟酸和肟代替羥基來研究氧負(fù)離子的親核反應(yīng)。它們催化乙酸對硝基苯酯水解的速度常數(shù)比在非膠束中提高近萬倍。如用氧肟酸與十六烷基三甲基溴化銨一起催化酮醇的去質(zhì)子反應(yīng)，其反應(yīng)速度提高3000～20000倍，是OH－催化的60～300倍。

肟氧肟酸第50頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（2）輔酶的膠束酶模型

將疏水性維生素B6長鏈衍生物與陽離子膠束混合，在形成的體系中加入Cu2+，可將酮酸轉(zhuǎn)化為氨基酸，有效地模擬了以維生素B6為輔酶的轉(zhuǎn)氨基作用。吡哆醛的長鏈衍生物可以使絲氨酸和吲哚合成色氨酸。第51頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（3）金屬膠束酶模型

金屬膠束是指帶疏水基團(tuán)的金屬配合物單獨或與其他表面活性劑共同形成的膠束體系。其作用是模擬金屬酶的活性中心和疏水性的微環(huán)境。這種體系目前已經(jīng)取得了引人注目的成績，特別是在模擬羧肽酶A、堿性磷酸酶、氧化酶、轉(zhuǎn)氨酶等方面取得了很大的成功。將金屬酶的簡單模型引入膠束體系，利用金屬離子的特殊作用催化水解反應(yīng)，而膠束所具有的疏水性微環(huán)境則對底物起包接作用。

第52頁,共108頁，2024年2月25日，星期天金屬膠束水解酶

Tonellato等人以α－吡啶甲酸對硝基苯酯（PNPP）為底物，研究了不同表面活性劑配體在Cu2+或Zn2+存在時催化PNPP水解的能力，發(fā)現(xiàn)Cu2+、Zn2+的存在可使PNPP的水解速度顯著增大，當(dāng)Cu2+與相應(yīng)的表面活性劑形成1:1配合物時，水解反應(yīng)速度達(dá)到最大。

第53頁,共108頁，2024年2月25日，星期天3．肽酶

肽酶（pepzyme）是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。根據(jù)化學(xué)和晶體圖像數(shù)據(jù)提供的主要活性部位氨基酸殘基的序列位置和分隔距離，將構(gòu)成酶活性部位的殘基以適當(dāng)?shù)目臻g位置和取向通過肽鍵相連，而分隔距離則用無側(cè)鏈取代的甘氨酸或半胱氨酸調(diào)節(jié)。第54頁,共108頁，2024年2月25日，星期天模擬蛋白酶的肽酶

Atassi和Manshouri設(shè)計合成的兩個29肽ChPepz和TrPepz分別模擬了α－胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解蛋白的活性分別與其模擬的酶相同。在水解2個或2個以上串聯(lián)的賴氨酸和精氨酸殘基的肽鍵時TrPepz比胰蛋白酶的活性更強(qiáng)。對于苯甲酰酪氨酸乙酯的水解，ChPepz比α－胰凝乳蛋白酶的活性稍低，而TrPepz則無活性。對于對甲苯磺酰精氨酸甲酯的水解，TrPepz比胰蛋白酶的活性稍低，而ChPepz則無活性。

第55頁,共108頁，2024年2月25日，星期天4．半合成酶

半合成酶是以天然蛋白質(zhì)或酶為母體，用化學(xué)或生物學(xué)方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，或改變其結(jié)構(gòu)從而形成一種新的“人工酶”。

Bender等首次成功地將枯草桿菌蛋白酶活性部位的絲氨酸殘基，經(jīng)苯甲基磺酰氟特異性活化后，再用巰基化合物取代，將絲氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。雖然產(chǎn)生的巰基化枯草桿菌蛋白酶對肽或酯沒有水解活性，但能水解高度活化的底物（如硝基苯酯等）。

