細胞電生理研究進展

關(guān)于細胞電生理研究進展第2頁,共45頁，2024年2月25日，星期天一電壓鉗（voltageclamp）技術(shù)第3頁,共45頁，2024年2月25日，星期天20世紀50年代，HodgkinandHuxley首次應(yīng)用電壓鉗技術(shù)對槍烏賊的標本進行膜電流的測定。

在槍烏賊大纖維內(nèi)縱向插入兩根細鉑絲，一根記錄電壓E，另一根記錄電流I。記錄膜電位E與調(diào)定電壓差值經(jīng)放大進入快速電壓-電流轉(zhuǎn)換器(FBA),加入反饋電流I,直至膜電位與調(diào)定電壓相等為止,維持膜電壓不變。當一個神經(jīng)沖動到達時，出現(xiàn)膜離子電流，為了維持膜電位不變，就必須輸入一個與膜離子電流大小相等，方向相反的補償電流,記錄下這個補償電流就是膜電流的鏡像。第4頁,共45頁，2024年2月25日，星期天?工作原理：離子流過通道所形成的離子流是形成動作電位的基礎(chǔ)。電生理實驗以電流作為刺激源，使可興奮細胞產(chǎn)生興奮，然后測定其膜電壓以確定離子通道的狀態(tài)。但在形成動作電位時所產(chǎn)生的離子流可影響膜電位，而膜電位的變化又會影響該離子的通透性的變化。因而，須人為地使膜電位在一定時間內(nèi)維持在一個固定水平。電壓鉗技術(shù)是通過插入細胞內(nèi)的一根微電極人為向胞內(nèi)補充電流，補充的電流正好等于跨膜流出的反相離子電流（大小相等方向相反）。?意義

：1）確保膜通透性發(fā)生改變時，控制膜電位始終維持在指令電位的水平（不變）；2）通過電流檢測裝置，記錄到補充入胞內(nèi)的注入電流，它相當于離子電流的反相電流。這樣可測定在不同膜電位水平的離子電流，從而了解膜通道的電導(dǎo)及功能活動。第5頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（一）電壓鉗基本原理離子通道電流:細胞膜上的電流膜電容充放電電流電壓鉗技術(shù)－－消除膜電容電流的影響電壓鉗技術(shù)的基本原理：用微電極將膜電壓鉗制到新的數(shù)值上，保持一段時間不變使膜電容完成充放電過程進入電壓鉗制的穩(wěn)態(tài)期，測得的跨膜電流可以認為來自于離子通道電流。第6頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（二）理想的電壓鉗存在問題：①沒有考慮鉗制電壓的微電極阻抗RCE（兆歐姆數(shù)量級）②若考慮微電極電阻，鉗制電壓VC就就被分壓，并且，膜電阻Rm

可以有大幅度改變，

第7頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（三）雙電極電壓鉗加記錄電極實現(xiàn)閉環(huán)電路的反饋控制A1和A2為兩個高增益的運算放大器，A1連接成電壓跟隨器，提供高輸入阻抗和低輸出阻抗；A2連接成負反饋放大器。第8頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（四）單電極電壓鉗在電壓鉗制的穩(wěn)態(tài)期，鉗制電壓VC=Vm×(Rm

＋RCE)/Rm

只有當鉗制電極的電阻RCE遠小于細胞膜電阻Rm時，Vm≈VC第9頁,共45頁，2024年2月25日，星期天二、膜片鉗實驗技術(shù)膜片鉗技術(shù)是細胞生物學(xué)研究的一個重大發(fā)明。

由德國神經(jīng)生物學(xué)家赫尼（Neher）和薩克曼（Sakmann）在1970‘s年代中期發(fā)明，1991年兩人共同榮獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。NeherSakmann第10頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（一）膜片鉗技術(shù)發(fā)展歷史

1976年德國馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到ACh激活的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。

1980年Sigworth等在記錄電極內(nèi)施加5-50cmH2O的負壓吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了記錄時的噪聲實現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。

1981年Hamill和Neher等對該技術(shù)進行了改進，引進了膜片游離技術(shù)和全細胞記錄技術(shù)，從而使該技術(shù)更趨完善，具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時間分辨率。

1983年10月，《Single-ChannelRecording》一書問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻，榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。第11頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（二）膜片鉗技術(shù)的原理同電壓鉗，用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面,使之形成10～100的密封(giga-seal)，被孤立的小膜片面積為μm量級,內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區(qū)域（膜片）與其周圍在電學(xué)上絕緣，然后對該膜片實行電壓鉗位，可測量單個離子通道開放產(chǎn)生的pA（10安培）量級的電流，這種通道開放是一種隨機過程。通過觀測單個通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系。還可把吸管吸附的膜片從細胞膜上分離出來，以膜的外側(cè)向外或膜的內(nèi)側(cè)向外等方式進行實驗研究。這種技術(shù)對小細胞的電壓鉗位、改變膜內(nèi)外溶液成分以及施加藥物都很方便。