第56頁,共108頁，2024年2月25日，星期天半合成酶

Hilvert等利用類似的方法，將枯草桿菌蛋白酶結(jié)合部位的特異性Ser轉(zhuǎn)變?yōu)槲腚装彼?，此硒化枯草桿菌蛋白酶既表現(xiàn)出轉(zhuǎn)氨酶活性，又表現(xiàn)出含硒谷胱甘肽過氧化物酶的活性。利用半合成酶的方法不但可以制造新酶，還可以獲得關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和催化活性間關(guān)系的詳細(xì)信息，為構(gòu)建高效人工酶打下基礎(chǔ)。

第57頁,共108頁，2024年2月25日，星期天三、抗體酶1．抗體酶的原理及發(fā)展簡述盡管科學(xué)家們在模擬酶方面作了大量的工作，但人工合成的模擬酶仍然與天然酶的催化效率相差很遠(yuǎn)，并且反應(yīng)類型也極為有限，多數(shù)為水解酶的模擬。由于逐漸認(rèn)識到催化過程中關(guān)鍵的一步是酶與底物過渡態(tài)中間物的緊密結(jié)合，聯(lián)想到抗原導(dǎo)致生物體內(nèi)抗體的合成以及抗原抗體的緊密結(jié)合，如果用某些人工合成的小分子底物過渡態(tài)中間物的類似物作為半抗原，誘導(dǎo)生物體合成相應(yīng)的抗體，這種抗體可能會有催化該小分子底物發(fā)生反應(yīng)的活性。并將這種生物催化劑稱為抗體酶(abzyme)。

第58頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶的特點

抗體酶技術(shù)是化學(xué)和生物學(xué)的研究成果在分子水平交叉滲透的產(chǎn)物，是抗體的極其多樣性和酶分子的巨大催化能力結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)分子設(shè)計的新方法。構(gòu)制抗體酶的目的在于拓寬酶催化的應(yīng)用范圍，產(chǎn)生能催化生物體內(nèi)不存在的反應(yīng)的酶。

第59頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶研制的歷史

1946年，LinusPauling闡明了酶催化的實質(zhì)，同時指出，穩(wěn)定的反應(yīng)過渡態(tài)類似物可以競爭性地抑制酶活性。酶之所以具有催化活力，是因為它和反應(yīng)物的過渡態(tài)（底物激態(tài)）發(fā)生特異性結(jié)合，而不是與反應(yīng)的底物基態(tài)發(fā)生特異性結(jié)合。

第60頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶研制的歷史

酶產(chǎn)生的生物局限性是酶催化高效性無法普遍化的限制因素，突破限制就能人為地控制酶的產(chǎn)生。高等動物的免疫系統(tǒng)為我們提供了可以利用的工具。1969年，Jencks提出通過免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗底物激態(tài)的抗體，該抗體具有類似酶的催化活性。這個抗體酶設(shè)想的提出，有可能為任何一個化學(xué)反應(yīng)構(gòu)制一個專一性的酶。

第61頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶研制的歷史

在抗體酶研制中主要遇到兩個問題：①底物激態(tài)瞬間存在，無法提取。根據(jù)競爭性抑制現(xiàn)象，可以通過化學(xué)方法合成底物過渡態(tài)的穩(wěn)定性類似物作為半抗原；②抗原在分子量上有一定的要求。由于抗原決定簇的多樣性，得到的抗體是多克隆的，其中真正需要的抗體酶含量小。1975年，Kohler和Milstein發(fā)明了單克隆技術(shù)，使抗體酶的獲得成為可能。

第62頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶研制的歷史

還可以將能與底物結(jié)合的無酶活性的抗體通過人工的方法引入催化基團(tuán)，使之變成有催化活性的抗體酶。目前已經(jīng)構(gòu)制了催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)、酯水解和酰胺水解反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、光誘導(dǎo)聚合和光裂解反應(yīng)、金屬螯合反應(yīng)、重排反應(yīng)的抗體酶。

第63頁,共108頁，2024年2月25日，星期天2．抗體酶的制備方法（1）穩(wěn)定過渡態(tài)法迄今為止，大多數(shù)抗體酶是通過理論設(shè)計合適的、與反應(yīng)過渡態(tài)中間物結(jié)構(gòu)類似的穩(wěn)定化合物作為半抗原，免疫動物后產(chǎn)生針對此半抗原的抗體來獲得。

第64頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶舉例

Shultz小組利用與底物扭曲構(gòu)象相似的扭曲卟啉作半抗原，制備的抗體可催化卟啉金屬螯合反應(yīng)。亞鐵螯合酶是血紅素生物合成途徑中的末端酶，可催化亞鐵離子插入到原卟啉中。N－甲基原卟啉由于內(nèi)部甲基取代而呈扭曲結(jié)構(gòu)，它是此酶的有效抑制劑，也與酶催化的卟啉金屬螯合反應(yīng)的過渡態(tài)中間物結(jié)構(gòu)類似。由于甲基卟啉的抗體可催化平面結(jié)構(gòu)原卟啉的金屬螯合反應(yīng)，這也證明了該反應(yīng)存在扭曲的過渡態(tài)中間物。

第65頁,共108頁，2024年2月25日，星期天亞鐵螯合抗體酶的誘導(dǎo)物過渡態(tài)類似物

底物

產(chǎn)物

第66頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶舉例

Napper等用一個環(huán)化的磷酸酯作為底物過渡態(tài)類似物，使動物免疫得到單克隆抗體24B11，發(fā)現(xiàn)該抗體可催化外消旋的羥基羧酸酯分子內(nèi)環(huán)化形成內(nèi)酯，使反應(yīng)加速167倍，而且首次觀察到抗體酶催化反應(yīng)的專一性。反應(yīng)產(chǎn)物中一種對映體的含量比另一種高出94%。

第67頁,共108頁，2024年2月25日，星期天磷酸內(nèi)酯抗體酶的誘導(dǎo)物第68頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（2）抗體與半抗原互補(bǔ)法

抗體與其抗原的相互作用是相當(dāng)精確的，抗體常含有與抗原結(jié)合的特異功能基團(tuán)。帶正電荷的抗原常能誘導(dǎo)出結(jié)合部位帶負(fù)電荷的抗體，反之亦然。利用這個特點，可在抗體的抗原結(jié)合部位引入特定的帶電荷基團(tuán)作為催化基團(tuán)。

第69頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶舉例

Shokat等利用抗體與半抗原之間的電荷互補(bǔ)性，用帶正電荷的半抗原（H1）制備抗體，此抗體能催化β－消除反應(yīng)。其中一株單克隆抗體43D4－3D3可加速反應(yīng)105倍。分析其反應(yīng)動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，kcat為pH依賴性的，通過滴定證明這個位于抗原結(jié)合部位的可解離基團(tuán)的pKa值為6.2，是抗原結(jié)合部位的谷氨酸γ羧基。在疏水環(huán)境中谷氨酸側(cè)鏈羧基的酸性減弱，一般以堿的形式起催化作用。

第70頁,共108頁，2024年2月25日，星期天β－消除抗體酶的誘導(dǎo)物H1第71頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（3）熵阱法

另一種設(shè)計半抗原的方法是利用抗體結(jié)合能克服反應(yīng)熵壘。抗體結(jié)合能被用來凍結(jié)轉(zhuǎn)動和翻轉(zhuǎn)自由度，這種自由度的限制是形成活化復(fù)合物所必需的。

第72頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶舉例

用抗體作為熵阱非常成功的例子是抗體催化的狄爾斯－阿德耳（Diels-Alder反應(yīng)）。Diels-Alder環(huán)加成反應(yīng)是眾多形成C－C鍵反應(yīng)中的一種，是需要經(jīng)過高度有序及熵不利的過渡態(tài)的反應(yīng)。

Hilvert等用穩(wěn)定的三環(huán)狀半抗原誘導(dǎo)的抗體可催化起始加合物的生成，然后立即排出SO2，產(chǎn)生二氫苯鄰二甲酰亞胺。

第73頁,共108頁，2024年2月25日，星期天環(huán)加成抗體酶的誘導(dǎo)物第74頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶舉例

Jackson等合成一個有椅式構(gòu)象的氧雜雙環(huán)化合物來模擬由分支酸生成預(yù)苯酸這樣一個克萊森重排反應(yīng)的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，用此雙環(huán)半抗原誘導(dǎo)的抗體催化，可使重排反應(yīng)加速104倍。