第12頁,共45頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（一）膜片鉗技術(shù)的原理1顯微照片2單個離子通道電流3多個離子通道電流的疊加。第14頁,共45頁，2024年2月25日，星期天雙電極電壓鉗技術(shù)低電阻P2、高增益A2時，Vm≈Vc對細胞有損傷，不宜于小細胞

單電極電壓鉗技術(shù)（膜片鉗）電極電阻遠小于膜片電阻，A1高增益，A2單位增益（檢測），第15頁,共45頁，2024年2月25日，星期天運算放大器的正負輸入端子為等電位，向正輸入端子施加指令電位、經(jīng)過短路負端子可以使膜片等電位，達到電位鉗制的目的。當膜片微電極尖端與膜片之間形成10G歐（以上封接時．其間的分流電流達到最小，橫跨膜片的電流（I）可100％做為來自膜片電極的記錄電流（Ip）而被測量出來。RsealIpIIpRfR0第16頁,共45頁，2024年2月25日，星期天R0是與膜片阻抗相串聯(lián)的局部串聯(lián)電阻（或稱輸入阻抗）。R0通常為1-5M歐，如果Rseal高達10G歐，此時Ip/I=Rseal/(R0+Rseal).此時Ip可作為在I－V轉(zhuǎn)換器(點線）內(nèi)的高阻抗反饋電阻（Rf）的電壓降而被檢測出。實際上這時場效應(yīng)管運算放大器A1的輸出中包括著膜電阻成分，這部分將在第二級場效應(yīng)管運算放大器A2時被減掉。RsealIpIIpRfR0第17頁,共45頁，2024年2月25日，星期天(二)膜片鉗電極的制備1.標本制備根據(jù)研究目的的不同，可采用不同的細胞組織，如心肌細胞、平滑肌細胞、腫瘤細胞等，現(xiàn)在幾乎可對各種細胞進行膜片鉗的研究。對所采用的細胞，必須滿足實驗要求，一般多采用酶解分離法，也可采用細胞培養(yǎng)法；另外，由于與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，現(xiàn)在也運用分子克隆技術(shù)表達不同的離子通道，如利用非洲爪蟾卵母細胞表達外源性基因等。第18頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2.電極制備合格的膜片微電極是成功封接細胞膜的基本條件。要成功的封接細胞膜需要兩方面的因素保證，一是設(shè)法造成干凈的細胞膜表面，二是制成合格的電極。首先要選擇適當?shù)牟Ａ毠?，其材料可使用軟質(zhì)玻璃（蘇打玻璃、電石玻璃）或硬質(zhì)玻璃（硼硅玻璃、鋁硅玻璃、石英玻璃）。軟玻璃電極常用于作全細胞記錄，硬質(zhì)玻璃因?qū)щ娐实汀⒃肼曅《Ｓ糜陔x子單通道記錄。電極玻璃第19頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.電極在實驗前要灌注電極液，由于電極尖端較細，因此在充灌前，電極內(nèi)液要用0.2μm的濾膜進行過濾。一般電極充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)兩步。灌尖時將電極尖端浸入內(nèi)液中5s即可，由于毛細作用溶液會進入電極最尖端處，然后從電極后端用細小的聚丙烯注射管插至尖端附近將溶液充至1/4長度，用手指輕輕彈除尖端殘留的氣泡即可。灌注后的電極電阻一般為2～5MΩ，而全細胞記錄則最好在2～3MΩ。4.進行實驗，記錄和分析數(shù)據(jù)準備工作就緒后即可進行實驗操作，數(shù)據(jù)記錄和分析第20頁,共45頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗實驗技術(shù)的新發(fā)展

傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)主要優(yōu)缺點總結(jié)

第21頁,共45頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗實驗技術(shù)的新發(fā)展目前膜片鉗技術(shù)已從常規(guī)膜片鉗技術(shù)（Conventionalpatchclamptechnique）發(fā)展到全自動膜片鉗技術(shù)（Automatedpatchclamptechnique）。第22頁,共45頁，2024年2月25日，星期天傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)每次只能記錄一個細胞（或一對細胞），對實驗人員來說是一項耗時耗力的工作，它不適合在藥物開發(fā)初期和中期進行大量化合物的篩選，也不適合需要記錄大量細胞的基礎(chǔ)實驗研究。全自動膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)在很大程度上解決了這些問題，它不僅通量高，一次能記錄幾個甚至幾十個細胞，而且從找細胞、形成封接、破膜等整個實驗操作實現(xiàn)了自動化，免除了這些操作的復(fù)雜與困難。這兩個優(yōu)點使得膜片鉗技術(shù)的工作效率大大提高了！第23頁,共45頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗實驗技術(shù)的新發(fā)展1.Flip-Tip翻轉(zhuǎn)技術(shù)：