分支酸預(yù)苯酸第75頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（4）多底物類似法

很多酶的催化作用要有輔因子參與，這些輔因子包括金屬離子、血紅素、各種維生素輔酶等，因此，將輔因子引入到抗體結(jié)合部位將會大大地擴(kuò)大抗體催化的范圍。用多底物類似物對動物進(jìn)行一次免疫，可產(chǎn)生既有輔因子結(jié)合部位，又有底物結(jié)合部位的抗體。小心設(shè)計半抗原可確保輔因子和底物的正確定向。

第76頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶舉例

將三亞乙基四胺Co（三價）連接到肽底物上作為半抗原，使動物免疫后產(chǎn)生抗體。此抗體的結(jié)合部位能與肽底物、三亞乙基四胺及Zn2+結(jié)合，Zn2+的開放配位部位可將OH－傳遞到底物的待水解肽鍵的羰基碳上，促進(jìn)肽鍵水解，可加速反應(yīng)105倍。第77頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（5）抗體結(jié)合部位修飾法

通過對抗體的修飾，在抗體的抗原結(jié)合部位引入催化基團(tuán)是增加催化效率的又一途徑，引入功能基團(tuán)的方法一般有兩種，即選擇性化學(xué)修飾法和基因工程定點突變法。親和標(biāo)記是將催化基團(tuán)引入到抗體結(jié)合部位的有效方法。一般先用可裂解親和試劑與抗體作用，然后再用二硫蘇糖醇處理，在抗體的結(jié)合部位附近引入巰基，用此巰基作為錨可以很方便地引入其他化學(xué)功能基團(tuán)（如咪唑）。第78頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶舉例

吉林大學(xué)羅貴民教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組開發(fā)了一種用單克隆抗體制備含硒抗體酶的方法?？贵w可變區(qū)一般含有數(shù)個絲氨酸殘基，而絲氨酸的羥基可用苯甲磺酰氟活化，再經(jīng)硒化氫處理后，轉(zhuǎn)變成硒代半胱氨酸，而硒代半胱氨酸是谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性中心的催化基團(tuán)。他們用谷胱甘肽二硝基酚（GSH－DNP）及其甲酯、乙酯分別作為半抗原得到抗體，再用上述方法引入硒代半胱氨酸，得到的抗體酶分別為天然兔肝GPX活性的1/5、1.6倍和8.5倍。

第79頁,共108頁，2024年2月25日，星期天谷胱甘肽過氧化物抗體酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

這些結(jié)果說明，3種含硒抗體酶活性不同的主要原因與抗體活性中心的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，半抗原的結(jié)構(gòu)不同，產(chǎn)生的抗體活性部位的結(jié)構(gòu)必定不同。調(diào)節(jié)半抗原的結(jié)構(gòu)，實際上是在調(diào)整抗體活性部位的空間結(jié)構(gòu)，使其中的催化基團(tuán)處于更有利于發(fā)揮催化作用的微環(huán)境中，因而能產(chǎn)生活性高于天然酶的抗體酶。通過基因工程的方法，在抗體的結(jié)合部位引入催化氨基酸殘基，也能大大提高抗體酶的活性。

第80頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體的抗原結(jié)合部位引入催化基團(tuán)的方法第81頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（6）抗體庫法

抗體庫法即用基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段Fab，從中篩選出特異性的可變區(qū)基因。從抗體庫中可用各種抗原篩選出相應(yīng)的抗體基因。若用底物過渡態(tài)類似物作抗原，可篩選出有催化活性的抗體基因。將篩選出的克隆大量培養(yǎng)，可得到大量的抗體酶。第82頁,共108頁，2024年2月25日，星期天3．提高抗體酶催化活性的因素（1）抗體酶的結(jié)構(gòu)

1969年，Pattern等在用底物過渡態(tài)類似物膦酸硝基苯酯作為半抗原，免疫動物產(chǎn)生催化酯水解的抗體酶的研究中發(fā)現(xiàn)，在免疫過程中發(fā)生了體細(xì)胞突變，有9個堿基發(fā)生了突變。因突變引起的抗體結(jié)構(gòu)變化為半抗原創(chuàng)造了一個良好的結(jié)合區(qū)，使抗原抗體之間的親和力增加了14000倍，抗體的催化活性也因此提高了100倍。這一重要發(fā)現(xiàn)表明，選擇對抗原具有較高親和力的抗體酶，其催化活性也會提高。因此，可用更長時間免疫或直接通過誘變的方法來提高抗體酶的親和力，從而提高其催化活性。第83頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（2）半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)方式

半抗原與載體蛋白之間的臂長和偶聯(lián)方式都會影響抗體酶的活性。偶聯(lián)方式不同，所得的抗原價（半抗原密度）不同，會影響抗原的免疫原性。載體蛋白與半抗原的不同基團(tuán)偶聯(lián)產(chǎn)生的抗體酶，活性也會有顯著差異。Landry等通過載體蛋白與半抗原不同基團(tuán)的偶聯(lián)，合成了3種抗原，經(jīng)免疫動物獲得了9種單克隆抗體。研究表明，這3種抗原產(chǎn)生的抗體酶催化活力顯著不同。

第84頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（3）異源免疫

Suga等在研究催化酯水解的抗體酶時發(fā)現(xiàn)，在抗體結(jié)合區(qū)的適當(dāng)位置上存在酸性和堿性兩種氨基酸殘基，能提高其催化效率。用化學(xué)合成的方法，合成兩性離子抗原比較困難。為此，1995年，Tsumuraya設(shè)計了異源免疫的新方法：由結(jié)構(gòu)相關(guān)的不同抗原依次免疫動物，由此產(chǎn)生的抗體可能對兩個半抗原均有親和力。第85頁,共108頁，2024年2月25日，星期天異源免疫

若采用一對分別帶有正負(fù)電荷的半抗原進(jìn)行異源免疫，則可能在抗體結(jié)合區(qū)產(chǎn)生酸堿催化殘基。他們用帶正電荷的季胺鹽半抗原和帶負(fù)電荷的膦酸酰胺半抗原異源免疫產(chǎn)生的抗體酶的活性，比用單一半抗原同源免疫產(chǎn)生的抗體酶提高了100倍。

第86頁,共108頁，2024年2月25日，星期天（4）反應(yīng)免疫

反應(yīng)免疫是最近由Laner研究小組提出的新概念。它是指免疫原具有高度反應(yīng)性，在反應(yīng)過程中，抗原在抗體的結(jié)合區(qū)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而影響抗體結(jié)構(gòu)和催化特性，擴(kuò)大抗體酶的適用范圍。如膦酸二酯半抗原在免疫過程中失掉一個膦酸酯，變成單酯半抗原，由此產(chǎn)生的抗體將是針對兩個抗原交叉反應(yīng)而獲得的，與兩個抗原均有親和力。由反應(yīng)免疫所產(chǎn)生的催化抗體，就可能會催化多底物反應(yīng)，提高催化效率。

第87頁,共108頁，2024年2月25日，星期天抗體酶的特點

和人工合成的簡單模擬酶相比，抗體酶主要有以下幾方面的改進(jìn)：①所催化的反應(yīng)類型更為廣泛；②抗體酶表現(xiàn)一定程度的底物專一性；③催化效率與簡單模擬酶相比也有大大提高，但多數(shù)仍未達(dá)到天然酶的水平。

第88頁,共108頁，2024年2月25日，星期天研制抗體酶的困難

限制抗體酶研究和應(yīng)用的主要因素是反應(yīng)過渡態(tài)的確定。目前，許多反應(yīng)歷程還不清楚，從而無法設(shè)計過渡態(tài)底物的穩(wěn)定類似物，因此，對各種反應(yīng)歷程的研究成為抗體酶發(fā)展的“瓶頸”。而在反應(yīng)歷程的研究中，抗體酶方法又將在其中發(fā)揮重要作用，可以通過構(gòu)制預(yù)期的抗體酶來驗證反應(yīng)歷程，使理論上的歷程更接近實際。