將一定密度的細胞懸液灌注在玻璃電極中，下降到電極尖端的單個細胞通過在電極外施加負壓可以與玻璃電極尖端形成穩(wěn)定的高阻封接，自動判斷封接形成是否良好并自動破膜形成全細胞模式。隨后,藥物化合物等可以被自動應(yīng)用到管內(nèi)進行全細胞模式實驗。這種方式形成的膜片鉗完全排除顯微鏡和顯微操作,從而革命性的實現(xiàn)膜片鉗技術(shù)的全自動化。它的顯著特點是仍然采用玻璃毛坯作為電極。第24頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2.SealChip技術(shù)：

完全摒棄了玻璃電極，而是采用SealChip平面電極芯片，一定密度的細胞懸液灌注在芯片上面，隨機下降到芯片上約1-2μm的孔上并在自動負壓的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的細胞膜形成全細胞記錄模式。第25頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.PopulationPatchClamp（PPC）技術(shù)：

同SealChip技術(shù)一樣，完全摒棄了玻璃電極，而是采用PatchPlate平面電極芯片。該芯片含有多個小室，每個小室中含有很多1-2μm的封接孔。在記錄時，每個小室中封接成功的細胞數(shù)目較多，獲得的記錄是這些細胞通道電流的平均值。第26頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

總而言之,全自動膜片鉗技術(shù)具有如下的優(yōu)點:效率高,是傳統(tǒng)膜片鉗效率的20～300倍;不需要專業(yè)電生理人員,簡單易用,所有的操作可以在電腦軟件控制的界面下完成,無須顯微防震系統(tǒng);大部分儀器的封接質(zhì)量在1GΩ以上;部分儀器同時適用于研究配體門控通道和電壓門控通道;主要應(yīng)用于藥物藥理和毒理測試;在藥物微量加樣設(shè)計方面表現(xiàn)優(yōu)秀;儀器主要工作方式為全細胞膜片鉗方式。缺點:儀器僅適用于懸浮細胞實驗。無疑地,隨著基因組測序的完成和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起,離子通道在未來的細胞與藥物方面研究將會變得越來越重要。與此同時,作為離子通道研究的最佳伴侶-全自動膜片鉗,由于其獨特的優(yōu)點也必定在這一領(lǐng)域大展身手。

第27頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3離子通道3.1重要的生理功能細胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)參與維持細胞正常形態(tài)細胞興奮-收縮偶聯(lián)和興奮-分泌偶聯(lián)細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)第28頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.1重要的生理功能細胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)——靜息電位的形成第29頁,共45頁，2024年2月25日，星期天細胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)——動作電位的形成第30頁,共45頁，2024年2月25日，星期天參與維持細胞正常形態(tài)第31頁,共45頁，2024年2月25日，星期天細胞興奮-收縮偶聯(lián)第32頁,共45頁，2024年2月25日，星期天細胞興奮-分泌-興奮偶聯(lián)第33頁,共45頁，2024年2月25日，星期天細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)第34頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.2離子通道——分類第35頁,共45頁，2024年2月25日，星期天在1902年，Bernstein創(chuàng)造性地將Nernst的理論應(yīng)用到生物膜上，提出了“膜學(xué)說”。他認為在靜息狀態(tài)下，細胞膜只對鉀離子具有通透性，即細胞靜息電位的鉀離子學(xué)說；而當細胞興奮的瞬間，膜的破裂使其喪失了選擇通透性，所有的離子都可以自由通過。Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世紀30—50年代做出了開創(chuàng)性研究。他們基于電壓鉗技術(shù)，提出并驗證了所謂的Hodgkin—Huxley方程，數(shù)學(xué)模擬出和真實狀況相符合的神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，由此建立了細胞動作電位的鈉離子學(xué)說。離子通道的近代觀念也由此產(chǎn)生。3.3離子通道研究理論第36頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.4離子通道研究技術(shù)微電極電壓鉗-電流鉗技術(shù)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)ErwinNeher(1944-)KennethCole(1900-1984)第37頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.平板膜片鉗技術(shù)（膜片鉗技術(shù)新趨勢的關(guān)鍵）原創(chuàng)技術(shù)專利：第38頁,共45頁，2024年2月25日，星期天表2.膜片鉗技術(shù)的歷史角色第39頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.5傳統(tǒng)膜片鉗設(shè)備的組成電學(xué)部分信號放大器數(shù)據(jù)采集卡

PC

周邊設(shè)備控制器等光學(xué)部分：熒光顯微鏡

CCD照相機監(jiān)視器激光器等

機械部分防震臺，氣壓泵或氣瓶高精密微電極操作器灌流操作器顯微鏡移動平臺或可移動載物臺輔助部分：信號屏蔽罩微電極拉制儀藥物灌流設(shè)備溫度控制器第40頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.6全自動膜片鉗設(shè)備的組成工作站平板芯片+即：德國Nanion公司Patchliner德國Nan