第89頁,共108頁，2024年2月25日，星期天研制抗體酶的困難

抗體酶還未達(dá)到最大限度應(yīng)用的原因在于抗體酶的提取和工業(yè)化生產(chǎn)還未成熟，抗體酶催化活性較低。人們雖然注意到了酶與底物中間態(tài)的緊密結(jié)合，但對酶催化的其他重要因素仍然沒有搞得太清楚，提高抗體酶催化活性的方法還處在實驗階段。相信在對酶作用機(jī)制進(jìn)一步深入了解的基礎(chǔ)上，在抗體酶的固定化已取得成功的基礎(chǔ)上，抗體酶的研究必將有新的發(fā)展而逐漸達(dá)到天然酶的水平。

第90頁,共108頁，2024年2月25日，星期天四、分子印跡酶

分子印跡（molecularimprinting）是制備對某一種特定分子（印跡分子）具有選擇性結(jié)合能力的聚合物的過程。制備過程一般包括：①選擇好印跡分子；②選擇好單體，讓其與印跡分子互相作用，并在印跡分子周圍聚合成聚合物；③將印跡分子從聚合物中除去(采用抽提法)。這樣在聚合物中就形成了與印跡分子形狀相同的空穴，可以與印跡分子特異地結(jié)合。如果選擇的印跡分子是某種酶作用的底物，此聚合物就可能是一種印跡酶。第91頁,共108頁，2024年2月25日，星期天分子印跡原理圖印跡分子第92頁,共108頁，2024年2月25日，星期天分子印跡酶舉例

Mosbach等人分別以天冬氨酸和苯丙氨酸兩種單體的1:1混合物，及其產(chǎn)物天苯二肽為印跡分子，以甲基丙烯酸甲酯為單體，以二亞乙基甲基丙烯酸甲酯為交聯(lián)劑，聚合得到具有催化二肽合成能力的二肽合成酶的分子印跡酶。以產(chǎn)物為印跡分子得到的分子印跡酶活性較高，在反應(yīng)進(jìn)行48小時后，二肽產(chǎn)率達(dá)到了63%，而以兩種氨基酸單體的混合物為印跡分子得到的分子印跡酶產(chǎn)率較低。第93頁,共108頁，2024年2月25日，星期天過渡態(tài)類似物甲膦酸對硝基苯酯作印跡分子第94頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Wulff的分子印跡酶模型印跡分子底物引入脒基作為催化基團(tuán)催化底物水解第95頁,共108頁，2024年2月25日，星期天分子印跡用于拆分手性化合物

利用手性化合物之一作為印跡分子，制作的分子印跡可作為層析介質(zhì)，用于拆分不同構(gòu)型的分子。

（EDMA:交聯(lián)劑乙二醇二甲丙烯酸酯）聚合單體丙烯酸印跡分子L-苯丙氨酰苯胺第96頁,共108頁，2024年2月25日，星期天生物印跡酶

在水相介質(zhì)中被印跡分子誘導(dǎo)的酶或非酶蛋白會產(chǎn)生“記憶”效應(yīng)。如果將在水相中被印跡分子誘導(dǎo)而發(fā)生構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)冰凍干燥，然后將其置于非水介質(zhì)中，蛋白質(zhì)將保持被誘導(dǎo)后的構(gòu)象。如果所用印跡分子是酶的底物、競爭性抑制劑或底物的過渡態(tài)類似物，則此生物印跡蛋白可能表現(xiàn)出酶的活性。稱為生物印跡酶。生物印跡酶只能在非水介質(zhì)中催化反應(yīng)，如果將生物印跡酶放到水介質(zhì)中，則其誘導(dǎo)后的構(gòu)象不能保持，失去催化能力。第97頁,共108頁，2024年2月25日，星期天非水相生物印跡酶

水溶性脂肪酶在通常情況下是非活性的，其底物結(jié)合部位有一個“蓋子”，當(dāng)?shù)孜镏疽灾|(zhì)體形式接近酶時，蓋子打開，脂肪的一端與底物結(jié)合部位結(jié)合。為了獲得高效非水相催化的脂肪酶，Braco等將適當(dāng)?shù)膬捎H性表面活性劑與酶印跡，待表面活性劑分子與酶充分接